BEIA CMV IgG Avidity 21871

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1 BEIA CMV IgG Avidity Edizione 20/04/2013 Solo per uso professionale 0459 TECHNOGENETICS SRL N Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

2 INTRODUZIONE Il kit BEIA CMV IgG Avidity è un test immunoenzimatico quantitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o nel plasma dell avidità degli anticorpi di classe IgG specifici verso il Citomegalovirus umano. SIGNIFICATO CLINICO Il Cytomegalovirus umano (HCMV) appartiene alla famiglia delle Herpersviridae sottofamiglia delle Betaherpesvirinae. Il virione è costituito da un nucleo cilindrico (core) circondato da un filamento di DNA a doppia elica. Questa struttura è rivestita da un Capside e all esterno si rilevano una o più membrane contenenti lipidi. E un virus ubiquitario e specie-specifico. L infezione da Cytomegalovirus può essere primaria (infezione congenita o infezione post-natale) oppure secondaria (riattivazione della replicazione virale) in individui quali le donne in gravidanza, in terapia immunosoppressiva ed in presenza di malattie molto gravi. L infezione congenita, che può essere causata sia da infezione primaria che da reinfezione della donna gravida, è trasmessa per via transplacentale o al momento della nascita ed è responsabile, nei neonati infetti, di gravi manifestazioni cliniche quali sordità, corioretinite, microcefalia, idrocefalo, cardiopatia, epatite, epatosplenomegalia, trombocitopenia, aborto spontaneo. Le infezioni post-natali sono spesso asintomatiche eccetto negli individui immunocompromessi ( AIDS, tumori, trapianti) nei quali l infezione evolve in forma disseminata comportando, in questi individui, severe complicanze (anemia emolitica, encefalite, splenomegalia, morte). La diagnosi dell'infezione da CMV può essere condotta sia con la ricerca diretta della presenza del virus, (viremia, DNAemia, antigenemia) che con la ricerca indiretta della presenza di anticorpi di classe IgG ad IgM. Le immunoglobuline di classe IgM sono rilevabili dopo 1-2 settimane dall'infezione mentre le IgG appaiono circa una settimana più tardi rispetto alle IgM Il dosaggio delle IgM specifiche è importante per diagnosticare la fase acuta dell'infezione, tenendo presente che tali anticorpi possono Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

3 essere prodotti anche nel 50% dei casi di infezione secondaria nei pazienti immunocompromessi. Il dosaggio delle IgG, essendo la presenza di queste immunoglobuline sinonimo di infezione pregressa, permette di distinguere la popolazione protetta da quella non protetta. Numerosi studi hanno ormai dimostrato che la distinzione tra infezione primaria e non primaria, può essere efficacemente conseguita mediante la ricerca delle IgG a differente avidità in quanto l'infezione primaria è caratterizzata dalla presenza di IgG a minore avidità per l'antigene rispetto a quella che caratterizza le IgG prodotte a seguito di successivi stimoli antigenici. La determinazione dell avidità degli anticorpi anti-cmv di classe IgG, permettendo di datare l infezione, risulta particolarmente utile nel confermare od escludere un infezione primaria nei primi mesi di gravidanza. PRINCIPIO DEL METODO Il test BEIA CMV IgG Avidity è un dosaggio immunoenzimatico in micropozzetti. I micropozzetti di polistirene sono rivestiti con l'antigene CMV. Ogni campione da esaminare viene dispensato in due micropozzetti contigui ( a - b ); le IgG del campione si legano alla fase solida formando un complesso antigene-anticorpo. Dopo aver allontanato con un lavaggio tutto quanto non si è legato alla fase solida, si aggiunge al micropozzetto a un tampone di composizione tale da non modificare le forze di legame antigeneanticorpo e nel micropozzetto b un tampone dissociante che è in grado di staccare dalla fase solida prevalentemente gli anticorpi a bassa avidità. Dopo aver eseguito un ulteriore lavaggio, la quantità di IgG rimasta legata alla fase solida viene rilevata mediante l aggiunta di anti-igg umane coniugate con perossidasi (HRP). Dopo allontanamento del coniugato non legato, viene aggiunto il substrato-tmb che, per azione dell enzima presente sulla fase solida, sviluppa una colorazione azzurra. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

