Duplicα Real Time AEAC Chlamydia trachomatis Kit
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- Enzo Arcuri
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1 For Professional Use Only Duplicα Real Time AEAC Chlamydia trachomatis Kit REV. EBR031032_IFU_REV.00D_ENITA : EBR tests Instructions For Use INTENDED USE DUPLICα Real Time AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis Kit is a qualitative assay for the detection of two target sequences, one belonging to the gene codifying for the rrna16s and the other to the cryptic plasmid, from clinical specimens (such as urine, swab and seminal fluid). INTRODUCTION Chlamydia trachomatis is a Gram-negative bacterium that infects the columnar epithelium of the cervix, urethra, and rectum, as well as nongenital sites such as the lungs and eyes. The bacterium is the cause of the most frequently reported sexually transmitted disease in the United States, which is responsible for more than 1 million infections annually. Most persons with this infection are asymptomatic. Untreated infection can result in serious complications such as pelvic inflammatory disease, infertility, and ectopic pregnancy in women, and epididymitis and orchitis in men. Men and women can experience Chlamydia-induced reactive arthritis. Treatment of uncomplicated cases should include azithromycin or doxycycline. Screening is recommended in all women younger than 25 years, in all pregnant women, and in women who are at increased risk of infection. Screening is not currently recommended in men. In neonates and infants, the bacterium can cause conjunctivitis and pneumonia. Adults may also experience conjunctivitis caused by Chlamydia. Trachoma is a recurrent ocular infection caused by Chlamydia and is endemic in the developing world. PRINCIPLE OF THE TEST DUPLICα Real Time AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis Kit is designed to identify the Chlamydia trachomatis rrna16s gene and the cryptic plasmid DNA from clinical specimens (such as urine, swab and seminal fluid). Four reaction mixes are provided for the amplification: -AMPLIFICATION MIX: with Hot Start Taq DNA polymerase, nucleotides, MgCl 2 and buffer. -OLIGO MIX: with primers and fluorogenic probes to amplify the Chlamydia trachomatis s16 gene and extraction-amplification control (human β-globin gene) -CONTROL OF AMPLIFICATION: to check the successful of amplification reaction. -REACTION BLANK: to verify the absence of contamination The Advanced Real Time PCR, patented by EuroClone, exploits the features of a classic PCR reaction as well as the features of a standard Real Time PCR. Briefly, nucleic acid amplification occurs through two phases: in the first phase target nucleic acids are preamplified by PCR reaction, whereas in the second phase are further amplified and detected by a Real Time PCR reaction. From the analytical point of view the use of this technology allows a sharp decrease of the threshold cycle (C T ) leading to an increase of the system sensitivity as well as the data reproducibility. This features is extremely useful in case of clinical samples that for several reasons (e.g. the nature of the specimens or of the target or the efficiency of the purification system) have a low amount of target DNA and/or an high amount of interfering substances. DUPLICα Real Time AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis Kit is based on specific recognition and amplification of target sequences by PCR, and the simultaneous detection of the accumulation of PCR amplification products. The probe designed to detect the target carries the fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) at the 5 end, while the probe detecting the internal control (IC), is labelled with the fluorophore HEX (hexa-chloro-fluorescein). Both the probes have a non fluorescent quencher at the 3 end. If excited, the whole probe doesn t emit fluorescence, since the proximity of the quencher to the reporter prevents the emission of the fluorescence from the reporter (quenching effect). REAGENTS PROVIDED Each kit contains enough reagents to perform 32 tests when used in 4 analytical sessions with 6 samples, 1 Positive Control of Amplification (Control 1, C1), and 1 Reaction Blank (BM) each. 1/8
2 Kit Components Reagent * protect the tube from direct light Color Code STORAGE AND HANDLING All reagents must be stored at C and can be used until the expiry date printed on the labels. Do not freeze and thaw the products more than six times. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Storage (range, C) - Extraction kit for DNA purification (refer to the specific handbook s section) - Optical tubes (also Smart Tubes for SmartCycler Real Time PCR platform) - Disposable powder-free gloves and laboratory coat - Variable volumes pipettes (5-20 µl, µl and µl) - Disposable RNase/DNase-free tips with aerosol barriers - Tube racks - Desktop centrifuge - PCR box - Refrigerator - Deep-freezer - Thermalcycler for Real Time PCR Volume The kit has been optimized to be used on SmartCycler (Cepheid) and CFX /DX (Bio-Rad) thermalcyclers. Other makes and models should be fully tested and evaluated for optimal performance by the user before reporting results. The equipments should be regularly maintained, in accordance with the manufacturer s instructions, and calibrated to ensure an optimal performance. (µl) Quantity (tubes) Oligo Mix (OM)* Green Cap Amplification Mix (AM) Blue Cap Control 1 (C1, Positive C.) Red Cap >50 1 Reaction Blank (BM) White Cap >50 1 PRECAUTIONS AND WARNINGS - In compliance with Good Laboratory Practice, define three separate laboratory s areas for: DNA extraction, PCR reaction mix preparation; manipulation of controls provided with the kit. Each area must have dedicated pipettes and laminar flow hood - If required, Euroclone Diagnostica offers the necessary technical support for the correct use of the kit. - Carefully read this Instruction for Use before