I microrna (mirna) sono una classe di molecole ad attività regolativa scoperti piuttosto

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1 1 Introduzione I microrna (mirna) sono una classe di molecole ad attività regolativa scoperti piuttosto recentemente, caratterizzati da una complessa biogenesi e che possiedono una vasta gamma di funzioni. La loro principale attività regolatoria in numerosi processi biologici consiste nella modulazione posttrascrizionale dell espressione genica, grazie a una regione di complementarietà tramite la quale sono in grado di appaiare uno specifico mrna ed inibirne la sua traduzione e quindi la sintesi proteica del suo prodotto. Uno dei processi nel quale il ruolo dei mirna è oggetto di grande interesse e studio è quello, piuttosto complesso, della miogenesi. Lo sviluppo dei tessuti muscolari scheletrici è un fenomeno multi-fattoriale e altamente regolato, attraverso il quale cellule mesodermiche pluripotenti originano mioblasti e in seguito si fondono in miotubi. Tale processo è modulato da un grande numero di fattori, spesso di natura molto differente, che interagendo tra di loro regolano finemente lo sviluppo dei muscoli: oltre a proteine leganti il DNA (fattori di trascrizione), vari fattori di crescita e molecole accessorie intermedie si è recentemente scoperto che un certo numero di tali microrna sono coinvolti come addizionali molecole di regolazione. Dopo una doverosa ma breve panoramica sugli aspetti generali dei mirna e della miogenesi si focalizzerà l attenzione soprattutto su alcuni modelli di regolazione mirna-dipendenti dello sviluppo muscolare, basandosi in particolare su due lavori e traendone opportune conclusioni. Andremo prima ad analizzare gli effetti dei mirna denominati mir-1 e mir-133 sulla miogenesi, responsabili rispettivamente di differenziazione e proliferazione dei mioblasti e caratterizzati da un circuito di regolazione molto efficace basato sull interazione con bersagli ben distinti. 4

2 Passeremo poi a considerare il microrna mir-24, componente fondamentale della regolazione della miogenesi basata sul pathway di segnalazione cellulare TGF-ß-dipendente; tale mirna, che come vedremo è inibito a scopo regolativo dal fattore TGF-ß, è coinvolto nei processi di induzione dell espressione di alcuni tra i principali geni con funzioni miogeniche. 5

3 2 Panoramica sui MicroRna 2.1 Generalità sui MicroRna Scoperti nel 1993 nel nematode C. elegans, i mirna sono piccoli RNA non codificanti lunghi ~22 nucleotidi a funzione regolatoria. Strettamente imparentati all altra classe di piccoli sncrna (Small Non Coding RNA), anche denominati sirna e responsabili del fenomeno dell interferenza ad RNA (RNA interference), ne condividono in parte le funzioni regolative ma le differenze tra i processi di maturazione e i meccanismi d azione li rendono facilmente distinguibili. Tali mirna sono finora stati riscontrati solo in piante, animali e virus relativi: il loro ruolo è talmente rilevante che si stima regolino, per quel che riguarda il genoma umano, circa un terzo dei geni totali. Mutazioni artificialmente indotte in specifici mirna o in enzimi coinvolti nella loro maturazione hanno mostrato, in modelli quali Arabidopsis o Drosophila, difetti di sviluppo talmente marcati da confermare come siano effettivamente numerosi, e importanti, i processi di espressione genica sottoposti a tale via di regolazione. Il meccanismo d azione dei mirna è basato sulla complementarietà, più o meno estesa, tra tali molecole e gli eventuali mrna bersaglio; l attività dei mirna è proprio il riconoscimento specifico di tali mrna e il conseguente blocco dell espressione genica a livello post-trascrizionale. Tale meccanismo, così come la maturazione dei mirna, è leggermente diverso tra i mirna appartenenti al mondo vegetale e quelli animali; approfondiremo più avanti le modalità di biogenesi e azione della seconda tipologia di mirna (Du, 2005). 6

