Silvia Vertuani, Sonia Molesini, Stefano Manfredini, Ermanno Piergentili, Federica Comanducci, Giuliano Nocentini

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1 Studio e sperimentazione Silvia Vertuani, Sonia Molesini, Stefano Manfredini, Ermanno Piergentili, Federica Comanducci, Giuliano Nocentini Colorazione ossidativa dei capelli: nuovi intermedi primari a struttura pirimidinica coloranti di tipo ossidativo, infatti, si formano in situ per accoppiamento ossidativo di una molecola, denominata intermedio o base di ossidazione, e di un secondo agente cromogeno, noto come copulante (coupler) o intermedio. L accoppiamento ossidativo dei due precursori del colore avviene con l ausilio di un agente ossidante, di solito acqua ossigenata, che, oltre a decolorare il capello, ossida la base trasformandola in un composto particolarmente reattivo in grado di legarsi al copulante in un processo di polimerizzazione che porta alla formazione di grosse molecole con elevata coniugazione di doppi legami e anelli aromatici responsabili della colorazione del capello. Queste reazioni avvengono in ambiente alcalino, con ph compreso tra 9 e 10, ottenuto mediante ammoniaca, la quale agisce aprendo lo strato esterno del capello (cuticola) e facendo così penetrare in profondità i precursori e l agente ossidante. Una volta avvenuta la reazione di accoppiamento ossidativo e ripristinata la normale permeabilità della cuticola, le grosse molecole di colorante formatesi non riescono più ad uscire e rimangono intrappolate all interno della struttura del capello: le colorazioni ad ossidazione creano una tintura permanente proprio perché, in seguito alle reazioni suddette, si legano in maniera permanente alla cheratina dei capelli1. Dal punto di vista pratico, il processo di colorazione per ossidazione prevede l applicazione diretta dei precursori (intermedio e copulante) in miscela con una soluzione acquosa di perossido di idrogeno come agente ossidante, questa miscela viene quindi lasciata fissare sulle fibre per un tempo determinato e successivamente viene rimossa me- Jean Louis David 2009 I La colorazione permanente dei capelli viene ottenuta tramite una reazione chimica che modifica, in modo definitivo, il colore dei capelli. Gli agenti coloranti coinvolti in questo processo sono molecole di piccole dimensioni, solitamente incolori, che riescono ad attraversare la cuticola esterna che riveste il capello e, in seguito ad una reazione di ossidazione, si legano tra loro formando il colorante vero e proprio 40

2 diante risciacquo, una volta che le fibre si sono colorate. I precursori del colore sono essenzialmente costituiti da derivati organici con anelli aromatici per lo più appartenenti alla serie benzenica con gruppi NH 2 e OH. Questi gruppi possono ossidarsi più o meno facilmente secondo che siano in posizione para, orto o meta. Di solito l ossidazione coinvolge molecole con i gruppi in posizione para tra loro (es. p-fenilendiamina, p-amminofenolo, p-toluendiammina) a formare dei chinoni o degli imminochinoni che si legano alla loro stessa forma ridotta e ai copulanti, che comunemente presentano i gruppi funzionali in posizione meta tra loro (m-fenilendiammina, m-amminofenolo, resorcinolo) (fig.1). La formazione del colorante e l entità della polimerizzazione dei precursori sono parte di un processo piuttosto complesso che dipende dalla reattività delle molecole utilizzate e dalle condizioni di reazione, senza contare che è quasi