using the kit - Do not use the reagents after the expiry date - Thaw and carefully mix the reagents of the kit before use - Do not mix the reagents from different lots of the product - Use calibrated and regularly checked pipettes and instrumentation only - Use dedicated laboratory equipments. Change gloves frequently - Periodically wipe the working area with 0,5% hypochlorite - Use powder-free gloves. Do not leave fingerprints on tubes and on optical part of Smart Tubes. - Materials containing or potentially-containing infectious agents must always be manipulated in a separated microbiological safety room under a Biohazard biological hood - In case of damaged package, contact the technical support before using the kit - Do not use the product when stored at temperatures other than those indicated on the labels or described in this Instructions For Use - In case of spillage of the kit contents, please refer to the specific Material Safety Data Sheet (MSDS, available on request) - The kit reagents, individual protective equipments, used materials, biological samples and test residuals must be disposed in accordance with local regulations - Patient Drug treatment may interfere with the final result of the molecular biology analysis OPERATING PROCEDURE a1) DNA extraction for clinical specimens The kit has been validated using the following biological specimens: swabs, urine and seminal fluid. The specimens should be immediately tested or at least within 24 hours if stored at C. Alternatively, the specimens should be frozen immediately upon receipt and stored up to 10 days at C. A single freeze/thaw cycle should not affect the results. Urine: For extraction from urine is recommended to: Collect ml of the first morning urine into a clean, sealed container with no preservative; centrifuge at 800 Xg between C for 5 minutes; verify the presence of pellet; re-suspend the pellet in 500 µl of PBS or physiological solution. For DNA extraction EuroClone Diagnostica recommends to use: - Duplic NA Body Fluid kit (ref. EDI004200; plasma protocol) with Duplic PREP Automatic Extractor (ref. EDI001). - Qiagen EZ1 DNA Tissue Kit (48) (ref ). Other bacterial extraction reagents and methods should be fully tested and evaluated for optimal performance by the user before reporting results. 2/8
3 b) Thermalcycler Setup Important points before starting: Refer to the specific handbook of the equipment used to set the thermal profile indicated in the Thermal Profile Table. We recommend to switch on the instrument and to set the thermal profile before preparing the reaction mix. N.B.: before starting the run is recommended to save the file as "Chlamydia trachomatis Test ; this way it is possible to save the Thermal Profile and settings and recall them in subsequent runs. SmartCycler platform - Open the SmartCycler software and click Define Protocols. - Click New Protocol (bottom left). - Enter Name Chlamydia trachomatis Test. - Enter the parameters for the Chlamydia trachomatis Test outlined in Table below - When ready click Save Protocol. Refer to the specific handbook of the equipment used to set the thermal profile indicated in the Thermal Profile Table. We recommend to switch on the instrument and to set the thermal profile before preparing the reaction mix. DX /CFX platform Select Create a new Experiment In the Protocol section select Create New to set the thermal profile In Plate Editor: set FAM and as Fluorophores and define the sample name. Thermal Profile Table (common for both platforms): TIME TEMPERATURE CYCLES 5 min 95 C 1 15 sec 95 C 60 sec 68 C sec 95 C 60 sec 54 C 50 Fluorescence Acquisition c) Preparation of PCR mix The total reaction volume is 25 µl. For each experiment prepare a PCR mix for the positive control (C1), the Reaction Blank (BM) and n+1 samples. The reagents of the PCR mix have to be mixed as indicated in the table below: REAGENT VOLUME (µl) Amplification mix 10 Oligo mix 10 Extracted DNA 5 The PCR mix has to be freshly prepared every time. After its preparation, aliquot 20 μl of Master Mix in the tubes or in the microplates well for PCR then add in each tube/well 5 μl from the extracted DNA or Control 1 DNA, place in order the tubes/microplate in the instrument and start the program of amplification. At the end of the program remove the tubes/microplate from the thermalcycler. d) ANALYSIS and INTERPRETATION of the RESULTS Important points before starting: For a detailed description on how to analyze data, refer to System User s manuals. Always visually inspect the amplification plot for each sample tested versus C T values obtained with the software. Results interpretation Refer to the instrument-specific user guide to visualize the amplification plots for the entire plate/rotor. Detailed analysis of raw data depends on the real-time PCR instrument used. Baseline noise levels should either be set automatically or at predefined cycles. The fluorescence in each channel indicates the hybridisation of the target specific probes: - Channel 1 for FAM = Target probe - Channel 2 for HEX = β-globin endogenus gene probe. - If a sample shows a fluorescence in FAM (C T>0), the sample is surely positive and the signal detected by HEX fluorophore (C T 0) is not relevant. - When no signal at fluorophore FAM (C T=0) is detected, to confirm the negative result, the completed amplification of internal control and therefore the appearance of a fluorescent signal at HEX (C T>0) fluorophore level, must be verified. Only in this case we can state that the sample is definitely negative. - Condition in which no signal is detected indicates PCR inhibition. The sample must to be repeated and a dilution 1:10 of the target DNA is suggested. Please be aware that: - The Blank is positive in the HEX channel, but negative in the FAM channel. - The Positive Control is positive in both the FAM and the HEX channels. The HEX signal, due to competition with FAM probe, may arise later or be absent. In this case the HEX signal is not relevant and the run is valid. If all these conditions have been met, the run is valid and it s possible to analyse the data; otherwise the run is not valid. It s responsibility of the user to validate the run. 3/8