4 L aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione e provoca il viraggio del colore da azzurro a giallo. La densità ottica letta a 450/620 nm è direttamente proporzionale alla quantità di IgG specifiche rimaste legate alla fase solida. Nel kit BEIA CMV IgG Avidity la concentrazione degli anticorpi di classe IgG presenti nel micropozzetto a e nel micropozzetto b viene calcolata mediante l'utilizzo di una curva di calibrazione e viene espressa in mu/ml arbitrarie. Il rapporto tra le due concentrazioni fornisce un indice che riflette l avidità degli anticorpi presenti nel campione in esame. CONTENUTO DELLA CONFEZIONE La confezione è sufficiente per 96 determinazioni. Componente SORB A Strip da 8 micropozzetti frazionabili 12x8x1 CAL 0 B Calibratore 0 (0 mu/ml) 1 x 2 ml CAL 1 C1 Calibratore 1 (25 mu/ml) 1 x 2 ml CAL 2 C2 Calibratore 2 (50 mu/ml) 1 x 2 ml CAL 3 C3 Calibratore 3 (100 mu/ml) 1 x 2 ml CAL 4 C4 Calibratore 4 (300 mu/ml) 1 x 2 ml CAL 5 C5 Calibratore 5 (600 mu/ml) 1 x 2 ml CONTROL L D Controllo L 1 x 2 ml CONTROL H E Controllo H 1 x 2 ml DIL SPE F Diluente Campioni 1 x 120 ml SOLN AVID G Soluzione Avidita 1 x 15 ml CONJ H Coniugato 1 x 13,5 ml BUF WASH 20X I Tampone di Lavaggio 1 x 100 ml SUBS TMB J Substrato-TMB 1 x 13,5 ml H2SO4 k Soluzione Stoppante 1 x 25 ml Istruzioni per l uso 1 Certificato d analisi 1 Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

5 A. Strip sensibilizzate Strip sensibilizzate con antigene CMV inattivato, in busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in micropozzetti singoli. B. Calibratore 0 mu/ml Siero umano negativo per anticorpi IgG anti-cmv. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. C. Calibratori 25, 50,100, 300 e 600 mu/ml Siero umano a concentrazioni note di anticorpi IgG anti- CMV. Contengono 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagenti pronti all uso. D. Controllo L Siero umano con anticorpi IgG anti-cmv a bassa avidità. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. E. Controllo H Siero umano con anticorpi IgG anti-cmv ad alta avidità. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. F. Diluente Campioni Soluzione salina tamponata (PBS), proteine e siero umano negativo per anticorpi IgG anti-cmv. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante e Tween 20. Reagente pronto all'uso. G. Soluzione Avidità Tampone CAPS contenente Tiocianato di potassio, Triton X-100 e colorante (giallo). Reagente pronto all'uso. H. Coniugato Soluzione contenente anticorpo monoclonale anti-igg umane, coniugato con perossidasi. Reagente pronto all'uso. I. Tampone di Lavaggio Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene 0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti J. Substrato-TMB Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante (rosa). Reagente pronto all'uso. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

6 K. Soluzione Stoppante Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8 C al riparo dalla luce. Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata sull etichetta. REAGENTI INTERCAMBIABILI Il Tampone di Lavaggio, il Substrato-TMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit della linea BEIA. MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm. Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di micropiastre. Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 200, 500, 1000 µl. Provette monouso e normale vetreria da laboratorio. Acqua distillata o deionizzata. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente (18-25 C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi. Evitare l'essiccamento dei micropozzetti. Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita. Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti diversi. Cambiare il puntale tra un campione e l altro. Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad azzurro, il reagente non deve essere utilizzato. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

7 Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione del campione. Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire. Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle pipette e del lettore. AUTOMAZIONE Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica del kit. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA). Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni possono essere conservati a 2-8 C. In caso contrario aliquotare i campioni e congelarli a -20 C. Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l uso di campioni lipemici, torbidi ed emolizzati. I campioni devono essere opportunamente diluiti con il Diluente Campioni prima del dosaggio. Vedi esecuzione del test. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Tampone di Lavaggio Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata o deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile 15 giorni se conservato a 2-8 C e comunque non oltre la data di scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di Lavaggio concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si solubilizzano portando il reagente a 37 C prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per eseguire i lavaggi dell'analisi in corso. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

