HerpeSelect 2 ELISA IgG (In Italiano)
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- Bartolommeo Pellegrino
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1 (In Italiano) HerpeSelect 2 ELISA IgG REF EL0920G Rev. K Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) per il rilevamento di anticorpi umani di classe IgG anti HSV-2 Per uso diagnostico in vitro DESTINAZIONE D USO Il Focus Diagnostics HerpeSelect 2 ELISA IgG e un test indicato per l analisi qualitativa della presenza nel siero umano di anticorpi di classe IgG anti-hsv-2. Insieme con il Focus Diagnostics HerpeSelect 1 ELISA IgG, questo test e indicato per la diagnosi presuntiva di infezioni da HSV in adulti sessualmente attivi e in donne in stato di gravidanza. Il saggio può essere utilizzato in maniera manuale o insieme ad un sistema automatizzato, come indicato dall inserto nella confezione. L utilizzatore è responsabile delle caratteristiche d esecuzione, quando viene usato un sistema automatizzato. L uso di questo saggio non e stato testato per la popolazione pediatrica, per esami neonatali, per screening neonatale o per pazienti immunocompromessi. RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST L HSV e un patogeno diffuso in tutto il mondo e produce una grande varieta di malattie. L HSV infetta neonati, bambini e adulti; inoltre, dalla quarta decade d età, piu del 90% della popolazione adulta mostra la presenza di anticorpi anti-hsv 1. La trasmissione dell HSV puo essere prodotta dal contatto con secrezioni infette di individui affetti, asintomatici o sintomatici. L herpes simplex e stato classificato in due sierotipi distinti: l HSV-1 e l HSV-2. L HSV-1 e generalmente associato ad infezioni alla lingua, alla bocca, alle labbra, alla faringe e agli occhi, mentre l HSV-2 e associato principalmente ad infezioni genitali e neonatali. Negli USA la maggioranza degli individui sessualmente attivi con ulcere genitali ha contratto l herpes genitale 2. Le ulcere genitali sono state associate ad un aumento del rischio di infezioni da HIV 2. L herpes genitale e solitamente causato dall HSV-2, in una minoranza di casi la prima infezione genitale (5 30 %) è dovuta all HSV-1. 2 Molti casi di herpes genitale sono trasmessi da persone che non sanno di essere infette o che non riconoscono sintomi lievi o atipici. I centri per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC) affermano che l informazione e un aspetto molto importante nella gestione di pazienti affetti da herpes genitale 2. Una delle conseguenze piu gravi dell herpes genitale e l herpes neonatale 3. Senza terapia, il tasso di mortalita di bambini non curati che sviluppano l infezione supera il 70% 3-4, e meta dei sopravvissuti riportano danni neurologici 4. Quasi tutte le infezioni neonatali da HSV-2 sono dovute al passaggio attraverso il canale del parto infetto 2. La maggior parte delle madri (70%) che trasmette l HSV ai propri neonati e priva di sintomi al momento del parto 5. Il rischio di trasmissione e piu elevato quando la madre e affetta da infezione genitale primaria o iniziale (>50%) 6, mentre il rischio e minore quando l infezione e ricorrente (<5%) 7-10 e quando la madre non sta ancora producendo anticorpi IgG anti-hsv 8. I centri per il controllo e la prevenzione raccomandano che la prevenzione dell herpes neonatale deve essere favorita dalla prevenzione delle infezioni da HSV genitale durante la tarda gravidanza. Donne a rischio i cui partner sono affetti da HSV orale o genitale oppure non conoscono il loro stato infettivo, dovrebbero evitare contatti sessuali genitali e orali non protetti durante la tarda gravidanza. 2 Le madri sono a piu alto rischio di contrarre un infezione genitale primaria o iniziale quando risultano sieronegative a uno o entrambi i tipi di HSV ed il loro partner e sieropositvo. 