metodi poco sensibili, laboriosi, costosi, e indaginosi

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1 dosaggi ormonali L ANALISI CHIMICA fasi di isolamento, purificazione e concentrazione elaborate non sufficientemente sensibile per il dosaggio di tutti gli ormoni nel sangue metodi poco sensibili, laboriosi, costosi, e indaginosi

2 Il RIA è una metodica rapida, capace di incrementare in maniera impressionante la sensibilità e la precisione della misurazione della concentrazione dell ormone

3 Marcatore: sostanza (radioisotopo, enzima, fluoroforo ecc) che introdotta nella struttura di un reagente (antigene, aptene, anticorpo) ne consente la rivelazione

4 dosaggio radioimmunologico (RIA), il tracciante è costituito da un isotopo. Vantaggi: - elevata sensibilità, - facilità con cui si ottengono le marcature isotopiche - invariabilità delle cinetiche di reazione a seguito della marcatura stessa. Svantaggi: - alti costi dei reattivi e delle apparecchiature, - deperibilità, pericolosità e costi di smaltimento dei composti radioattivi, - necessità di personale specializzato dosaggi immunoenzimatici (EIA). il tracciante è costituito da un enzima, Non viene misurato direttamente il marcatore, ma la sua attività nei confronti di un suo substrato specifico (ovvero la quantità di prodotto formato). L attività enzimatica, come pure l affinità fra Ab e Ag, può variare a seguito della coniugazione fra enzima e anticorpo (o antigene). Vantaggi: - minor costo, - assenza di rischi derivati dall esposizione a radiazioni, - maggior praticità e versatilità.

5 ANTICORPO Molecola di natura glicoproteica con struttura periferica esattamente complementare a quella dell antigene che ne ha provocato la formazione. Questa prerogativa provoca il legame e la formazione dell IMMUNOCOMPLESSO ANTIGENE Entità estranea che, penetrata nell organismo di un vertebrato, provoca la reazione di esso e la formazione di anticorpi. L Ag deve essere eterologo ma riconoscibile dall organismo, deve essere dotato di complessità molecolare ed elevato peso molecolare; l Ag perfetto è una glicoproteina REAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO: IMMUNOCOMPLESSO Legami di tipo debole, non covalenti. Per es. forze di Van Der Waals, di Coulomb, legami idrogeno ecc. reazione dinamica e reversibile tra un anticorpo e un antigene per dare origine al complesso antigene-anticorpo. E caratterizzata da una costante di equilibrio definita Ab più utilizzati IgG ( pm, 250 Å)

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7 Da che cosa dipende l immunogenicità di una sostanza? 1 - estraneità: il sistema immunitario è in grado di discriminare il self dal non self, di conseguenza, le molecole estranee ad un determinato organismo hanno capacità immunogena; 2 - peso molecolare: più è elevato il peso molecolare della molecola in esame e maggiore sarà la possibilità di avere una risposta immunogenica; 3 - complessità chimica e strutturale delle molecole: l eterogenicità chimica apporta immunogenicità. Ad esempio omopolimeri anche adeguatamente grandi hanno immunogenicità bassa se confrontata con polimeri, contenenti aminoacidi diversi, dello stesso peso molecolare. D altra parte, gli antigeni proteici risultano tanto più immunogenici quanto più sono complessi i loro livelli di organizzazione molecolare (struttura terziaria e quaternaria); 4 - specie animale: le proprietà immunogene di un antigene variano a seconda della specie animale utilizzata per la produzione di anticorpi; 5 degradabilità: macromolecole insolubili sono più immunogene di quelle più piccole e solubili, poiché vengono più facilmente fagocitate ed elaborate dal sistema macrofagico.

8 La costante di associazione K è definita dalla concentrazione di epitopo libero necessario perché venga raggiunto il 50% di saturazione dei siti anticorpali ed è una misura dell affinità intrinseca o della stabilità del legame Ag-Ab. L affinità di un anticorpo per un dato antigene determina sia il limite di rilevabilità o sensibilita (che migliora con l aumentare dell affinità), sia la specificità (che cresce all aumentare della differenza tra il valore della costante di affinità di un Ab verso l Ag specifico e quello relativo ad un Ag non specifico)

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12 L ANTIGENE MARCATO può essere identico all antigene che deve essere misurato nel campione (o possedere una capacità legante simile). Esso, tuttavia, contiene anche uno o più atomi di un particolare isotopo radioattivo. Non è necessaria una identica attività biologica dell antigene marcato e non marcato. La validità di un dosaggio RIA dipende da un identico comportamento immunologico dell antigene nel campione in esame con l antigene degli standard di riferimento

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18 RIA che utilizzano nella reazione l antigene marcato. 1. DOSAGGIO ALL EQUILIBRIO Incubazione simultanea di antigene, antigene marcato, e anticorpo La forma più comune 2. DOSAGGIO PER COMPETIZIONE DI LEGAME L antigene marcato (Ag*) forma i complessi con l anticorpo (Ab). Quindi viene aggiunto l antigene non marcato (Ag) ai complessi Ag*-Ab, che spiazza l antigene marcato (Ag*) dai complessi formati. 3. DOSAGGIO SEQUENZIALE Si mette a reagire l antigene non marcato (il campione in esame) con l anticorpo. Poiché questa reazione avviene in eccesso di anticorpo saranno disponibili ancora siti leganti anticorpali. Si aggiunge quindi l antigene marcato, che andrà a saturare i restanti siti anticorpali liberi. Per alcuni composti questo metodo offre una maggiore sensibilità, ma risente della riduzione del range di concentrazione che può essere misurato.

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20 Tecniche di dosaggio RIA schema operativo 1.Ricostituzione dei reagenti Soluzioni di lavoro Eventuale pretrattamento campioni 2.Addizione dei reattivi Volumi da 10μL a 1mL 3.Incubazione Temperatura 4-45 C Tempo ore 4.Separazione dell Ag libero dal complesso Ag-Ab 5.Conteggio Adsorbimento in fase solida Insolubilizzazione dell immunocomplesso Scintillazione solida - radiazioni γ (elettromagnetiche) Scintillazione liquida - radiazioni β (corpuscolate) 6.Calcolo dei risultati Curva di taratura

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23 I PIU IMPORTANTI METODI DI SEPARAZIONE 1. La precipitazione non specifica dei complessi antigeneanticorpo con sali e solventi (solfato di ammonio, etanolo, polietileneglicol-peg). 2. L immunoprecipitazione dei complessi solubili antigeneanticorpo (tecnica del doppio anticorpo). 3. L adsorbimento dell antigene su fase solida (es. provette sensibilizzate con l anticorpo). 4. L adsorbimento non specifico dell antigene (es. carbone, carbone-destrano).

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