sempre complicato dal fatto che per ottenere le colorazioni desiderate vengono utilizzate miscele di più basi e più copulanti. Ricerca e sviluppo di nuovi intermedi primari Nel tentativo di sviluppare nuovi precursori per la colorazione permanente dei capelli è necessario tenere conto di diversi fattori. Infatti, tali molecole devono essere applicate sui capelli e a contatto con il cuoio capelluto, per cui devono rispondere a requisiti molto severi. Innanzitutto, i coloranti devono essere sicuri da un punto di vista tossicologico a livello soprattutto dermatologico e non devono provocare sensibilizzazione. Nel corso degli ultimi decenni molto si è discusso sui possibili effetti dannosi delle tinture per capelli sulla salute umana. Molti dei precursori utilizzati, infatti, rientrano nel gruppo delle ammine aromatiche, molecole sospettate (sospetto in molti casi confermato) di avere un attività cancerogena a carico dell apparato urogenitale 2. Alla fine degli anni 70 molte ammine aromatiche utilizzate per la colorazione dei capelli sono state proibite in Europa, ma molte vengono ancora utilizzate e i dati sulla loro sicurezza non sono ancora definitivi. Come ulteriore requisito i nuovi precursori per le tinture devono poter sviluppare una sufficiente intensità della colorazione nella gradazione desiderata e possibilmente tale colorazione deve essere resistente agli Fig.1- Meccanismo di accoppiamento ossidativo intermedio -copulante. Fig.2- Schema generale di sintesi d intermedi primari derivati della TAP per amminazione riduttiva. agenti esterni, quale ad esempio condizioni atmosferiche avverse, lavaggi frequenti dei capelli, messe in piega e sudorazione. Tra i diversi precursori di ossidazione comunemente utilizzati nelle tinture per capelli, il nostro gruppo di ricerca ha individuato la 2,4,5,6-tetraminopirimidina (TAP) come punto di partenza per lo sviluppo e la sintesi di nuovi intermedi primari da utilizzare nelle tinture per capelli. Tale molecola, già ampiamente utilizzata come intermedio in composizioni coloranti per capelli di tipo ossidativo, è stata scelta innanzitutto in quanto presenta un profilo di sicurezza ampiamente accettabile, come è emerso dal dossier redatto dal Comitato Scientifico per la Sicurezza dei Consumatori (CSSC), l organo della Commissione Europea incaricato di raccogliere e valutare la sicurezza dei coloranti utilizzati sull uomo 3. La TAP ed i relativi derivati sostituiti in posizione 2,4 e/o in posizione 6 sono in grado di sviluppare sui capelli colorazioni molto intense, ma con il limite di essere instabili alla luce, per cui dopo poco tempo il colore si attenua notevolmente e in certi casi cambia il riflesso. Allo scopo di ottenere colori più resistenti, mantenendo comunque invariato il profilo di tossicità della molecola di partenza, sono state sintetizzate nuove molecole sostituendo l ammina in posizione 5 della TAP con gruppi aromatici idonei. Le molecole ottenute sono state quindi accoppiate 41

