Mara Stefanelli. Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria. Roma 19 maggio 2009

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1 SORVEGLIANZA DELLE FIORITURE DI CIANOBATTERI NELLE ACQUE DI BALNEAZIONE: APPROCCIO PER L APPLICAZIONE DEL DL.vo 30 MAGGIO 2008 N.116 IN RECEPIMENTO DELLA DIRETTIVA 2006/7EC Metodi immunoenzimatici per l analisi delle cianotossine Mara Stefanelli Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Reparto Qualità degli Ambienti Acquatici e delle Acque di Balneazione Roma 19 maggio 2009

2 Oltre ad una serie di metodi fisico-chimici chimici per l identificazione e la quantificazione di cianotossine in un campione ambientale possono essere impiegati: Metodi immunoenzimatici Metodi biologici Metodi biochimici Screening di campioni ambientali Qualitativi e/o semiquantitativi A risposta rapida Non necessitano di standard analitici Non discriminano tra le varie tossine Livelli di sensibilità variabili a seconda del metodo usato

3 Metodi biologici: i i saggi in vivo Si avvalgono di animali da laboratorio Vertebrati: Mouse BioAssay, MBA Invertebrati: Artemia salina Misura di tossicità totale del campione In alcuni casi del tipo di tossina presente (in base ai sintomi o in seguito a necrosi)

4 Metodi biologici: MBA Screening di campioni incogniti (identifica la presenza di qualsiasi tossina) Relativamente t veloce e poco costoso Di facile applicazione Fornisce indicazioni di tossicità Estratto acido di omogenati di tessuto Estratto di altro campione es. acqua 60min/24h Iniezione intraperitoneale No mortalità o segni di tossicità CAMPIONE NEGATIVO (no livelli ( tossici di cianotossine)

5 Metodi biologici: MBA SVANTAGGI Bassa sensibilità Utilizzo di un discreto numero di animali: problemi etici Metodo esclusivamente qualitativo Preclude l identificazione di effetti ritardati Somministrazione poco rappresentativa della reale esposizione umana RISPOSTA: microcistine nodularine anatossina-a anatossina-a(s) cilindrospermopsina saxitossine aplysiatossina lyngbiatossina

6 Metodi biologici: Artemia salina No problemi etici Facile esecuzione 18/24h Conta individui morti/totale: % di mobilizzazione Riattivazione cisti Inizio saggio: 10 naupli in ogni pozzetto Incubazione a 25 C risultati espressi come LC50

7 Metodi biologici: Artemia salina SVANTAGGI Bassa sensibilità (LD50 = 5-10mg/L per le MC) Assenza di specificità Indicazioni di tossicità difficilmente estrapolabili ad una situazione di rischio reale per mammiferi No diversa suscettibilità di Artemia alle diverse cianotossine RISPOSTA: microcistine nodularine

8 Questi metodi sono sempre più spesso sostituiti da metodologie biochimiche e immunoenzimatiche, che risultano essere: più sensibili (0,1μg/L per MC) più veloci dei metodi chimici meno costosi in grado di determinare la presenza di tossine, indipendentemente dalla disponibilità di standard

9 Metodi Immunoenzimatici: Phosphatase h Inhibition Assay (PPi PPi) PRINCIPIO Basato sulla capacità di alcune tossine (es. microcistine e nodularine) di inibire l attività di enzimi quali le proteine (serina/treonina) fosfatasi, classificate in due gruppi: - Tipo 1: PP1 - Tipo 2: PP2 Livello di inibizione usato come misura della concentrazione di tossina

10 La quantificazione della inibizione può essere fatta con tre tecniche Metodo colorimetrico: substrato usato p-nitrofenilfosfato Test aspecifico, non discrimina tra loro i congeneri e non distingue tra MC e Nodularine; ma è comunque abbastanza sensibile (0,25-2,5 µg/l), rapido, di facile realizzazione e poco costoso Metodo fluorimetrico: substrato usato 4-metil-umbelliferilfosfato Alternativa valida del primo e almeno due volte più sensibile (0,1 µg/l) Metodo radiometrico: i substrato bt t usato sostanze marcate con32p Metodo più sensibile(0,1 µg/l), ma meno usato perché non è agevole lavorare con materiale radioattivo e data la semivita del 32P,non è possibile utilizzare scorte