8 CICLO DI LAVAGGIO Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi manualmente. 1. Svuotare completamente i micropozzetti. 2. Riempirli con 300 µl di tampone di lavaggio. 3. Svuotare i micropozzetti. 4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli. 5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei micropozzetti al termine del lavaggio. ESECUZIONE DEL TEST Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno minuti a C). 1. Diluire secondo lo schema riportato i campioni in esame con il Diluente campioni. Agitare su Vortex. Concentrazione IgG anti-cmv Diluizione campione Bassa 1:50 Media 1: 200 Alta 1:500-1: 2000 Poiché non esiste uno standard internazionale di riferimento, la concentrazione di anticorpi specifici anti-cmv di un campione è intesa come la risposta relativa rispetto al Cut-off ottenuta con il kit presente in ogni singolo laboratorio. 2. Prelevare il numero di strip necessarie per l'analisi in funzione del numero di campioni in esame, dei Controlli e dei Calibratori (vedi il paragrafo Schema del dosaggio ). Richiudere accuratamente la busta. N.B. Per ogni Controllo e Campione considerare due micropozzetti. Per i calibratori soltanto uno. 3. Dispensare nei rispettivi micropozzetti 100 L di ciascun siero in esame prediluito, dei Controlli e dei Calibratori. 4. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 5. Eseguire la procedura di lavaggio dei micropozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

9 6. Dispensare 200 µl di Tampone di Lavaggio nei micropozzetti contenenti i calibratori e nel primo micropozzetto dei due relativi ai Controlli ed ai Campioni. 7. Dispensare 200 µl di Soluzione Avidità nel secondo micropozzetto relativo ai Controlli ed ai Campioni. 8. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 9. Eseguire la procedura di lavaggio dei micropozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 10. Dispensare in ciascun micropozzetto 100 µl di Coniugato. 11. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 30 minuti. 12. Eseguire la procedura di lavaggio dei micropozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 13. Dispensare in ciascun micropozzetto 100 µl di Substrato-TMB. 14. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 15 minuti. 15. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun micropozzetto 100 µl di Soluzione Stoppante. 16. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm. CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA Le condizioni che consentono l accettazione dei risultati sono : La DO del Calibratore 5 (600 mu/ml) dev essere L indice di avidità (%) del Controllo L e del Controllo H deve rientrare nei limiti di accettabilità riportati nel Certificato di analisi inserito nel kit. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

10 Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra elencate, essa non è validabile e i risultati relativi ai campioni non possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute e alla gestione di eventuali non conformità. La concentrazione di IgG totali relativa ai campioni incogniti è da considerarsi affidabile solo nel caso in cui il valore della DO corrispondente risulti inferiore o uguale al valore della DO del Calibratore 5 e superiore al valore della DO del Calibratore 1 (comunque il valore di IgG Totali deve essere > 50 mu/ml). Se la DO del campione è superiore al Calibratore 5 è necessario ripetere il test utilizzando una diluizione del campione più elevata. Se la concentrazione delle IgG totali del campione è inferiore al Calibratore 1, ripetere il test utilizzando una diluizione del campione inferiore (è sconsigliato l uso di diluizioni inferiori a 1:50). CALCOLO DELL INDICE DI AVIDITÀ Il calcolo è automatico per chi esegue il test con i sistemi automatici utilizzando il programma AVICAL. Nel caso non si disponga di un lettore o di un calcolatore in grado di eseguire automaticamente il calcolo dei risultati, riportare su carta millimetrata lin-lin in ascisse i valori di concentrazione dei calibratori ed in ordinate i rispettivi valori di densità ottica. Collegare i punti a mezzo di segmenti rettilinei e interpolare i valori di densità ottica dei campioni sulla spezzata così ottenuta ricavandone le concentrazioni. Calcolare il valore di Avidità % relativo ad ogni campione e Controllo utilizzando la seguente formula: IgG Residue ( micropozzetto b ) AVIDITA (%) = X 100 IgG Totali ( micropozzetto a ) I seguenti valori devono essere considerati solo come un esempio e non devono essere usati in luogo dei dati ottenuti dall utilizzatore. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