4 Results Interpretation Table FAM HEX Results C T> 0 Not relevant (C T 0) POSITIVE C T= 0 C T> 0 NEGATIVE C T= 0 C T= 0 INHIBITION PERFORMANCE For further details on technical data, please refer to EBR031032_TDS_REV.01D_ENITA document provided with this kit. TROUBLESHOOTING Problem 1: Weak or no signal of Positive Control, C1. 1. The PCR conditions didn t comply with the instructions. All sample results are IVALID: - Check the amplification protocol and select the fluorescence channel reported in the manual. 2. Deterioration of dyes and/or primers. The reagents storage conditions didn t comply with the instructions: - Check storage conditions. Problem 2: Weak or no signal of the Internal Control, C2 in unknown samples AND Reaction Blank BM. 1. The PCR was inhibited: - Make sure to use a recommended DNA purification method and carefully follow the manufacturer s instructions. 2. Pipetting error due to omitted reagents or samples: - Repeat the analysis starting from the PCR. 3. Deterioration of dyes and/or primers. The reagents storage conditions didn t comply with the instructions: - Check storage conditions. 4. Very low starting amount and/or low purity of genomic DNA. Improper DNA extraction: - Repeat the DNA purification. 5. Wrong channel/filter was chosen. The PCR conditions didn t comply with the instructions: - Check the PCR conditions and select the fluorescence channels reported in the protocol for the Unknown Sample detection. Problem 3: FAM signal in Reaction Blank BM. 1. Contamination during PCR preparation procedure. All samples results are INVALID: - Decontaminate the working area and all instruments. - Pipette the controls C1 and C2 at last. - Repeat the PCR preparation using a new set of reagents. Problem 4: No FAM and HEX signals in unknown sample. 1. The PCR was inhibited: - Make sure to use a recommended DNA purification method and carefully follow the manufacturer s instructions. Problem 5: Wide Fluctuations in fluorescence values. 1. The PCR Master Mix is not well prepared: - Carefully repeat the PCR preparation procedure. 2. Air bubbles trapped in the PCR tubes: - Check the presence of air bubbles before starting a new run. Problem 6: Absence of any fluorescent signal. 1. Verify the performance of the thermal cycler: - Calibrate the equipment. 2. Deterioration of dyes and/or primers. The storage conditions didn t comply with the instructions: - Check storage conditions. - Check the expiry date of the kit. Problem 7: The thermal cycler gives an error message. 1. Refer to the real-time PCR instrument user manual or contact the local technical support of the real-time PCR instrument company. Problem 8: The kit reagents left out of the storage range temperature. 1. These reagents must be stored as indicated for a proper execution of the test. The performance of the product is not guaranteed if the reagents have not been properly stored. THE PURCHASE OF THIS PRODUCT GRANTS THE PURCHASER RIGHTS UNDER CERTAIN ROCHE PATENTS TO USE IT SOLELY FOR PROVIDING HUMAN IN VITRO DIAGNOSTIC SERVICES. NO GENERAL PATENT OR OTHER LICENSE OF ANY KIND OTHER THAN THIS SPECIFIC RIGHT OF USE FROM PURCHASE IS GRANTED HEREBY 4/8
5 Ad Esclusivo Uso Professionale Duplicα Real Time AEAC Chlamydia trachomatis Kit REV. EBR031032_IFU_REV.00D_ENITA :EBR test Istruzioni Per l Uso FINALITA D USO Il Duplicα Real Time AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis Kit è un test qualitativo per l identificazione di due target genici, uno appartenete al gene codificante l rrna16s, l altro per il plasmide criptico di Chlamydia trachomatis, in campioni biologici (quali urina, tamponi e liquido seminale). INTRODUZIONE Chlamydia trachomatis è un batterio Gram-negativo che infetta l'epitelio colonnare della cervice, dell uretra e del retto, così come i siti non genitali di polmoni e occhi. Il batterio è la causa della malattia a trasmissione sessuale più frequente degli Stati Uniti, responsabile di più di un 1 milione di infezioni all'anno. La maggior parte delle infezioni nelle persone è a carattere asintomatico. L infezione non trattata può portare a gravi complicazioni come, nelle donne, a malattia infiammatoria pelvica, infertilità, gravidanza ectopica e, negli uomini, a epididimite e orchite. Uomini e donne possono sperimentare anche l artrite reattiva indotta da Chlamydia. Il trattamento clinico dei casi senza complicanze dovrebbe includere azitromicina o doxiciclina. Lo screening è da raccomandarsi a tutte le donne di età inferiore ai 25 anni, a quelle in stato di gravidanza, e a quelle che si espongono ad un aumentato rischio di infezione. Lo screening non è attualmente raccomandato per gli uomini. Nei neonati e nei bambini, il batterio può causare congiuntivite e polmonite. Anche gli adulti possono sperimentare congiuntivite causata da Chlamydia. Il Tracoma è un'infezione oculare ricorrente causata da Chlamydia ed è attualmente endemica nel mondo in via di sviluppo. PRINCIPIO DEL TEST Il Duplicα Real Time AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis Kit è un test molecolare basato sul riconoscimento del DNA di Chlamydia trachomatis. Il Kit è stato disegnato per amplificare due target genici, uno appartenete al gene codificante l rrna16s, l altro per il plasmide criptico di Chlamydia trachomatis. I reagenti per la reazione di amplificazione sono pronti all uso e suddivisi in quattro mix di reazione: - AMPLIFICATION MIX: contenente Hot Start Taq DNA polimerasi, nucleotidi, MgCl 2 e buffer. - OLIGO MIX: contenente i primers e le sonde fluorogeniche per l amplificazione del DNA target e quello del controllo di estrazione-amplificazione (gene umano β-globina) - CONTROLLO DI AMPLIFICAZIONE:permette di verificare