3 Studio e sperimentazione con diversi copulanti classicamente impiegati nelle tinture ed applicati su ciocche di capelli per verificare la qualità e la stabilità della colorazione. Un requisito importante delle nuove molecole è costituito dalla loro solubilità in ambiente acquoso, in modo da essere facilmente incorporate nella formulazione da applicare sui capelli. Il primo approccio da noi applicato alla sostituzione del gruppo NH 2 in posizione 5 è rappresentato dall introduzione di un derivato benzenico tramite amminazione riduttiva, che consiste nel fare reagire la TAP con un derivato della benzaldeide in modo da formare un immina (A) che viene poi ridotta ad ammina secondaria (B) (fig.2). Poiché i primi risultati indicavano che i derivati imminici erano in grado di sviluppare colori più intensi delle corrispondenti ammine, la fase di riduzione è stata successivamente eliminata e si è proseguito valutando direttamente le immine. Il nostro approccio è consistito in un classico sviluppo delle relazioni struttura-attività (RSA) attraverso l uso di un efficace metodo di valutazione delle proprietà coloranti. Tab.1- Copulanti utilizzati per le tinture binarie. Tab.2- Risultati di colorazione e di stabilità del colore su ciocca 2,4-diaminophenoxyethanol sulfate TAP Alto 7,5 9 Verde Brillante Verde Oliva 1A Alto 7 9 Verde Brillante Verde Oliva 3A Alto 8 10 Verde Dorato 4A Alto 7 9 Verde Giallo Giallo Verde 5A Alto 8 10 Verde Bottiglia Giallo Verde 6A Alto 7 8,5 Verde Vivace Dorato Verde 7A Alto 7,5 9 Verde Vivace Giallo Verde 8A Alto 7,5 9 Verde Vivace Giallo Verde 9A Alto 7,5 9 Verde Vivace Giallo Verde 2,6-dihydroxyethylaminotoluene TAP Alto 6,5 8 Fuxia Intenso Giallo Arancio Rossastro 1A Alto 6,5 8 Fuxia Giallo Arancio Rossastro 3A Alto 7 8,5 Fuxia Arancio Rossastro 4A Alto 6,5 8 Fuxia Giallo Arancio Rossastro 5A Alto 7 8,5 Fuxia Arancio 6A Alto 7 9 Fuxia Dorato Rosato 7A Alto 7 8,5 Fuxia Arancio Rosso 8A Alto 7,5 9 Fuxia Giallo Rosato 9A Alto 7,5 9,5 Fuxia Giallo Rosato 2-amino-3-hydroxypyridine TAP Basso 8,5 9 Dorato Rame Dorato 1A Basso 9 10 Dorato Arancio Dorato 3A Medio 9 10 Dorato Ramato Dorato 4A Basso 8,5 9 Giallo Dorato Giallo Dorato 5A Medio 9 10 Ramato Dorato Dorato 6A Basso 8 9 Dorato Giallo Caldo Giallo Dorato 7A Basso 8 9 Dorato Giallo Caldo Dorato Giallo Caldo 8A Medio 8 9 Dorato Ramato Dorato 9A Basso 8 8,5 Dorato Ramato Dorato Ramato 42

4 A tal fine, sono stati inseriti sull anello aromatico gruppi in grado di dislocare la carica elettronica conferendo alla molecola maggiore stabilità. In particolare, si è cercato di valutare se i gruppi OH e OCH 3, che sono caratteristici dei filtri solari, possono in qualche modo influenzare la resistenza della colorazione in base alla loro posizione o al numero di sostituzioni. In seguito, gli intermedi primari ottenuti sono stati inseriti in percentuale compresa tra 0,5 e 2% in formulazioni tipiche a base di ammoniaca per la preparazione di tinture, contenenti diversi copulanti. Per semplicità sono state valutate solo miscele binarie intermedio -copulante. I copulanti utilizzati sono quelli indicati in tabella 1. L emulsione con i precursori di ossidazione è stata miscelata con un emulsione ossidante contenente perossido di idrogeno e la tintura ottenuta è stata quindi applicata su ciocche di pelo di yak per simulare il processo di colorazione. Si è scelto di utilizzare peli di yak (bue tibetano), perché pur avendo una struttura paragonabile ai capelli umani danno un risultato più riproducibile, sono normalmente meno stressati e rovinati e sono praticamente privi di pigmentazione, che potrebbe altrimenti interferire nella colorazione della fibra. Ogni tintura è stata testata in doppio in modo da ottenere due ciocche colorate di cui sono stati valutati tono e riflesso. Una delle due ciocche trattate è stata conservata al buio, mentre l altra è stata esposta alla luce per due settimane, al termine delle quali i due gruppi di fibre cheratiniche