11 Esempio di calcolo : Calibratori mu/ml Densità Ottica Cal Cal Cal Cal Cal Cal Campione A IgG Totali Campione A IgG Residue Campione B IgG Totali Campione B IgG Residue Campione C IgG Totali Campione C IgG Residue Avidità % INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi: Avidità % INTERPRETAZIONE < > 45 BASSA AVIDITA Infezione primaria da CMV contratta negli ultimi tre mesi MEDIA AVIDITA Possibile infezione da CMV contratta negli ultimi sei mesi ALTA AVIDITA Esclusione di infezione primaria da CMV contratta negli ultimi tre mesi Va tenuto presente che: - il test, successivo a quello di prima istanza che ha rilevato la presenza di anticorpi specifici di classe IgG, determina l avidità di questi ultimi. E un indice utile, ma non univoco ai fini della datazione dell infezione; Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

12 - una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo test, ma va fondata sull insieme dei dati clinici disponibili. Dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione. PRESTAZIONI DEL KIT Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo previsto dal fabbricante. PRESTAZIONI CLINICHE Sono stati testati 73 campioni sequenziali da 24 soggetti con infezione primaria HCMV. Tutti i campioni prelevati entro 3 mesi dall inizio dell infezione (54/54) hanno evidenziato un indice di avidità < 25 %. Sono stati testati 102 campioni da soggetti con immunità da pregressa infezione. 93 campioni hanno evidenziato un indice di avidità > 45 %; 5 presentavano un avidità tra il 42-45%, mentre 4 presentavano un avidità compresa tra il 35-39%. LIMITE DI RILEVAZIONE Prove condotte in replicato sul Calibratore 0 indicano il limite di rilevazione in 1.1 mu/ml. SPECIFICITÀ ANALITICA Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10 mg/ml di emoglobina, fino a 1 mg/ml di bilirubina e fino a 30 mg/ml di trioleina. L uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati viene comunque sconsigliato. RIPETIBILITÀ La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata valutando un campione a bassa avidità (< 25%), un campione a media avidità (25-45%) ed un campione ad alta avidità (>45%). Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

13 I campioni sono stati replicati 3 volte per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse. Sono stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori al 10% per tutti i campioni. LIMITAZIONI Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgG specifiche. PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le operazioni previste per l'esecuzione del test. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell area di laboratorio designata. Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca. Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni indossando guanti monouso e camici. Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio. Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici di lavoro eventualmente contaminate. Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento secondo le norme vigenti. Controllare periodicamente il grado di contaminazione dell'ambiente di lavoro e degli operatori. Reagenti contenenti siero I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati e trovati negativi per HbsAg, anti-hcv ed anticorpi anti-hiv. Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele. Reagenti pericolosi Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritante per gli occhi e per la pelle S26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un medico. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

14 SCHEMA DEL DOSAGGIO Preparare i reattivi Diluire i campioni con il Diluente Campioni Dispensare 100 L di ogni Calibratore (0-600 mu/ml) in singolo 100 L di ogni Controllo (L-H) in doppio 100 L di campione prediluito in doppio, Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 200 L di Tampone di Lavaggio nei pozzetti dei calibratori e nel pozzetto dei Controlli e dei campioni Dispensare 200 L di Soluzione Avidità nel pozzetto b dei Controlli e dei campioni Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Coniugato Incubare 30 minuti a T.A. (18-25 C) Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Substrato-TMB Incubare 15 minuti a T.A. (18-25 C) Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm A B C D E F G H S0 C H P4 P8 P12 P16 P20 P24 P28 P32 P36 P40 S1 C H P4 P8 P12 P16 P20 P24 P28 P32 P36 P40 b b b b b b b b b b b S2 P1 P5 P9 P13 P17 P21 P25 P29 P33 P37 P41 S3 P1 P5 P9 P13 P17 P21 P25 P29 P33 P37 P41 b b b b b b b b b b b S4 P2 P6 P10 P14 P18 P22 P26 P30 P34 P38 P42 S5 P2 P6 P10 P14 P18 P22 P26 P30 P34 P38 P42 b b b b b b b b b b b C L P3 P7 P11 P15 P19 P23 P27 P31 P35 P39 P43 C L P3 P7 P11 P15 P19 P23 P27 P31 P35 P39 P43 b b b b b b b b b b b b Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