l avvenuta reazione di amplificazione. - BIANCO DI REAZIONE: per verificare l assenza di contaminazione La nuova tecnologia Advanced Real Time PCR brevettata da EuroClone Diagnostica sfrutta le caratteristiche di una classica reazione di PCR e quelle della standard Real Time PCR. Brevemente l amplificazione degli acidi nucleici avviene attraverso due fasi: nella prima fase vengono pre-arricchiti gli acidi nucleici bersaglio attraverso una PCR, mentre nella seconda i target vengono amplificati ulteriormente e poi rilevati grazie ad una Real Time PCR. Da un punto di vista analitico, l applicazione di questa tecnologia si traduce in una netta diminuzione del ciclo soglia (C T) e quindi accresce la sensibilità del sistema così come la riproducibilità dei dati. Questa caratteristica risulta estremamente vantaggiosa per quei campioni clinici che per vari motivi (quali ad esempio la natura stessa del campione o del target o l efficienza del sistema estrattivo) sono caratterizzati da una scarsa quantità di DNA target nel campione di partenza e/o da elevata quantità di sostanze interferenti. Il Duplicα Real Time AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis Kit è basato sul riconoscimento specifico e amplificazione di sequenze target di PCR e sulla rilevazione simultanea dei prodotti di PCR tramite sonde fluorescenti. Vengono usate due sonde marcate con un differente fluoroforo per ogni sequenza investigata; in particolare la sonda per il target specifico porta all estremità 5 il fluoroforo FAM (6-carbossi-fluoresceina) mentre l altra sonda, che va a rilevare il controllo interno, ha legato il fluoroforo HEX (esa-clorofluoresceina). Entrambe le sonde hanno all estremità 3 un quencher non fluorescente. In seguito ad eccitazione, la sonda integra non emette fluorescenza, in quanto la vicinanza del quencher al reporter impedisce a quest ultimo l emissione della fluorescenza (effetto di quenching). COMPOSIZIONE DEL KIT Questo kit è stato realizzato per poter eseguire 32 reazioni se utilizzato in 4 sessioni analitiche con 6 campioni, 1 Controllo Positivo (Controllo 1, C1), e 1 Bianco di Reazione (BM) ciascuna. 5/8
6 Componenti del kit Reagenti Codice Colore Conservazione (range, C) Volume (µl) Quantità (tubi) Oligo Mix (OM)* Tappo Verde Amplification Mix (AM) Tappo Blu Controllo 1 (C1, C. Positivo) Tappo Rosso >50 1 Bianco di Reazione (BM) Tappo Bianco >50 1 *la provetta deve essere conservata lontano dalla luce CONSERVAZIONE E STABILITÀ Tutti i reagenti devono essere conservati a C fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. Non scongelare e ricongelare il prodotto più di sei volte. MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO - Kit di estrazione per la purificazione del DNA (fare riferimento alla sezione specifica del relativo manuale d uso) - Tubi ottici (anche Tubi Smart per piattaforma SmartCycler Real Time PCR) - Guanti senza talco e camice da laboratorio monouso - Micropipette (5-20 µl, µl e µl) - Puntali con filtro RNasi/Dnasi-free - Porta provette - Centrifuga da tavolo - PCR box - Refrigeratore - Congelatore - Termociclatore per Real Time PCR Il kit è stato ottimizzato per le piattaforme SmartCycler (Cepheid) e CFX /DX (Bio-Rad). Altre marche e modelli devono essere pienamente testati e valutati per prestazioni ottimali da parte dell'utente prima di refertare i risultati. La strumentazione deve essere manutenuta regolarmente, in accordo con le istruzioni del produttore, e calibrato in modo da assicurare prestazioni ottimali. PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI - È buona pratica suddividere il laboratorio in tre aree distinte: estrazione del DNA, preparazione della miscela di PCR, e manipolazione dei controlli forniti con il kit. Ogni area deve essere completa di cappa a flusso laminare e di un set di pipette dedicato - Euroclone Diagnostica offre se richiesto ai suoi clienti il supporto tecnico necessario per il corretto utilizzo del kit - Leggere attentamente questo manuale di Istruzioni Per l Uso prima di utilizzare il kit - Non utilizzare reagenti dopo la data di scadenza - Scongelare e miscelare attentamente i reagenti prima dell utilizzo - Non mescolare reagenti provenienti da lotti diversi del prodotto - Usare pipette e strumentazione tarata e controllata regolarmente - Usare attrezzatura di laboratorio dedicata e cambiare spesso i guanti - Pulire regolarmente l area di lavoro con ipoclorito al 0,5% - Utilizzare i guanti senza talco e evitare di lasciare impronte sui tubi o sulle sezioni ottiche dei Tubi Smart - I materiali contenenti o sospettati di contenere agenti infettivi devono essere sempre manipolati all interno di una stanza a sicurezza microbiologica e sotto una cappa biologica Biohazard - In caso di imballo danneggiato del kit, prima dell utilizzo contattare l assistenza tecnica - Non utilizzare il prodotto se conservato in condizioni ambientali diverse da quelle riportate in etichetta e descritte nella specifica sezione di questo manuale di Istruzioni Per l Uso - In caso di sversamento del contenuto del kit riferirsi alla Scheda di Sicurezza specifica del prodotto (Material Safety Data Sheet, MSDS; disponibile su richiesta) - I reagenti del kit, le misure di protezione individuali, i materiali utilizzati, e i residui dei campioni biologici e del test vanno smaltiti in conformità con le norme in vigore nel Paese di utilizzo - Il trattamento farmacologico potrebbe interferire con il risultato finale PROTOCOLLO OPERATIVO a) Estrazione del DNA Batterico da campioni clinici La validazione del kit è stata effettuata utilizzando i seguenti campioni biologici: tamponi, urine e liquido seminale. I campioni devono essere testati immediatamente o entro le 24 ore se mantenuti a C. Alternativamente, il campione può essere immediatamente congelato al momento del ricevimento e mantenuto fino a 10 giorni a C Uno singolo ciclo di scongelamento non influisce sul risultato. Urine: Per l estrazione dell urina si