11 Metodi Immunoenzimatici: Enzyme Linked Immunosorbend Assay Sviluppati all inizio ii anni i 90, prima con uso di anticorpi ipoliclonali l anti- MC-LR, poi monoclonali li contro la stessa tossina con conseguente sviluppo di kit ELISA più specifici PRINCIPIO Il metodo utilizza anticorpi policlonali, immobilizzati sulle pareti di un sistema test, che possono legare sia le microcistine che un coniugato enzima microcistine In ogni pozzetto è contenuta t unaquantità nota di anticorpi i immobilizzati, ciascun pozzetto riceve lo stesso numero di molecole coniugate di coniugato Un campione che contiene una bassa concentrazione di MCs permette all anticorpo anticorpo di legare un altro numero di molecole di coniugato Alte concentrazioni di MCs nel campione consentono ad un basso numero di molecole di coniugato di legarsi agli anticorpi i La rivelazione dei complessi si ha per via colorimetrica, con una relazione inversa che lega intensità di colore e concentrazione di MCs legate Il dosaggio si basa sulla lettura dell assorbanza (450 nm)

12 Sono disponibili sul mercato diversi kit diagnostici per la sola presenza di microcistina, ma anche per la nodularina, la cilindrospermopsina e le saxitossine - Strips, in forma di piastre da 96 pozzetti, con anticorpo adeso sul fondo - Controllo negativo - Calibratori a diverse concentrazioni (ppb) - Diluente - Coniugato - Soluzione di lavaggio - Substrato - Soluzione Stop

13 ESEMPIO: determinazione di microcistine in campioni di acqua preparazione del campione aliquota (es. 100 ml) sottoposta a congelamento/scongelamento & ultrasuoni: lisi cellulare e rilascio tossine allestimento dei pozzetti: n. 2 pozzetti per ciascun campione e n. 2 pozzetti per ciascun materiale di riferimento; diluente in ciascun pozzetto; analita standard (antigene) immobilizzato sul supporto reazione di competizione campione inserito nel pozzetto insieme ad anticorpo specifico per l analita antigene (campione) compete con l antigene immobilizzato nel legare l anticorpo; incubazione (t ambiente, 30 min); lavaggio: rimozione dei complessi antigene-anticorpo in soluzione legame del complesso marcato anticorpo-enzima inserimento nel pozzetto di un anticorpo marcato con enzima che va a legarsi all anticorpoanticorpo primario; lavaggio: rimozione dei complessi in soluzione reazione cromogenica addizionato un reagente incolore che genera una reazione colorimetrica prodotta dall enzima legato al complesso antigene-anticorpo immobilizzato sul substrato; incubazione (t ambiente, 30 min); reazione inibita mediante addizione di reagente acido dosaggio

14 Conc. MC-LR (log) La quantificazione avviene per confronto/estrapolazione con una curva standard, costruita con la MC-LR, nella quale si riportano in scala semilogaritmica le concentrazioni di MC-LR vs % della assorbanza dello standard rispetto alla assorbanza del controllo negativo (B0%) Il controllo negativo: soluzione non contenente MC-LR, il cui valore di B0% corrisponde al valore massimo (100%) di assorbanza ottenibile La curva deve essere costruita utilizzando un numero adeguati di punti: tratto lineare ampio e ben definito Per una corretta estrapolazione il dato di assorbanza del campione dovrebbe cadere nel tratto lineare della curva standard e non agli estremi, dove la risposta non è più proporzionale alla concentrazione

