Shelf life e Listeria monocytogenes: aspetti sanitari e regolamentari

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1 Dipartimento di Scienze e tecnologie alimentari e microbiologiche Shelf life e Listeria monocytogenes: aspetti sanitari e regolamentari

2 Listeria: tassonomia Bastoncini Gram positivi, asporigeni, catalasi positivi, mobili (moto rototraslatorio) Metabolismo: anaerobi facoltativi Temperatura: -1/+45 C, T ott C mesofili, psicrotrofi ph: ph ott. 6-8; ph max. 9.6; ph min. 4.1; poco acido-resistenti A w : ; alotollerante (8-10% NaCl) Habitat: ubiquitario

3 Listeria: caratteristiche Specie Xilosio Lattosio Galattosio Ramnosio Mannitolo β- emolisi Serovar L. monocytogenes - V V /2 a,b,c 3a,b,c, 4a,ab,c,d,e,7 L. innocua ab, 6a,6b L. seeligeri W 1/2a,b,c 3a,b,c, 4a,ab,c,d,e L. welshimeri + V - - 6a, 6b L. ivanovii + + V L. grayi Idrolizza esculina (glucosio ed esculettina) Crescita: 10 e 40% bile; 10% NaCl, 0.025% acetato di Tallio, 0,04% tellurito di potassio Inibita da 0.025% azide di sodio

4 Sierotipi Listeria spp. 17 serovar Listeria monocytogenes: 13 serovar (1/2 e 4) Nessuna correlazione all ospite ed origine geografica ed al processo patologico

5 Listeriosi Infezione: consumo di alimenti contaminati o per contatto diretto Sintomi: variano con l ospite - raramente colpisce l apparato gastroenterico Donne gravide Neonati Anziani Persone immunodepresse Nei paesi occidentali è molto rara (incidenza mediamente di 4 casi per milione di abitanti) Morte 35-40% ADULTO Meningiti Aborti Setticemie NEONATO Meningoencefaliti Setticemie

6 Listeria: meccanismo di infezione via orale colonizza il tratto intestinale invasione tessuti circolo ematico Patogeno intracellulare Fosfolipasi C Filopodio Code di miosina Fattore di virulenza: Listeriolisina O (LLO)

7 Vie di contaminazione SECREZIONI ED ESCREZIONI ANIMALI Feci, secrezioni uterine, placenta, membrane ANIMALI Malattie, colonizzazione intestinale Contaminazione aerea Acque di scolo AMBIENTE SUOLO ACQUA Prodotti vegetali insilati Contaminazione aerea Acque luride, fiumi UOMO Malattie, colonizzazione intestinale PRODOTTI ANIMALI Latte, carne, carcasse, prodotti lattiero-caseari

8 Alimenti Alimenti di origine sia vegetale che animale latte crudo (animale, sanificazione ambientale insufficiente) formaggi molli/crosta fiorita carne fresca e congelata/ salumi freschi prodotti fermentati pollame prodotti ittici (pesce affumicato e in salamoia) ortofrutticoli freschi LAVORAZIONE TRASFORMAZIONE DISTRIBUZIONE

9 Sicurezza alimentare APPROPRIATO LIVELLO DI PROTEZIONE (ALOP - WTO -1995) Livello di protezione giudicato appropriato dalle Autorità competenti che dovranno stabilire le misure necessarie a proteggere i consumatori all interno del territorio Ragioni di salute pubblica Fattibilità tecnica Implicazioni economiche Comparazioni con altri rischi Analisi del rischio

10 Sviluppo del sistema analisi del Rischio Definizione del problema Definizione dei livelli di rischio accettabili (ALOP)? Sviluppo del FSO Verifica della fattibilità tecnica del FSO Responsabili della gestione del rischio dell industria e/o dell autorità i controllo Sviluppo delle misure di controllo

11 FOOD SAFETY OBJECTIVE massima frequenza/concentrazione di un pericolo (microbiologico) in un alimento al momento del consumo ritenuta tollerabile per la sicurezza alimentare, ovvero in grado di assicurare un appropriato livello di protezione della salute (ALOP) FSO = PRECISO TRAGUARDO DI SICUREZZA