consiglia di: raccogliere ml della prima urina del mattino in un contenitore pulito, chiuso e senza alcun conservante; centrifugare a 800 Xg a C per 5 minuti; verificare la presenza di pellet; rispospendere il pellet in 500 µl di PBS o fisiologica. Per la purificazione del DNA genomico EuroClone Diagnostica raccomanda di utilizzare: - Duplic NA Body Fluid DNA kit (ref. EDI004200) per estrattore automatico Duplic PREP Automatic Extractor (ref. EDI001) - Qiagen EZ1 DNA Tissue Kit (48) (ref ). Altri reagenti e metodi di estrazione devono essere pienamente testati e valutati per prestazioni ottimali da parte dell utente prima di refertare i risultati. c) Programmazione del termociclatore Importante prima dell allestimento della corsa: Riferirsi al Manuale Utente per istruzioni dettagliate sul funzionamento del sistema e per inserire il profilo termico riportato nella tabella: Profilo Termico. Si consiglia di accendere lo strumento e di impostare il profilo termico prima di preparare la miscela di reazione. 6/8
7 NB: prima di iniziare la corsa si consiglia di salvare il file come " Chlamydia trachomatis Test" in questo modo è possibile salvare il profilo termico con le relative impostazioni e di richiamarle in esecuzioni successive. Piattaforma SmartCycler - Aprire il software SmartCycler e fare clic su "Define Protocols". - Fare clic su (in basso a sinistra) "New Protocol". - Inserire "Chlamydia trachomatis Test ". - Inserire I parametric per "Chlamydia trachomatis Test" riporatati nella tabella qui sotto - Concludere la procedura cliccando su "Save Protocol". Piattaforma DX /CFX Selezionare Create a new Experiment Nella sezione Protocol impostare il profilo termico in Create New come indicato in tabella Selezionare i campioni e impostare i fluorofori FAM e HEX nel menu Plate Editor. Tabella: Profilo Termico (comune per le piattaforme) TEMPO TEMPERATURA CICLI 5 min 95 C 1 15 sec 95 C 60 sec 68 C sec 95 C 60 sec 54 C 50 Acquisizione Fluorescenza d) Preparazione della PCR mix Il volume totale della reazione è di 25 µl. Per ogni esperimento preparare una mix di PCR per il controllo positivo (C1), il Bianco di Reazione (BM) e n+1 campioni. La mix deve essere preparata miscelando i reagenti come indicato in tabella: REAGENTI VOLUME (µl) Amplification mix 10 Oligo mix 10 DNA Estratto 5 Non conservare la mix di PCR ma prepararla fresca ogni volta Terminata la preparazione della mix, aliquotare 20 µl della Master Mix nelle provette o nei pozzetti della micropiastra per PCR e aggiungere in ogni provetta/pozzetto 5 µl di DNA estratto o Controllo Positivo; disporre le provette o la piastra all interno dello strumento e avviare il programma di amplificazione precedentemente impostato. Al termine del protocollo di amplificazione, rimuovere le provette o la piastra dal termociclatore. d) ANALISI ed INTERPRETAZIONE dei RISULTATI Importante prima dell analisi della corsa: Per una descrizione dettagliata su come analizzare i dati, riferirsi al Manuale Utente. Valutare sempre visivamente, per ciascun campione testato, le curve di amplificazione rispetto ai valori di C T ottenuti con il software d analisi. Interpretazione dei Risultati Fare riferimento al manuale d uso specifico per la piattaforma in uso per visualizzare le curve di amplificazione di tutti i campioni in analisi. L analisi dettagliata dei dati grezzi dipende dallo strumento utilizzato. La linea di base del rumore di fondo del segnale fluorescente può essere settata sia in automatico sia a un numero di cicli predefinito. La fluorescenza di ogni canale indica l ibridazione di una sonda specifica per un target: - Canale 1 per FAM= sonda associata al Target - Canale 2 per HEX = sonda associata al gene endogeno della β-globina. - Quando si registra un segnale a livello del fluoroforo FAM (C T>0), il campione è sicuramente positivo, ed il segnale rilevato dal fluoroforo HEX (C T 0) non è rilevante. - Quando non si registra segnale a livello di Fluoroforo FAM (C T=0), per confermare la negatività del risultato, si deve verificare la corretta amplificazione del controllo interno e quindi la comparsa di un segnale di fluorescenza a livello del Fluoroforo HEX (C T>0). Solo in questo caso si può refertare il campione come negativo. - Se nessun segnale viene rilevato, la PCR è stata inibita. Il campione deve essere ripetuto, si suggerisce di effettuare una diluizione 1:10 del DNA target. E importante verificare che: - Il Bianco deve essere positivo nel canale HEX e negativo nel canale FAM. - Il Controllo Positivo deve essere positivo sia nel canale FAM che nel canale HEX. Il segnale HEX può uscire tardivamente o non uscire affatto per competizione. Solo in questo caso la presenza del segnale HEX non è rilevante e la corsa comunque valida. Se si verificano tutte queste condizioni la corsa é valida ed é possibile analizzare i dati, altrimenti la corsa non é valida. É responsabilità dell operatore validare la corsa controllando che queste condizioni si siano verificate. Tabella di Interpretazione dei Risultati FAM HEX Risultato C T> 0 Non rilevante (C T 0) POSITIVO C T= 0 C T> 0 NEGATIVO C T= 0 C T= 0 INIBIZIONE 7/8