15 BEIA CMV IgG Avidity Version 20/04/2013 For professional use only 0459 TECHNOGENETICS SRL Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

16 INTENDED USE The BEIA CMV IgG Avidity kit is a quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the avidity detection of IgG antibodies to Cytomegalovirus, in human serum or plasma samples. CLINICAL RELEVANCE Human Cytomegalovirus (HCMV) is a virus belonging to the group of Herpesviridae, a subfamily of the Betaherpesvirinae. Virion has a cylindric nucleus (core) surrounded by double-stranded DNA. This structure is covered by a Capside and one or more membranes containing lipides can be found externally. Is a host-specific and ubiquitarian virus. CMV infection can be primary (congenital or postnatal) as well as secondary (viral replication reactivation) in individuals like pregnant women, people being treated with immunosuppressant drugs, people suffering from serious diseases. Congenital infection, which can be caused both by a primary infection or by a re-infection in pregnant women, is transmitted transplacentally or during delivery and is responsible in infected newborns of complications which may include hearing loss, vision impairment, microcephaly, hydrocephalus, hearth disease, hepatitis, hepatosplenomegaly, thrombocytopenia, miscarriage. For healthy persons who acquire CMV after birth there are no symptoms but in immunocompromised patients (AIDS patients, organ transplant recipients, patients with cancer) CMV infection can cause serious disease with manifestations such as hemolytic anemia, encephalitis, splenomegaly and death. Diagnosis of infection can be made directly determining the presence of the virus (viremia, DNAemia, antigenemia) and indirectly measuring IgG and IgM class antibodies to CMV. IgM antibodies can be detected 1-2 weeks after infection while IgG appear about a week later than IgM. Specific IgM antibodies titers are important for the diagnosis of acute infections, considering that such antibodies can be also produced in 50% of secondary infections in individuals with impaired immune system. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

17 The detection of the IgG antibodies in a patient s serum helps to determine his immune status as these antibodies persist in the body for the lifetime of the patient. Many studies have demonstrated that the detection of low avidity IgG antibodies is indicative of primary infection while in reactivated CMV infections high avidity IgG antibodies are produced. As the avidity test estimates the time of acquisition of CMV infection it is particularly useful to confirm or exclude CMV primary infection in early pregnancy. PRINCIPLE OF THE ASSAY The BEIA CMV IgG Avidity kit is a quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the avidity detection of the specific IgG antibodies to CMV virus. The microwells are coated with CMV antigen. Each specimen is dispensed into two adjoining microwells (well a and well b ). During the first incubation, only IgG anti-cmv specific antibodies present in serum or plasma bind to the inner surface of the wells coated with the CMV antigen making an antigen-antibody complex. After the incubation the wells are washed to remove non-reactive serum components, and a Wash Buffer is dispensed into wells a and an Avidity Solution into wells b that is able to remove from the wells prevalently the antibody with low avidity. After a further washing cycle, an anti-human IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) is dispensed into the wells. This conjugate binds only to the specific IgG anti-cmv, bound in the antigen-igg complex present on the wells. After the incubation the wells are washed to remove the no bound conjugate, and a chromogenic substrate solution is dispensed into the wells developping a blue coloration due to the HRP bound on the wells. The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution (H2SO4 1 N) which changes to yellow the blue color developed into the wells. The O.D. at 450/620 nm is directly proportional to the amount of specific IgG bound to the wells. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

18 The IgG antibodies concentration present both in the well and in the well b is calculated by a calibration curve expressed as arbitrary mu/ml. The ratio between the two concentration is an index of the antibodies avidity present in the samples. KIT COMPONENTS Package size: 96 tests. Component SORB A Coated Strip 12x8x1 CAL 0 B Calibrator 0 (0 mu/ml) 1 x 2 ml CAL 1 C1 Calibrator 1 (25 mu/ml) 1 x 2 ml CAL 2 C2 Calibrator 2 (50 mu/ml) 1 x 2 ml CAL 3 C3 Calibrator 3 (100 mu/ml) 1 x 2 ml CAL 4 C4 Calibrator 4 (300 mu/ml) 1 x 2 ml CAL 5 C5 Calibrator 5 (600 mu/ml) 1 x 2 ml CONTROL L D Control L 1 x 2 ml CONTROL H E Control H 1 x 2 ml DIL SPE F Sample Diluent 1 x 120 ml SOLN AVID G Avidity Solution 1 x 15 ml CONJ H Conjugate 1 x 13,5 ml BUF WASH 20X I Wash Buffero 1 x 100 ml SUBS TMB J Substrate-TMB 1 x 13,5 ml H2SO4 k Stop Solution 1 x 25 ml Package Insert 1 Certificate of analysis 1 A. Coated Strip Breakable strips coated with inactivated CMV antigen in sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