sono stati confrontati per determinare l entità del di colore. Parte sperimentale Sintesi dell immina (A) In generale tutti gli intermedi primari imminici sono stati preparati adattando procedure di letteratura 4 che prevede la reazione della 2,4,5,6-tetraamminopirimidina solfato con una aldeide aromatica, in rapporto molare compreso tra 1 e 2. La reazione viene preferibilmente condotta in una soluzione acquosa di sodio idrossido o in un mezzo acquoso alcolico basico a temperatura compresa tra 20 e 90 C. Esempio: Preparazione di 2-metossi-4-[(2,4,6-triammino-pirimidin- 5-ilimmino)-metil]-fenolo (A6). Ad 1g di 2,4,5,6-tetraamminopirimidina solfato disciolto mediante riscaldamento in 4,2 ml di una soluzione 2M di sodio idrossido, si aggiungono 0,638 g di vanillina. La miscela viene riscaldata a 40 C e mantenuta a tale temperatura per 2 ore sotto agitazione. Quindi, si raffredda a 0 C. Il precipitato formatosi è separato mediante filtrazione e lavato con 15 ml di acqua fredda, 50 ml di diclorometano e 50 ml di dietiletere. Il solido viene essiccato a temperatura ambiente. Resa: 0.96g di un prodotto marrone. Punto di fusione C. Sintesi dell ammina secondaria (B) Le ammine secondarie possono essere ottenute dalle corrispondenti 5-immino-2,4,6-2-amino-6-chloro-4-nitrophenol TAP Basso 7 7,5 Giallo Arancio Giallo Arancio 1A Basso 7,5 8 Giallo Arancio Giallo Arancio 3A Nullo 7 7 Giallo Arancio Giallo Arancio 4A Basso 7 7,5 Giallo Caldo Intenso Giallo caldo Intenso 5A Nullo 8 8 Giallo Arancio Intenso Giallo Arancio Intenso 6A Nullo 8 8 Giallo Arancio Intenso Giallo Arancio Intenso 7A Basso 8 8,5 Giallo Intenso Giallo Intenso 8A Nullo 8 8 Giallo Arancio Giallo Arancio 9A Nullo 7,5 7,5 Giallo Arancio Giallo Arancio 2-methyl-5-hydroxyethylaminophenol TAP Basso 7 8 Viola Viola 1A Basso 6,5 7 Viola Vivace Viola Vivace 3A Medio 7,5 9,5 Viola Viola 4A Basso 6,5 7,5 Viola Cupo Viola Cupo 5A Basso 8 8,5 Viola Viola 6A Basso Medio 7 8 Viola Spento Viola Spento 7A Basso Medio 7,5 8 Viola Spento Marrone Viola Spento 8A Medio 7,5 8,5 Viola Viola Vivace 9A Medio 7,5 8 Viola Viola Vivace 2-methylresorcinol TAP Alto 7 8,5 Rosso Arancio Rosso Rosato Spento 1A Alto 7,5 10 Rosso Arancio Rosato Rosato Spento 3A Alto 8 10 Rosso Rosato Rosso Rosato 4A Alto 7 9 Rosso Arancio Rosso Rosato Spento 5A Alto 8 9,5 Rosso Rosato Rosso Rosato Spento 6A Medio 7 7,5 Rosso Rosato Rosso Rosato Spento 7A Alto Medio 7,5 9 Rosso Rosato Rosso Rosato Spento 8A Alto 7,5 8,5 Rosso Rosato Rosato Spento 9A Alto 7,5 9 Rosso Rosato Rosato Spento 43

5 Studio e sperimentazione triamminopirimidine per idrogenazione catalitica, preferibilmente in solvente alcolico a temperatura ambiente utilizzando come catalizzatore Pd supportato su carbone al 10%. Esempio: Preparazione di 2,4,6 triammino- 5-(4-piridilmetilammino)-pirimidina (B2). 1.7 g di 2,4,6-triammino-5-(4-piridilmetilenammino) -pirimidina (A2), ottenuta come descritto sopra, sono stati disciolti in 500 ml di metanolo ed idrogenati a pressione atmosferica in ambiente saturato con H 2 a temperatura ambiente con 0,2 g di catalizzatore (10% Pd/C). Dopo 3 ore il catalizzatore è stato rimosso mediante filtrazione dalla miscela di reazione e il solvente evaporato fino a secchezza. Il prodotto grezzo ottenuto è stato purificato su colonna cromatografica in gel di silice (eluente: diclorometano/ metanolo 9:1). Resa 0,94 g di un prodotto arancione. Punto di fusione >250 C. Preparazione della tintura Gli intermedi primari di