8 PRESTAZIONI Per ulteriori dettagli su dati tecnici, fare riferimento al documento EBR031032_TDS_REV.01D_ENITA fornito con il kit TROUBLESHOOTING Problema 1: Segnale debole o assente nel controllo nel Controllo Positivo, C1. 1. Le condizioni di PCR non rispecchiano le istruzioni riportate: - Verificare il protocollo di amplificazione e selezionare il canale di fluorescenza riportato nel manuale. 2. Deterioramento dei fluorofori/primers. Le condizioni di stoccaggio dei reagenti non sono conformi alle istruzioni riportate nel manuale d uso. Problema 2: Segnale debole o assente nel Controllo Interno, C2 in campioni ignoti E nel bianco di Reazione, BM. 1. La PCR è stata inibita: - Assicurarsi di utilizzare un metodo di estrazione di DNA validato e seguire attentamente le istruzioni riportate nel manuale d uso del produttore. 2. Errore nel pipettaggio per omissione di un reagente o del campione: - Ripetere l'analisi partendo dalla PCR. 3. Deterioramento dei fluorofori/primers. Le condizioni di stoccaggio non sono conformi alle istruzioni riportate nel manuale d uso: - Verificare le condizioni di conservazione del kit. 4. Quantità di DNA insufficiente e/o di bassa purezza. Estrazione di DNA inefficiente: - Ripetere l'estrazione del DNA. 5. Selezione del canale/filtro sbagliato. Le condizioni di preparazione di PCR non sono conformi alle istruzioni riportate nel manuale d uso: - Verificare le condizioni di PCR e selezionare i canali di fluorescenza riportati nel protocollo per la rilevazione del campione ignoto. Problema 3: Presenza di segnale FAM nel Bianco di Reazione BM. 1. Contaminazione durante la procedura di estrazione del DNA. Tutti i risultati sono da considerarsi INVALIDI: - Decontaminare il piano di lavoro e tutti gli strumenti. - Manipolare i controlli C1 e C2 solo alla fine. - Ripetere la PCR utilizzando un nuovo set di reagenti. Problema 4: Nessun segnale di FAM e HEX in campioni ignoti 1. La PCR è stata inibita: - Assicurarsi di utilizzare un metodo di estrazione di DNA validato e seguire attentamente le istruzioni riportate nel manuale d uso del produttore. Problema 5: Ampie fluttuazioni nei valori di fluorescenza. 1. La Master Mix di PCR non è stata miscelata bene: - Ripetere attentamente la procedura di preparazione della PCR. 2. Presenza di bolle d'aria nei tubi/piastra di PCR: - Eliminare le eventuali bolle presenti prima di iniziare una nuova corsa. Problema 6: Assenza completa di segnale. 1. Controllare le prestazioni del termociclatore: - Effettuare la calibrazione dello strumento. 2. Deterioramento dei fluorofori/primers. Le condizioni di stoccaggio non sono conformi alle istruzioni riportate nel manuale d uso: - Verificare le condizioni di conservazione del kit. - Verificare la data di scadenza del kit. Problema 7: Il termociclatore dà un messaggio di errore. 1. Consultare il manuale di Istruzioni Per l Uso dello strumento o contattare il supporto tecnico. Problema 8: I reagenti del kit sono stati lasciati fuori dall'intervallo di temperatura di stoccaggio. 1. Questi reagenti devono essere conservati come indicato per una corretta esecuzione del test. Le prestazioni del prodotto non sono garantite se questi reagenti non sono stati correttamente conservati. L ACQUISTO DI QUESTO PRODOTTO ASSICURA ALL ACQUIRENTE I DIRITTI COPERTI DA ALCUNI BREVETTI ROCHE ALLO SCOPO UNICO DI OFFRIRE SERVIZI DI DIAGNOSTICA UMANA IN VITRO. L ACQUISTO DI QUESTO PRODOTTO NON CONCEDE NESSUN ALTRO BREVETTO GENERALE, DIRITTO O LICENZA DI ALCUN TIPO, AL DI FUORI DELLO SPECIFICO DIRITTO DI UTILIZZO. Legenda dei Simboli Utilizzati Key to symbols used REF Codice del prodotto Catalogue number Limitazioni di temperatura Temperature limitation Dispositivo medico diagnostico in vitro In Vitro Diagnostic Medical Device REV Revisione Revision LOT Numero di lotto Batch code Data di scadenza Use by Fabbricante Manufacturer Leggere le istruzioni d uso Consult instructions for use Sufficiente per un <n> di test Contains sufficient for <n> tests Conforme ai requisiti della Direttiva 98\79\CE According to 98/79/CE Directive 8/8
9 For Professional Use Only Duplicα Real Time AEAC Chlamydia trachomatis kit EBR031032_TDS_REV.01D_ENITA Technical Data Sheet :EBR tests INTRODUCTION Chlamydia trachomatis is a Gram-negative bacterium that infects the columnar epithelium of the cervix, urethra and rectum, as well as nongenital sites such as lungs and eyes. The bacterium is the cause of the most frequently reported Sexually Transmitted Disease in the United States, which is responsible for more than 1 million infections annually. Most persons with this infection are asymptomatic. Untreated infection can result in serious complications such as pelvic inflammatory disease, infertility and ectopic pregnancy in women and epididymitis and orchitis in men. Men and women can experience Chlamydia-induced reactive arthritis. Treatment of uncomplicated cases should include azithromycin or doxycycline. Screening is recommended in all women younger than 25 years, in all pregnant women, and in women who are at increased risk of infection. Screening is not currently recommended in men. In neonates and infants, the bacterium can cause conjunctivitis and pneumonia. Adults may also experience conjunctivitis caused by Chlamydia. Trachoma, a recurrent ocular infection caused by Chlamydia, is endemic in the developing world. PRODUCT DESCRIPTION 1. INTENDED USE Duplic Real Time AEAC (Advanced Extraction/Amplification Control) Chlamydia trachomatis kit is a qualitative assay for DNA detection of Chlamydia trachomatis in clinical specimens. The kit allows to detect a human endogenous gene ( -GLOBIN), therefore validating the extraction-amplification process. 2. TARGET SEQUENCES The 16s gene (GeneBank DQ ) and the cryptic plasmid DNA (GeneBank X ) of Chlamydia trachomatis. The hbb gene (GeneBank AC_ ) encoding the human -globin protein, used as Extraction/Amplification Control. 3. NUMBER OF TESTS 32 tests 4. STABILITY AND STORAGE The stability of Euroclone Diagnostica Duplic Real Time AEAC Chlamydia trachomatis kit is 12 months from the manufacturing date. The kit must be stored at C. 5. CONTROLS The kit includes two controls: one consisting of synthetic DNA sequence is a positive control for Chlamydia trachomatis (Control 1) and an Endogenous Control of Extraction/Amplification. 6. FLUOROPHORES The fluorophore FAM (6-carboxyfluorescein) is used for the detection of Chlamydia trachomatis DNA while the fluorophore HEX (hexa-chloro-fluoresceine) is used for the detection of the Endogenous Control of Extraction/Amplification (human β-globin). 7. INSTRUMENT COMPATIBILITY The kit has been standardized on CFX96 TM (Bio-Rad) and Smart Cycler (Cepheid) platforms. Other makes and models should be fully tested and evaluated for optimal performance by the user before reporting results. 