4 2.2 Biogenesi e maturazione Il processo di sintesi e maturazione dei mirna negli animali è un fenomeno piuttosto complesso e suddivisibile in più passaggi, che coinvolge numerosi elementi enzimatici sia all interno che all esterno del nucleo della cellula. Un modello esauriente degli step della biogenesi è mostrato nella Figura 1. Il primo passaggio è la trascrizione da parte della Rna Polimerasi II di un gene endogeno a formare un trascritto grande anche migliaia di nucleotidi, detto pri-mirna. Il pri-mirna è processato da una proteina nucleare ad attività endonucleasica appartenente alla famiglia delle Rnasi III, chiamata Drosha; tale enzima effettua specifici tagli sul trascritto e genera una caratteristica struttura a forcina di 70 paia di basi, con due nucleotidi sporgenti al 3, detta premirna. In tale processo è coinvolta anche Pasha, una proteina con un sito di legame per l RNA a doppio filamento (dsrna), che si suppone stabilizzi il pri-mirna per permettere l azione endonucleasica di Drosha. Il pre-mirna è riconosciuto a livello degli specifici nucleotidi sporgenti da un fattore di trasporto, l Exportin-5, che trasloca il trascritto all esterno del nucleo liberandolo nel citoplasma. Una endonucleasi citoplasmatica, detta Dicer, effettua ulteriori tagli su tale struttura a forcina eliminandone il cappio e formando un dsrna di ~19-25 nucleotidi di lunghezza, con però una leggera discrepanza di complementarietà tra i due filamenti; come per Drosha, anche Dicer è coadiuvata da altri elementi tra cui TRBP (Transactivating Response RNA-binding Protein). L RNA a doppio filamento così generato è reclutato da un complesso multiproteico detto RISC (RNA Induced Silencing Complex), il cui componente principale è una proteina evolutivamente conservata chiamata Argonaute. 7

5 Figura 1: Processamento del pri-mirna da parte di Drosha, esportazione nucleare ed elaborazione del pre-mirna da parte di Dicer. Schema del processo di biogenesi dei mirna. Immagine parzialmente modificata e tradotta da Zamore and Haley, Dei due filamenti uno, detto filamento guida, viene selezionato da Argonaute e integrato nel complesso sulla base della stabilità della sua regione 5 ; l altro filamento, detto anti-guida o passeggero, verrà invece degradato (Figura 2). Il complesso così generato è un mirna attivo e sarà di fatto composto da una regione costituita dal mirna stesso, quindi in grado di riconoscere una certa specificità di sequenza e appaiarvisi, e da una regione catalitica che entrerà in gioco nel momento in cui avverrà il riconoscimento di un mrna bersaglio da parte del mirna (Hannon, 2002). 8

6 Figura 2: Attivazione del complesso RISC. Un mirna a doppio filamento di ~21 nucleotidi è incorporato nel complesso RISC, in seguito attivato tramite ATP; Solo uno dei due filamenti viene integrato nel complesso divenendone parte fondamentale per il riconoscimento del target, mentre l altro viene degradato. Immagine modificata e tradotta da Hannon, Meccanismi d azione La regolazione effettuata dai mirna su specifici geni bersaglio è sempre di tipo negativo e prevede due tipologie di meccanismo d azione: il taglio diretto del mrna bersaglio o la sua repressione traduzionale. Il primo caso è limitato alle piante, dove la complementarietà tra i mirna e i loro mrna bersaglio è più o meno perfetta. A seguito dell appaiamento il complesso RISC espleta la sua funzione 9

7 Figura 3: Pathway di biogenesi e meccanismo d azione dei mirna animali. Ricapitolazione dei passaggi di processamento nucleare e citoplasmatico dei mirna, loro incorporazione nel RISC e attività di repressione traduzionale tramite migrazione del complesso e dell mrna target nel P-body. Immagine modificata e tradotta da Yeung et al., endonucleasica e taglia l mrna, degradandolo e inibendo la sintesi dell eventuale proteina che ne sarebbe stata tradotta. 10

8 Il secondo processo è invece tipico dei mirna animali, dove la complementarietà con l mrna bersaglio è solitamente limitata ai nucleotidi 2-7/8 della regione al 5. L esigua dimensione di questa zona, detta regione seed, è la caratteristica che permette a singoli mirna di modulare l attività di un numero molto vasto di geni potendo con un unico mirna legare numerosi mrna bersaglio in posizioni differenti (Ambros, 2004). Al contrario del taglio precedentemente visto, nelle cellule animali il silenziamento genico prende un pathway differente (Figura 3); si è difatti osservato come i complessi mirna-risc e i relativi mrna bersaglio, previa riconoscimento di sequenza e attivazione della struttura catalitica costituita dalla proteina Argonaute, tendano a essere rilocalizzati in foci citoplasmatici chiamati P-bodies. In tali zone l mrna rimane legato alla struttura mirna-risc e sottratto all azione dei ribosomi, effettuando quindi la già citata repressione traduzionale; è anche possibile un azione di degradazione del cappuccio (CAP) al 5 dei mrna da parte di specifiche esonucleasi presenti nel P-body, sebbene sia probabile che già il semplice sequestro dell mrna sia sufficiente a impedirne la processazione da parte dei ribosomi (Yeung, 2005). 11