12 ESEMPI DI FSO la concentrazione di enterotossina stafilococcica nei formaggi non dovrebbe superare 1 µg 100 g 1 la concentrazione di aflatossine nelle arachidi non dovrebbe superare 15 µg kg 1 la carica di Listeria monocytogenes negli alimenti pronti per il consumo non dovrebbe superare le 100 ufc g 1 al momento del consumo la carica di salmonella dovrebbe essere inferiore a 100 ufc kg 1 di latte in polvere

13 PACCHETTO IGIENE Reg. 178/2004 Reg. n. 852/2004 Reg. n. 853/2004 Reg. n. 854/2004 Principi e requisiti generali della legislazione alimentare, istituisce l Autorità Europea per la sicurezza alimentare e fissa le procedure nel campo della sicurezza alimentare Igiene dei prodotti alimentari Norme specifiche in materia di igiene per gli alimenti di origine animale Norme specifiche per l organizzazione dei Controlli ufficiali sui prodotti di origine animale destinati al consumo umano Reg. n. 2073/2005 Criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari

14 PACCHETTO IGIENE ANALISI DEL RISCHIO Valutazione, gestione, comunicazione del rischio OPERATORE DEL SETTORE ALIMENTARE (OSA) Responsabilità primaria dei operatori nel garantire il raggiungimento degli obiettivi mediante il rispetto dei criteri microbiologici CRITERIO MICROBIOLOGICO Strumento per stabilire l accettabilità o meno di un prodotto

15 Perché stabilire un criterio microbiologico? Sicurezza Shelf-life Rispetto delle norme igieniche (GHP) Accettabilità Un criterio microbiologico dovrebbe essere stabilito solo se Reale o potenziale pericolo per la salute del consumatore E possibile la sua applicazione sulla base dei sistemi disponibili

16 CRITERIO MICROBIOLOGICO Criterio ingiuntivo Criterio raccomandato Standard microbiologico (mandatary criterion) Specifiche microbiologiche (specification) Linee/criteri guida (guideline)

17 FSO Obiettivo sulla base del quale viene definito il processo per raggiungere un ALOP Si riferisce ad un processo Può servire per stabilire un criterio microbiologico Idoneo per stabilire un sistema di sicurezza alimentare di un processo Criterio microbiologico Definisce l accettabilità di un prodotto in base all assenza o presenza o numero di microrganismi o sostanze prodotte Si riferisce al prodotto Non serve per stabilire un FSO Non idoneo per stabilire un sistema di sicurezza alimentare di un processo.

18 Reg 2073/2005 Art. 2 Criterio microbiologico Definisce l accettabilità di un prodotto, lotto di prodotti alimentari o di un processo, in base all assenza, alla presenza o al numero di microrganismi e/o in base alla quantità delle relative tossine/metaboliti, per unità di massa, volume, area o partita Criterio di sicurezza alimentare Definisce l accettabilità di un prodotto o di una partita di prodotti alimentari applicabile ai prodotti immessi sul mercato Criterio di igiene del processo Definisce l accettabilità del processo di produzione. Stabilisce un valore di contaminazione indicativo oltre il quale è necessario intervenire con misure correttive al fine di mantenere l igiene del processo conforme alla legislazione. Non si applica ai prodotti immessi sul mercato

19 Criteri di sicurezza alimentare Il non rispetto di un CRITERIO DI SICUREZZA implica: Ritiro del prodotto Informazione dell autorità competente e collaborazione Applicazione di misure correttive adeguate Revisione delle procedure di autocontrollo Stabiliti alla luce dell analisi del rischio, (tenendo conto degli ALOP) Tengono conto dell uso e delle caratteristiche intrinseche del prodotto In genere applicano il campionamento a due classi (presenza/assenza) Sono vincolanti Applicabili al termine del processo produttivo, ai prodotti immessi sul mercato ed in ogni fase della vita commerciale.