8. ANALYTICAL SENSITIVITY AND SPECIFICITY The Analytical Sensitivity of the test was determined using purified and quantified genomic DNA (ABI). Four serial DNA dilutions (range copy/reaction) were tested and the lower Limit of Detection (LoD), defined as the number of copies that can be detected with a probability of 95%, was found to be 1 copy/reaction. The Analytical Specificity of Euroclone Diagnostica Duplic Real Time AEAC Chlamydia trachomatis kit is foremost granted by the selection of the primers and probes, as well as the selection of stringent reaction conditions. The primers and probes have been checked for possible homologies against the major genetic data banks. The analytical specificity was evaluated by experimentally testing the cross-reactivity of the Euroclone Diagnostica Duplicα RealTime AEAC Chlamydia trachomatis kit against potentially interfering microorganisms. None of the tested pathogens demonstrated reactivity. Pathogens tested for cross-reactivity: Trichomonas vaginalis, Mycobacterium tuberculosis, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealiticum, Clostridium difficile, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis and Chlamydophila pneumoniae. 9. MEASURING RANGE The Measuring Range of the test was determined using purified and quantified genomic DNA (ABI). It goes from the LoD (see Analytical Sensitivity) to 1x10 4 copies/reaction. Based on the dilution factor, this value corresponds to approximately 1x10 5-2x10 5 copies in the sample subjected to nucleic acid extraction using the recommended methods. 10. CLINICAL SENSITIVITY AND SPECIFICITY The clinical sensitivity and specificity were tested on biological samples processed with two different extraction methods: 1/4
10 Extraction System 1: Duplicα PREP Automatic Extractor (Euroclone Diagnostica srl), Duplicα NA BodyFluid kit (ref EDI004200); Extraction System 2: EZ1 Advanced XL (Qiagen), DNA Tissue Kit, protocol Bacterial, (ref ) The number of tested samples was 98 (72 were purified with Extraction System 1; 26 were purified with Extraction System 2); 48 of these samples was known to be positive for Chlamydia trachomatis DNA while the remaining 50 samples were negative. The 72 samples purified with Extraction System 1 were as follow: 15 urethral swabs, 13 cervical swabs, vaginal swabs 39, 4 seminal fluids and 1 sample from the UK NEQAS external quality program. The 26 samples purified with Extraction System 2 were as follow: 6 urethral swabs, 5 cervical swabs, 12 vaginal swabs and 3 seminal fluids. The purified DNA obtained with the above mentioned Extraction Systems were tested with two different platforms: Smart Cycler (Cepheid) and CFX96 TM (Bio-Rad). The Contingency Tables below show the good results achieved with Duplicα PREP and EZ1 Advanced XL instruments. Extraction System 1: Duplicα PREP 1. Smart Cycler Platform 2. CFX96 TM Platform Reference Data Positive Negative Positive Negative Sensitivity Specificity Extraction System 2: EZ1 Advanced XL 1. Smart Cycler Platform Reference Data Positive Negative Positive Negative Sensitivity Specificity 2. CFX96 TM Platform Reference Data Positive Negative Positive Negative Sensitivity Specificity Reference Data Positive Negative Positive Negative Sensitivity Specificity The data show an excellent correlation with the reference system. 11. INTRA-ASSAY VARIABILITY In order to demonstrate the intra-assay reproducibility of the kit, the following samples were tested in duplicates in the same run: 2 negative controls, 10 copies of a quantified genomic DNA (ABI), 1 positive control, 1 blank. Table below shows the results obtained with the lowest concentration of genomic DNA (10 copies/test): Sample Mean Ct value +/- D.S. C.V. % Fam Hex Fam Hex Fam Hex 10 copies 26,0 23,3 0,19 0,20 0,78% 0,91% 12. INTER-ASSAY VARIABILITY In order to demonstrate the inter-assay reproducibility of the kit, the following samples were tested in 2 different runs: 2 negative controls, 10 copies of a quantified genomic DNA (ABI), 1 positive control, 1 blank. Table below shows the results obtained with the lowest concentration of genomic DNA (10 copies/test): Sample Mean Ct value +/- D.S. C.V. % Fam Hex Fam Hex Fam Hex 10 copies 26,1 23,1 0,515 0,275 1,99% 1,23% 2/4
11 Ad esclusivo Uso Professionale Scheda Tecnica Duplicα Real Time AEAC Chlamydia trachomatis kit EBR031032_TDS_REV.01D_ENITA :EBR test INTRODUZIONE Chlamydia trachomatis è un batterio Gram-negativo che infetta l'epitelio colonnare della cervice, dell uretra e del retto, così come i siti non genitali di polmoni e occhi. Il batterio è la causa della malattia a trasmissione sessuale più frequente degli Stati Uniti, responsabile di più di un 1 milione di infezioni all'anno. La maggior parte delle infezioni nelle persone è a carattere asintomatico. L infezione non trattata può portare a gravi complicazioni come, nelle donne, a malattia infiammatoria pelvica, infertilità, gravidanza ectopica e, negli uomini, a epididimite e orchite. Uomini e donne possono sperimentare anche l artrite reattiva indotta da Chlamydia. Il trattamento clinico dei casi senza complicanze dovrebbe includere azitromicina o doxiciclina. Lo screening è da raccomandarsi a tutte le donne di età inferiore ai 25 anni, a quelle in stato di gravidanza, e a quelle che si espongono ad un aumentato rischio di infezione. Lo screening non è attualmente raccomandato per gli uomini. Nei neonati e nei bambini, il batterio può causare congiuntivite e polmonite. Anche gli adulti possono sperimentare congiuntivite causata da Chlamydia. Il Tracoma è un'infezione oculare ricorrente causata da Chlamydia ed è attualmente endemica nel mondo in via di sviluppo. DESCRIZIONE DEL PRODOTTO 1. FINALITÀ D USO Duplicα Real Time AEAC (Advanced Extraction /Amplification Control) Chlamydia trachomatis kit è un test qualitativo di amplificazione di acidi nucleici in vitro per la ricerca del DNA di Chlamydia trachomatis ottenuto da campioni clinici. Il kit permette di identificare il gene umano endogeno ( -GLOBINA), che consente di validare il processo di estrazione-amplificazione. 