19 B. Calibrator 0 mu/ml Negative human serum for IgG antibodies anti-cmv. Contains 0.09% w/w Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. C. Calibrators 25, 50,100, 300, 600 mu/ml Human serum, containing IgG antibodies anti-cmv different known concentrations. Contain 0.09% w/w Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. D. Control L Human serum, containing IgG antibodies anti-cmv with low avidity. Contains 0.09% w/w Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. E. Control H Human serum, containing IgG antibodies anti-cmv with high avidity. Contains 0.09% w/w Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. F. Sample Diluent Buffered salt solution (PBS). Contain protein, negative human serum for IgG anti-cmv, 0.09% w/w Sodium azide and Tween 20. Ready to use reagent. G. Avidity Solution Buffered solution (CAPS). Contains Potassium Thiocyanate Triton-100 and yellow dye. Ready to use reagent. H. Conjugate Monoclonal anti-human IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase. Ready to use reagent. I. Wash Buffer Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % Kathon CG and Tween 20. J. Substrate-TMB Tetramethylbenzidine H2O2/(TMB) in stabilizing buffered solution. Contains pink dye. Ready to use reagent. K. Stop Solution 1N Sulphuric acid solution. Ready to use reagent. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

20 STORAGE OF REAGENTS Store all reagents at 2-8 C avoiding exposure to light. Do not use reagents after the expiry date indicated on the label. INTERCHANGEABLE REAGENTS Do not mix different lots of any reagent within an individual assay except the Wash Buffer, the Substrate-TMB and the Stop Solution. MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED Microplate reader with 450/620 nm filters. Manual or automated microplate washing device. Precision pipettes with disposable tips 10,100,200,1000 L. Disposable pipettes and normal glassware. Distilled or deionized water. WARNINGS AND PRECAUTIONS Bring all reagents to room temperature (18-25 C) before use. Only take the quantity necessary for the assay. Avoid wells drying. Use clean glassware. Use a clean disposable pipette tip for each reagent. Use a clean disposable pipette tip for each sample. If the Substrate-TMB shows a change from pink to blue colour, discard the reagent. For repeated assays, each time provide for new diluted samples. Every analytical run should include control samples in order to validate the results, according to criteria and procedures established by each laboratory. Periodical maintenance and calibration of pipettes and microplate reader are required. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

21 AUTOMATION The test can be performed on automated ELISA processor. Please refer to specific instrument manual for proper applications. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The test can be performed on serum or plasma (heparin EDTA). Specimens may be stored refrigerated at 2-8 C up to 5 days. For longer storage they should be aliquoted and stored frozen at 20 C. Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed, lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be pre-diluted with Sample Diluent prior to assay. See assay protocol. PREPARATION OF REAGENTS Wash Buffer (20 X) Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or deionized water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when stored at 2-8 C; in any case, do not use it after expiry date printed on the original label. If crystallization occurs in the concentrated Wash Buffer, warm the solution to 37 C before diluting. Only dilute the quantity necessary for the assay. WASHING CYCLES Both using a microplate washer and washing the plate manually, perform the following steps. 1. Empty the wells 2. Fill them with 300 µl of Wash Buffer. 3. Empty the wells 4. Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles 5. Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the washing cycles. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

22 ASSAY PROTOCOL Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least minutes at C. 1. Dilute the samples to be assayed following the table below. Shake on Vortex. IgG anti-cmv Concentration Sample Dilution Low 1:50 Medium 1: 200 High 1: 500 and 1:2000 As an international standard preparation isn t available, the anti- CMV specific concentration of a sample has to be intended as the relative value to the Cut-off of the test, used by each laboratory. 2. Select the number of strips required for the assay according to the number of samples to be assayed, Controls and the Calibrators (see paragraph Summary of protocol below). Reseal the pouch. Note: Two wells for each Control and sample; One for each Calibrator 3. Dispense 100 µl of each Calibrator, Control and of the diluted sample. 4. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. 5. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 6. Dispense 200 µl of Wash Buffer into the wells of the Calibrators and into the well of each Control and sample. 7. Dispense 200 µl of Avidity Solution into the well b of each Control and sample. 8. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. 9. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 10. Dispense 100 µl of Conjugate in each well. 11. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 30 minutes. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