formula (A) o (B) e i copulanti riportati in tabella 1 sono stati inseriti in una emulsione per tintura in concentrazione non superiore al 2% in peso sul peso totale della composizione, con una rapporto 2:1 intermedio /coupler. L emulsione è stata portata a ph 10 con ammoniaca. Prima dell applicazione sulle fibre, l emulsione contenente i precursori è stata miscelata in rapporto 1:1,5 con una emulsione a base di perossido di idrogeno a 20 volumi. Colorazione delle ciocche Per ogni tintura sono state preparate due ciocche. La tintura è stata applicata, uniformemente, sulle fibre in quantità sufficiente da ricoprirle completamente. La miscela è stata lasciata in posa sulle ciocche in ambiente termostatato a 30 C per 30 minuti, al termine dei quali è stata rimossa tramite risciacquo. Infine, le ciocche sono state lavate con shampoo ed asciugate a phon. Dopo aver verificato l uniformità della colorazione per le due ciocche e aver registrato tono e riflesso per ogni miscela binaria, una ciocca è stata conservata al buio, mentre l altra è stata esposta alla luce solare durante il giorno e a lampada UV durante la notte per la durata di 2 settimane, trascorse le quali le ciocche sono state nuovamente confrontate. Tab.2- Risultati di colorazione e di stabilità del colore su ciocca 4-amino-2-hydroxytoluene TAP Alto Medio 6,5 7 Viola Cupo Grigio 1A Alto 7 8 Viola Cupo Grigio 3A Alto 7 8 Cenere Cenere 4A Alto 7 8 Grigio Viola Grigio 5A Alto 6,5 7,5 Grigio Grigio 6A Alto 7 7,5 Verde Cenere Cenere Verde 7A Basso Medio 7,5 8,5 Grigio Verde Cenere Grigio Verde Cenere 8A Alto 8 9 Grigio Verde Cenere Grigio Verde Cenere 9A Alto 7 9 Grigio Verde Cenere Grigio 4-amino-m-cresol TAP Nullo 8,5 8,5 Verde Oliva Verde Oliva 1A Basso 9 9,5 Verde Oliva Giallo Verde Oliva Giallo 3A Basso 9 9,5 Verde Dorato Verde 4A Basso 8 8,5 Giallo Dorato Verde Giallo Dorato Verde 5A Medio 9 9,5 Verde Acido Verde Acido Giallo 6A Nullo 8 8 Dorato Giallo Dorato Giallo 7A Basso 8 8,5 Dorato Giallo Dorato Giallo 8A Medio 8,5 9 Dorato Caldo Dorato 9A Basso 9 9,5 Dorato Verde Dorato Verde 5-amino-6-chloro-o-cresol TAP Basso 7 7,5 Azzurro Aviatore Azzurro Aviatore 1A Nullo 8 8,5 Azzurro Aviatore Azzurro Aviatore 3A Basso 8 9 Azzurro Aviatore Azzurro Aviatore 4A Basso 7 7,5 Azzurro Aviatore Azzurro Aviatore 5A Basso 8 8,5 Azzurro Aviatore Azzurro Aviatore 6A Basso 7 7,5 Azzurro Aviatore Azzurro Aviatore 7A Nullo 9 9 Verde azzurro Verde azzurro 8A Basso 7,5 8 Azzurro Aviatore Azzurro Aviatore 9A Basso 7,5 8,5 Azzurro Aviatore Azzurro Aviatore 6-amino-m-cresol TAP Medio 8 9 Giallo Giallo 1A Basso 9 10 Giallo Giallo 3A Medio 9 10 Giallo Giallo 4A Basso 8 8,5 Giallo Intenso Giallo Intenso 5A Medio 9 10 Giallo Limone Giallo Limone 6A Basso 8 8,5 Giallo Intenso Giallo Intenso Verde 7A Nullo 8,5 8,5 Giallo Verde Giallo Verde 8A Medio 9 10 Giallo Giallo 9A Basso 9 9 Giallo Giallo Verde 44

6 Risultati e discussione Nella tabella 2 sono riportati i risultati delle prove di tintura su ciocca e i corrispondenti dati di stabilità del colore alla luce. Dalla tabella si può osservare che a parità di copulante utilizzato la formazione dell immina in posizione 5 della TAP genera tinture con tono generalmente uguale o più alto rispetto alla molecola di riferimento, mentre il riflesso può discostarsi anche di molto dal colore dato alle cicche dalla TAP. Per quanto concerne la stabilità della colorazione non si sono notati, tranne alcune eccezioni, miglioramenti significativi rispetto al