2. SEQUENZA TARGET Le sequenze target sono il gene 16s (GeneBank DQ ) e il plasmide di DNA criptico (GeneBank X ) di Chlamydia trachomatis. Il gene hbb (GeneBank AC_ ) codificante per la -globina umana, è utilizzato come controllo di Estrazione/Amplificazione. 3. NUMERO DI TEST 32 test 4. STABILITÀ E CONSERVAZIONE Il Duplicα Real Time AEAC Chlamydia trachomatis kit è stabile per 12 mesi dalla data di produzione. Il kit deve essere conservato a C 5. CONTROLLI Il kit include due controlli: uno contente la sequenza sintetica di DNA del controllo positivo di Chlamydia trachomatis, l altro è un controllo endogeno di -GLOBINA per la verifica del processo di Estrazione-Amplificazione. 6. FLUOROFORI Il kit impiega il fluoroforo FAM (6-carboxyfluorescein) per la rilevazione del DNA di Chlamydia trachomatis DNA mentre il fluoroforo HEX (hexa-chloro-fluoresceine) per la rilevazione del controllo endogeno di Estrazione-Amplificazione ( -GLOBINA umana) 7. COMPATIBILITÀ STRUMENTALE Il kit è stato ottimizzato per le piattaforme CFX96 TM e SmartCycler (Cepheid). Altre marche e modelli devono essere pienamente testati e valutati per prestazioni ottimali da parte dell'utente prima di refertare i risultati. 8. SPECIFICITÀ ANALITICA La Sensibilità Analitica del test è stata determinata utilizzando DNA purificato e quantificato (ABI) Sono state testate quattro diluizioni scalari a partire da 1000 copie/reazione fino ad 1 copia/reazione e il Limite inferiore di Rilevazione (LoD), definito come il numero di copie che può essere identificato con una probabilità del 95%, è stato determinato essere 1 copia/reazione. La Specificità Analitica del prodotto di Euroclone Diagnostica Duplicα Real Time AEAC Chlamydia trachomatis kit è stata garantita dal corretto design di primers e sonde e dalle condizioni stringenti in cui viene effettuata la prova. Primers e sonde sono stati controllati per possibili omologie con altre sequenze pubblicate in diverse banche dati, senza mai riscontrare appaiamenti aspecifici. I risultati ottenuti dai test effettuati sui patogeni non correlati a Chlamydia trachomatis, in modo tale da verificare la specificità del kit, hanno dato tutti esito negativo. I patogeni testati per analisi di cross-reattività sono: Trichomonas Vaginalis, Mycobacterium Tuberculosis, Gardnerella Vaginalis, Mycoplasma Genitalium, Ureaplasma Urealiticum, Clostridium Difficile, Neisseria Gonorrhoeae, Mycoplasma Hominis e Chlamydia Pneumoniae. 9. INTERVALLO DI MISURA L Intervallo di Misura del test è stato determinato utilizzando DNA purificato e quantificato (ABI), e si estende dal LoD (vedi Sensibilità Analitica) a 1x10 4 copie/reazione. Sulla base del fattore di diluizione, a questo valore corrispondono approssimativamente 1x10 5-2x10 5 copie nel campione sottoposta all estrazione degli acidi nucleici con i metodi raccomandati 3/4
12 10. SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ CLINICA La sensibilità e la specificità clinica è stata testata su campioni biologici processati con due metodi di estrazione differenti. Sistema di estrazione 1: Duplicα Prep Automatic Extractor (Euroclone Diagnostica srl), Duplicα Prep BodyFluid kit (ref EDI004200); Sistema di estrazione 2: EZ1 Advanced XL (Qiagen), DNA Tissue Kit, protocollo Batteri, (ref ) Il numero totale di campioni sottoposti allo studio è stato 98, di cui 72 estratti con il sistema Duplicα Prep (Sistema di Estrazione 1) e 26 con il sistema EZ1 (Sistema di Estrazione 2). 48 dei campioni forniti erano stati in precedenza classificati come positivi per la presenza del DNA di Chlamydia trachomatis e 50 come negativi. I campioni estratti con il sistema Duplicα Prep avevano la seguente provenienza: 15 tamponi uretrali, 13 tamponi cervicali, 39 tamponi vaginali, 4 liquidi seminali ed 1 campione proveniente dal programma di qualità esterno UK NEQAS. I campioni estratti con il sistema EZ1 avevano la seguente provenienza: 6 tamponi uretrali, 5 tamponi cervicali, 12 tamponi vaginali, 3 liquidi seminali. Il DNA purificato, ottenuto con i metodi sopra citati, è stato testato sulle piattaforme CFX96TM e SmartCycler. Le tabelle di contingenza mostrano i buoni risultati ottenuti con le piattaforme Duplicα Prep e EZ1 Advanced XL (Qiagen). Extraction System 1: Duplicα PREP 1. Piattaforma Smart Cycler 2. Piattaforma CFX96 TM Dati di Riferimento Positivi Negativi Positivi Negativi Sensibilità Specificità Dati di Riferimento Positivi Negativi Positivi Negativi Sensibilità Specificità Extraction System 2: EZ1 Advanced XL 1. Piattaforma Smart Cycler 2. Piattaforma CFX96 TM Dati di Riferimento Positivi Negativi Positivi Negativi Sensibilità Specificità Dati di Riferimento Positivi Negativi Positivi Negativi Sensibilità Specificità I dati dimostrano un ottima concordanza con il sistema di riferimento. 11. VARIABILITÀ INTRA-ASSAY: Al fine di dimostrare la riproducibilità intra assay del kit sono stati testati in duplicato i seguenti campioni: 2 campioni negativi, 10 copie di DNA genomico quantificato (ABI), 1 controllo positivo e 1 bianco di reazione. Di seguito vengono riportati i risultati relativi alla minor concentrazione di DNA genomico testata (10 copie/test). Media D.S. C.V. Campione Fam Hex Fam Hex Fam Hex 10 copie 26,0 23,3 0,19 0,2 0,78% 0,91% 12. VARIABILITÀ INTER-ASSAY: Al fine di dimostrare la riproducibilità inter assay del kit sono stati testati in 2 differenti corse i seguenti campioni: 2 campioni negativi, 10 copie di DNA genomico quantificato (ABI), 1 controllo positivo e 1 bianco di reazione. Di seguito vengono riportati i risultati relativi alla minor concentrazione di DNA genomico testata (10 copie/test). Media D.S. C.V. Campione Fam Hex Fam Hex Fam Hex 10 copie 26,1 23,1 0,515 0,275 1,99% 1,23% 4/4
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