20 CRITERI DI SICUREZZA ALIMENTARE Capitolo 1 Alimento Piano di campionamento n c Limiti Metodo d analisi di riferimen to Fase in cui si applica il criterio 1.1 Alimenti pronti destinati a lattanti e a fini medici speciali 10 0 Assenti in 25 g EN/ISO Prodotti immessi sul mercato durante il loro periodo di shelf-life

21 1.2 Alimenti pronti diversi da quelli destinati a lattanti e a fini medici speciali che costituiscono un terreno favorevole alla crescita di Listeria monocytogenes: Caratteristiche Piano di campionamento Limiti Metodo d analisi di riferimento Fase in cui si applica il criterio n c Il produttore può dimostrare, con soddisfazione delle autorità competenti, che il prodotto non supererà le 100 ufc/g per tutta la shelf-life ufc/g EN/ISO Prodotti immessi sul mercato durante il loro periodo di shelf-life Il produttore non può dimostrare, con soddisfazione delle autorità competenti, che il prodotto non supererà le 100 ufc/g per tutta la shelf-life 5 0 Assenti in 25 g EN/ISO Prima che gli alimenti escano dal controllo diretto dell operatore

22 COMPITO DELL OSA: Fissare, durante il processo di produzione, dei limiti tali da garantire che alla fine della shelf-life non sarà superato il limite imposto 100 ufc/g DIGITARE NOME DIPARTIMENTO SECONDA RIGA NOME DIPARTIMENTO TERZA RIGA NOME DIPARTIMENTO

23 1.2 Alimenti pronti diversi da quelli destinati a lattanti e a fini medici speciali che costituiscono un terreno favorevole alla crescita di Listeria monocytogenes: Caratteristiche Piano di campionamento Limiti Metodo d analisi di riferimento Fase in cui si applica il criterio n c Il produttore può dimostrare, con soddisfazione delle autorità competenti, che il prodotto non supererà le 100 ufc/g per tutta la shelf-life ufc/g EN/ISO Prodotti immessi sul mercato durante il loro periodo di shelf-life Il produttore non può dimostrare, con soddisfazione delle autorità competenti, che il prodotto non supererà le 100 ufc/g per tutta la shelf-life 5 0 Assenti in 25 g EN/ISO Prima che gli alimenti escano dal controllo diretto dell operatore

24 Caratteristiche 1.3 Alimenti pronti che non costituiscono un terreno favorevole alla crescita di Listeria monocytogenes diversi da quelli destinati a lattanti ed ai fini medici speciali Piano di campionament o n c Limiti Metodo d analisi di riferimento ufc/g EN/ISO Fase in cui si applica il criterio Prodotti immessi sul mercato durante il loro periodo di shelflife ph 4.4 aw 0.92 ph 5.0 e aw 0.94 Prodotti con shelf life < 5 giorni Altri prodotti purchè vi sia una giustificazione scientifica

25 NON CONFORMITA In tutti i casi in cui non vengano rispettati i criteri di sicurezza previsti per Listeria monocytogenes, il Laboratorio incaricato del Controllo Ufficiale notifica la non conformità all autorità competente, previa garanzia del diritto alla difesa del produttore (analisi di revisione/ripetizione di analisi), conformemente a quanto previsto dalla normativa vigente (Legge 283/1962, D.P.R. 327/1980)

26 Listeria monocytogenes in alimenti pronti Alimenti pronti per lattanti o destinati ad uso medico speciale NO La conservabilità è < 5 giorni NO E un substrato sfavorevole per la crescita del patogeno NO La crescita di L. monocytogenes è stata considerata nella definizione di periodo di conservabilità? SI SI SI SI L. monocytogenes assente in 25 g per tutto il periodo di conservabilità (all.1.1) L. monocytogenes <100 ufc/g per tutto il periodo di conservabilità (all. 1.3) ph < 4.4 a w < 0.92 ph <5 e a w <0.94 L. monocytogenes <100 ufc/g per tutto il periodo di conservabilità (all. 1.2) NO L. monocytogenes assente in 25 g prima che l alimento non sia più sotto il controllo del produttore (all. 1.2)

27 RICERCA DI LISTERIA ISO (ricerca qualitativa), applicata ad alimenti pronti per lattanti o a fini medici speciali e alimenti che costituiscono terreno favorevole alla crescita di Listeria monocytogenes, prima che non siano più sotto il controllo diretto di chi li produce. ISO (ricerca quantitativa), applicata ad alimenti pronti che costituiscono terreno favorevole alla crescita di L. monocytogenes,immessi sul mercato durante il loro periodo di conservabilità e alimenti che non costituiscono, invece, terreno favorevole.