riferimento. In linea generale si può osservare che i sostituenti contenenti gruppi OH e OCH 3 determinano un leggero incremento della stabilità del colore. I risultati migliori sono stati ottenuti per gli accoppiamenti con 2-amino-6-chloro-4-nitrophenol, 6-amino-mcresol, 6-amino-o-cresol e m-aminophenol, in cui la colorazione ottenuta con gli intermedi primari sostituiti è apparsa più stabile alla luce rispetto a quella del riferimento. L intermedio 7A è quello che ha dato il risultato di stabilità migliore con la maggior parte dei copulanti utilizzati. Gli intermedi primari A2 e B2 sono risultati molto insolubili e quindi sono stati testati solamente con il 2,6-dihydroxyethylaminotoluene. Entrambi sviluppano una colorazione intensa rosa fucsia, molto instabile alla luce. Conclusioni Dai test effettuati si può osservare che tutti gli intermedi primari testati mantengono un comportamento analogo con il medesimo coupler. I composti testati, tuttavia, mostrano una stabilità alla luce maggiore o uguale a quella della TAP e in nessun caso si riscontra una riduzione di stabilità della colorazione. È, quindi, possibile ipotizzare che l inserimento nell intermedio di gruppi in grado di agire da filtro delle radiazioni UV incida solo marginalmente sulla stabilità del colore una volta applicato sul capello, in quanto, è probabile che sia il copulante il maggior responsabile dell instabilità ai raggi UV. Il ruolo del coupler nella stabilizzazione del colore necessita di ulteriori approfondimenti, così come saranno necessari studi di tossicità per valutare se le modificazioni apportare sul precursore (TAP) modificano in qualche modo il profilo di sicurezza delle molecole.i risultati di questo progetto sono stati insigniti della protezione brevettuale con brevetto concesso in data (n ). RIPRODUZIONE RISERVATA Bibliografia 1. T. Imai et al.; The Reaction of Oxidative Hair Dyes in Cuticle Layers; Journal of Cosmetic Chemists (SCCJ); 2008; 42(4): Harling M et al.; Bladder cancer among hairdressers: a meta-analysis; Occup Environ Med; 2010; 67 (5): Opinion of the SCCNFP on A53 2,4,5,6-Tetraaminopyrimidine; eu/health/archive/ph_risk/committees/sccp/ documents/out232_en.pdf 4. J.Chem. Res. Miniprint; 1992; 2: amino-o-cresol TAP Alto Medio 7 8,5 Giallo Caldo Arancio Giallo Arancio Spento 1A Alto Medio 9 10,5 Giallo Caldo Giallo Chiaro 3A Alto 8,5 10 Giallo Giallo Dorato 4A Medio 6,5 7,5 Giallo Arancio Intenso Giallo Arancio Spento 5A Alto 9 10 Giallo Caldo Giallo 6A Basso 7 7,5 Arancio Arancio 7A Basso 7,5 8 Giallo Ruggine a macchie Giallo Ruggine a macchie 8A Medio 8,5 9,5 Giallo Arancio a chiazze Giallo Chiaro a chiazze 9A Basso 7,5 8 Giallo Arancio a chiazze Giallo Arancio a chiazze m-aminophenol TAP Medio 6,5 7 Grigio Verde (Viola nelle punte) Verde Militare 1A Medio 7 8 Verde Militare Verde Oliva 3A Alto Medio 7,5 9 Verde Oliva Dorato 4A Basso 7 7 Marrone Verde Dorato Marrone Dorato 5A Medio 8 9 Cenere Verde Dorato Dorato Verde 6A Basso 7 7,5 Dorato Giallo Dorato Giallo 7A Basso 7 7,5 Dorato Giallo Freddo Dorato Giallo Freddo 8A Nullo 8,5 8,5 Dorato Verde Dorato Verde 9A Nullo 8 8 Dorato Verde Dorato Verde resorcinol TAP Medio 7 8 Ramato Ramato Dorato 1A Medio 9 9,5 Dorato Ramato Dorato 3A Alto Medio 9 10 Ramato Dorato 4A Medio 8 9 Ramato Dorato Ramato 5A Basso 9 9,5 Ramato Dorato Ramato 6A Alto Medio 8 9 Ramato Dorato 7A Nullo 9 9 Dorato Rame Dorato Rame 8A Medio 9 9,5 Ramato Dorato Ramato 9A Medio 9 10 Ramato Dorato Ramato 45