23 12. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 13. Dispense 100 µl of Substrate-TMB in each well. 14. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 15 minutes. 15. Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µl of Stop Solution into each well. 16. Read the optical density (O.D.) in bi-chromatism at 450/620 nm. CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS RUN VALIDATION CRITERIA Criteria used to validate the obtained results are the following: The OD for Calibrator 5 (600 mu/ml) must be 1,000 The Avidity index (%) of the Control H and Control L must be in the range reported in the enclosed Quality Control Data Sheet. If the above criteria are not met, the run is invalid and the results cannot be reported without a documented critical review of the data. The non conformity must be addressed and treated according to each laboratory s Quality Assurance procedures. Each lab should establish and follow its own internal Quality Control procedures and use the QC results to validate runs and manage non conformities. IgG Total results of the unknown samples must be consider reliable only when the OD value of the sample is lower or equal the OD value of the Calibrator 5 and higher the OD value of the Calibrator 1 (the IgG Total value must be > 50 mu/ml). If the OD value of the sample is higher of OD value of the Calibrator 5, please repeat the test using a higher dilution of the sample. If the OD value of the sample is lower of OD value of the Calibrator 1, please repeat the test using a lower dilution of the sample; ( it s not suggested to utilise a dilution lower than 1:50). CALCULATION OF RESULTS Calculation is automatically performed when using an automated processor utilising the AVICAL program. In case an automated system is not available, plot the mean OD value of each Calibrator (ordinate) against Calibrator concentration (abscissa) on suitable Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

24 graph paper, linking points by straight segments. Concentrations of Controls and samples can then be read from the fragmented curve by interpolation with the OD. In order to correlate the analytical results to the Avidity (%) of the sample, results should be determined using the following formula: Residual IgG well b Avidity (%) = x 100 Total IgG well The data below show typical results for the test. These data are intended as an example only and should not be used to calculate results from another run. Calibrators mu/ml O.D. Avidity % Cal Cal Cal Cal Cal Cal Sample A Total IgG a Sample A Residual IgG b Sample B Total IgG a Sample B Residual IgG b Sample C Total IgG a Sample C Residual IgG b INTERPRETATION OF RESULTS Results from our clinical trials, performed on samples representative of the European population, suggest the following interpretative criteria: Avidity % < > 45 LOW AVIDITY INTERPRETATION Primary CMV infection occurred during in the last three months MEDIUM AVIDITY Primary CMV infection occurred during in the last six months HIGH AVIDITY Exclude CMV primary infection within the last three months Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

25 Please consider that: - After the first level test that points out the presence of specific IgG to CMV, the Avidity test determines the IgG Avidity. It s an useful index but cannot per se and univocally be referred to as dating of infection; - a medical decision cannot be made on the basis of a single test result but should be grounded on all the available clinical data; discrepancies in clinical data should be clarified prior to final decisions. PERFORMANCE DATA Warning: Data below do not represent the performance specifications of the kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is within such specifications, as intended by the manufacturer. CLINICAL PERFORMANCES 73 samples, coming from a follow up of 24 subjects with primary CMV infection diagnosed were evaluated. All the samples (54/54) drawed during in the last three from the starting infection, were observed with an avidity index < 25 %. 102 specimens coming from immunocompetent subjects with a past CMV infection were evaluated. 93 specimens were observed with an avidity index > 45%, 5 samples showed an avidity between 42 and 45% while 4 samples showed an avidity between 35 and 39%. DETECTION LIMIT: Trials in replicate on the Calibrator 0 lead to calculate the detection limit: 1.1 mu/ml. ANALYTICAL SPECIFICITY No interference has been observed in samples with hemoglobin up to 10 mg/ml, bilirubin up to 1 mg/ml, triolein up to 30 mg/ml. Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be used. REPEATABILITY The within-run and run-to-run variability were determined using a sample with low avidity (< 25 %), a sample with intermediate avidity ( %) and a sample with high avidity (> 45 %). Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