28 EN/ISO (metodo qualitativo) Prearricchimento selettivo (25g in 225 ml Half Fraser) 24 h a 30 C Arricchimento selettivo (0.1 ml in 10 ml Fraser) C 48 h Striscio su ALOA 37 C per h Striscio su ALOA 37 C per h Conta colonie tipiche Conta colonie tipiche Conferma Listeria monocytogenes: Attività emolitica Utilizzo di fonti di carbonio CAMP test

29 EN/ISO (metodo quantitativo) Porzione di campione + diluente 1 h a 20 C Striscio su ALOA Conta colonie tipiche C h Conferma genere Listeria: Crescita in TSYEA Test catalasi Colorazione Gram Mobilità Conferma Listeria monocytogenes: Attività emolitica Utilizzo di fonti di carbonio CAMP test

30 Brodo Fraser H 2 O distillata 1000 ml NaCl 20,0 g Na 2 HPO 4 12,0 g Proteose peptone 5,0 g Peptone di caseina 5,0 g Estratto di lievito 5,0 g Estratto di carne 5,0 g LiCl 3,0 g KH 2 PO 4 1,35 g Esculina 1,0 g ph 7,2 Supplementi selettivi e differenziali: -Acriflavina 12,5 mg -Citrato ferrico 500 mg -Acido nalidixico 10 mg

31 Terreno ALOA Peptone di carne Triptone Estratto di lievito Piruvato di sodio Glucosio Na 2 HPO 3 5-bromo-4-cloro-3-indolo β Dglucopiranoside Magnesio glicerofosfato L-α-Fosfatidilinositolo MgSO 4 NaCl LiCl Agar Acqua distallata 18,0 g 6,0 g 10,0 g 2,0 g 2,0 g 2,5 g 0,05 g 1,0 g 2.0 g 0,5 g 5,0 g 10,0 g 15 g ph 7, ml Agenti selettivi: 1. ac.nalidixico 2. ceftazidime 3. polimixina B 4. cicloeximide Colonie di Listeria spp. Alone per attività lipolitica L. monocytogenes (fosfolipasi C)

32 SCELTA PIANO DI CAMPIONAMENTO Il microrganismo può essere misurato da: Presenza o assenza SI Piano a due classi Conta o concentrazione SI Piano a tre classi E possibile accettare la presenza del microrganismo nell alimento? Scegliere n e c per arrivare alla probabilità desiderata NO C = 0 SI C > 0 Scegliere n per arrivare alla probabilità desiderata Scegliere n e c per arrivare alla probabilità desiderata

33 PIANO DI CAMPIONAMENTO Specifica i criteri con i quali sono costituiti i campioni da sottoporre ad analisi. Deve: Definire il campione che deve essere rappresentativo del lotto Stabilire il numero ed il peso delle unità campionarie Stabilire il livello di accettabilità/accettabilità marginale/inaccettabilità del lotto Probabilità di accettare un lotto non conforme Stabilire la frequenza di campionamento Tipo di prodotto Quantità trattata Finalità dell analisi Natura dell alimento ed eventuali trattamenti ai quali è sottoposto Caratteristiche e criteri richiesti Destinazione, modalità d uso e suo significato epidemiologico

34 PIANO DI CAMPIONAMENTO Due classi presenza/assenza n m Aliquote di prodotto componenti il campione (unità campionarie) Valore massimo accettabile per l indice stabilito Valido per la ricerca di patogeni o di metaboliti tossici

35 PIANO DI CAMPIONAMENTO Tre classi Accettabile/Accettabile parzialmente/non accettabile n Aliquote di prodotto componenti il campione (unità campionarie) m Valore limite inferiore di concentrazione microbica/tossina Il risultato è accettabile per valori inferiori M Valore limite superiore di concentrazione microbica/tossina Il risultato è inaccettabile per valori superiori c Numero di unità campionarie il cui valore può cadere nell intervallo m-m. Il risultato è accettabile con riserva Valido per conta di microrganismi indicatori di qualità

36 Campionamento a tre classi Accettabili valori Accettabili con riserva valori Inaccettabili valori < m m-m > M La severità di un tale piano di campionamento dipenderà dai valori attribuiti a n ed a c Fissato c, al crescere di n perché un prodotto sia accettabile deve essere di una qualità migliore Fissato n, al crescere di c le probabilità che un prodotto sia accettabile sono maggiori