15 Si dividono in: test per competizione diretta (anticorpi policlonali) test per competizione indiretta (anticorpi monoclonali) L antigene viene direttamente adeso alla base solida (pozzetto) seguito da un anticorpo marcato con un enzima L antigene viene direttamente adeso alla base solida (pozzetto) seguito da un anticorpo primario non marcato e da un anticorpo secondario marcato specifico per il primario

16 RISULTATI DEI DUE METODI sono molto simili, anche se: Metodo indiretto ha una sensibilità generalmente più elevata I Kit dei metodi diretti sono meno costosi e più rapidi QUINDI: la scelta dipende dalle finalità con cui un test viene eseguito PER ENTRAMBE I CASI BISOGNA TENER PRESENTE

17 1. La preparazione p del campione bisogna: Usare solventi che non favoriscono lo sviluppo di colorazioni (concentrazioni di metanolo non > 10%) Introdurre un passaggio di parziale purificazione per rimuovere eventuali pigmenti (passando il campione su colonnina C18) Evitare interferenze con la misura di assorbanza

18 2. Le caratteristiche del Kit Affidabilità esensibilità di un test ELISA dipendonod dalla natura dell anticorpo e dalla sua cross-reattività con i vari congeneri di MC e con i suoi analoghi, inclusi i coniugati Scarsa cross-reattività dell anticorpo usato (monoclonali molto specifici), dà informazioni accurate su un congenere specifico, ma è poco utile per test di screening Il Kit dovrebbe permettere di rispondere alle esigenze dello sperimentatore di dare la giusta interpretazione dei risultati

19 La maggior parte dei Kit disponibili impiegano anticorpi sviluppati in animali contro uno specifico congenere (es. generalmente MC-LR) La reattività massima a sarà verso quella variante a e le altre MC saranno identificate con una sensibilità diversa (affinità antigeneanticorpo più bassa) La quantificazione fatta attraverso una curva standard contenente solo MC-LR non è accurata I metodi immunoenzimatici sono considerati: SEMIQUANTITATIVI

20 Molti kit ELISA riconoscono come antigene l ADDA, amminoacido specifico di MC e nodularine (buon grado di cross-reattività) Essendo però l ADDA il sito di riconoscimento per il legame, il kit è diagnostico anche per i vari prodotti di degradazione ambientale che contengono tale aa e per i coniugati prodotti dalla detossificazione delle MC stesse In un campione biologico, i kit disponibili non sono in grado di discriminare tra le molecole parentali e i coniugati che però hanno tossicità ità minore Questo è un aspetto rilevante per l interpretazione di dati in termini di valutazione tossicologica, perché l impossibilità di distinguere la tossina dai congeneri porta ad una sovrastima della concentrazione e della potenziale tossicità del campione

21 La possibilità di ottenere anticorpi monoclonali offre la possibilità di avere risposte da test ELISA con più alta sensibilità e maggiore specificità (scarsa cross-reattività) reattività) Avere anticorpi monoclonali da testare sarebbe uno strumento di lavoro ideale MA i costi elevati non sarebbero compatibili con attività di monitoraggio e/o routine

22 Nessuno dei diversi metodi singolarmente è in grado di dare indicazioni sul contenuto di tutte le tossine presenti in un campione e la sua potenziale tossicità I diversi risultati che si ottengono dipendono semplicemente dal fatto che misurano cose diverse METODI CHIMICI: molto specifici i ma non identificano ancora tuttett le tossine (sottostima della contaminazione) TEST ELISA: essendo aspecifici possono identificare la presenza di varie tossine ma reagiscono anche con prodotti con scarsa e/o assente tossicità (sovrastima dei rischi) SAGGI DI INIBIZIONE DELLA FOSFATASI: danno indicazioni sul potenziale di tossicità ma non informazioni dal punto di vista quantitativo dei congeneri presenti

23 Se possibile in un piano di monitoraggio dovrebbero essere combinati i diversi i metodi, in momenti diversi i e almeno su quei campioni risultati positivi con il metodi di primo screening scelto

24 GRAZIE PER L ATTENZIONE

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