26 These serum samples were tested 3 times per single run in 12 different analytical runs. Coefficients of variation lower than 10% have been obtained for all three samples. LIMITATIONS Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens may affect the detectable levels of specific IgG. GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the procedural directions. Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab. Do not pipette solutions or samples by mouth. Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and samples. Avoid direct contact. Wash hands thoroughly after assay. Thoroughly clean working area with proper detergent solutions. Collect solid and liquid waste material in proper containers and provide for disposal according to the local regulations. Periodically check contamination level of operators and rooms. Reagents containing serum All components of human origin have been tested and found negative for HbsAg, anti-hcv and anti-hiv antibodies. Since no known test can guarantee, however, that products derived from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other infectious diseases, these reagents should be handled as hazardous material. Hazardous Reagents Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritating to eyes and skin. S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water, and seek for medical advice. Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

27 SUMMARY OF PROTOCOL Prepare reagents Pre-dilute samples with Sample Diluent Dispense: 100 L of Calibrators (0-600 mu/ml) in single 100 L of Controls (L,H) in duplicate 100 L of pre-diluted samples in duplicate Incubate 30 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Dispense 200 L of Wash Buffer into wells of the Calibrators and into the wells of each Control and sample Dispense 200 L of Avidity Solution into the wells b of each Control and sample Incubate 30 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Conjugate Incubate 30 minutes at R.T. (18-25 C) Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Substrate-TMB Incubate 15 minutes at R.T. (18-25 C) Dispense 100 L of Stop Solution Read the O.D. at 450/620nm A B C D E F G H S0 C H P4 P8 P12 P16 P20 P24 P28 P32 P36 P40 S1 C H P4 P8 P12 P16 P20 P24 P28 P32 P36 P40 b b b b b b b b b b b S2 P1 P5 P9 P13 P17 P21 P25 P29 P33 P37 P41 S3 P1 P5 P9 P13 P17 P21 P25 P29 P33 P37 P41 b b b b b b b b b b b S4 P2 P6 P10 P14 P18 P22 P26 P30 P34 P38 P42 S5 P2 P6 P10 P14 P18 P22 P26 P30 P34 P38 P42 b b b b b b b b b b b C L P3 P7 P11 P15 P19 P23 P27 P31 P35 P39 P43 C L P3 P7 P11 P15 P19 P23 P27 P31 P35 P39 P43 b b b b b b b b b b b b Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013

28 REFERENCE - BIBLIOGRAFIA - Blackburn NK., Besselaar TG., Schoub BD. and O Connell KF.1991 : Differentiation of primary cytomegalovirus infection from reactivation using urea denaturation test for measuring antibody avidity. Journal of Medical Virology 33: Bodèus M., Feyder S. and Goubau P Avidity of IgG antibodies distinguishes primary from non-primary cytomegalovirus infection in pregnant women. Clin. Diagn. Virol.9 : Griffiths PD., Stagno S., Pass RF., Alford CH : Infection with cytomegalovirus during pregnancy : specific IgM antibodies as a marker of recent primary infection. Journal of Infectious Diseases 145 : Grangeot-Keros I., et al Value of cytomegalovirus ( CMV ) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: Lennette EH Laboratory Diagnosis of Viral Infections Second Edition. New York : Dekker M, Inc. - Lutz E., Ward KN., Gray JJ. 1994: Maturation of antibody avidity after primary human cytomegalovirus infection is delayed in immunosuppressed organ transplant patients. Journal of Medical Virology 44: Nelson CT., Demmler GJ Cytomegalovirus infection in the pregnant mother, fetus and newborn infant. Clin. Perinatol. 24 : Pass Rf., Griffiths PD., August AM : Antibody response to cytomegalovirus after renal transplantation : comparison of patients with primary and recurrent infections. Journal of Infectious Diseases 147 : Rasmussen L., Kelsall D., Nelson R., Carney W., Hirsch M., Winston D., Preisatis J., Merican TC. 1982: Virus-specific IgG and IgM antibodies in normal and immunocompromised subjects infected with cytomegalovirus. Journal of Infectious Diseases 145: Pag BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013