8 Le infezioni primarie da HSV-1 contratte attraverso il contatto diretto (principalmente non genitale) solitamente si sviluppano nella prima decade d età 4. Quando l infezione primaria e clinica, la classica presentazione della gengivostomatite erpetica e costituita da una seria infezione delle gengive, della bocca, della lingua, della faccia e/o della faringe. L infezione HSV-1, dovuta alla riattivazione del virus, e ricorrente nella forma herpes labialis (vesciche o febbri) o herpes oculare che si sviluppa in piu del 40% degli individui HSV-1 sieropositivi 11. Una precedente infezione da HSV-1 orale non protegge dall infezione da HSV-2 genitale 11. Le infezioni primarie da HSV-2, solitamente contratte con contatti sessuali, sono raramente presenti prima dell inizio dell attività sessuale. Quando l infezione primaria da HSV-2 e clinica, si manifesta nella forma classica di herpes genitale, caratterizzata da lesioni distribuite in entrambi i genitali e accompagnata da febbre, linfadenopatia e disuria. Le infezioni da HSV-2 causano circa l 85% dei casi sintomatici di HSV genitale, le rimanenti infezioni sono da HSV-1 3. Poiche e difficile che l HSV-1 produca infezioni genitali ricorrenti, il 99% dei casi di herpes genitale ricorrente e dovuto all HSV-2 3. Dopo l infezione primaria da HSV-1, il virus colonizza i neuroni sensoriali e l infezione latente puo riattivarsi causando infezioni sub-cliniche o cliniche. Poiche le infezioni ricorrenti possono essere sub-cliniche e asintomatiche, il virus silente e una significativa riserva per la trasmissione del virus 1 e, quindi, sono possibili inattese trasmissioni del virus difficili da prevenire 3. L isolamento del virus, il test di direct fluorescent antibody (DFA), e la sierologia possono essere utilizzate per diagnosticare infezioni da HSV. Le colture positive e la DFA sono le metodiche piu sicure; inoltre, l isolamento del virus permette di classificare il virus stesso. Comunque, la DFA e le colture presentano diversi svantaggi, tra cui la durata del tempo della coltura, la collezione del campione, le difficolta di trasporto e la complessita delle procedure 1-2. La maggior parte dei metodi sierologici per testare lo stato dell HSV usano lisati virali come antigeni. Inoltre, a causa della significativa cross-reattivita tra l HSV-1 e l HSV-2, i saggi che utilizzano lisati virali non sono in grado di distinguere tra le infezioni da HSV-1 e quelle da HSV-2 3. Poiche molti adulti hanno avuto una precedente infezione da HSV-1, spesso senza sintomi primari o ricorrenti, e spesso impossibile determinare con sicurezza lo stato del siero per l HSV-2 se si usa un saggio basato sul lisato virale 3. Recentemente, sono stati prodotti alcuni saggi sierologici HSV tipo-specifici basandosi sulla differenza significativa tra la proteina gg-1 dell HSV-1 e la proteina gg-2 dell HSV-2 3. Il test ELISA della Focus Diagnostics utilizza come antigene proteine ricombinanti purificate tipospecifiche gg-2 immobilizzate su pozzetti di polistirene. PRINCIPIO DEL SAGGIO Nel saggio ELISA IgG Focus Diagnostics HerpeSelect 2, i pozzetti di polistirene sono rivestiti con l antigene ricombinante gg-2. I campioni di siero diluiti e i controlli sono incubati nei pozzetti per permettere all anticorpo specifico, presente nei campioni, di reagire con l antigene. I ligandi non specifici sono rimossi dai lavaggi; quindi viene aggiunto l anticorpo anti-igg umana coniugato con la perossidasi di rafano, che reagisce con le IgG specifiche. L eccesso di anticorpo coniugato e rimosso dai lavaggi. Si aggiunge il substrato dell enzima e il cromogeno e si lascia sviluppare il colore. Dopo avere aggiunto la reazione di stop, l intensita del colore viene quantificata con uno spettrofotometro leggendo la densita ottica (OD). Le letture della densita ottica dei diversi campioni vengono paragonate con i riferimenti delle letture dei cut-off per valutare i risultati.
2 Pag. 2 MATERIALE FORNITO Il Kit Focus Diagnostics HerpeSelect 2 ELISA IgG contiene materiale sufficiente per 96 determinazioni. Portare i reagenti a temperatura ambiente prima di utilizzarli. Una volta aperti, tutti i materiali vanno conservati tra i 2 e gli 8 C fino alla data di scadenza presente sull etichetta. 96 pozzetti rivestiti con l antigene Ag Antigen Wells, 96 wells REF EL strisce da 8 pozzetti di polistirene. Ogni pozzetto e rivestito con l antigene gg-2 ricombinante (peso molecolare di kilodaltons). Ogni striscia puo essere divisa in pozzetti singoli per un uso efficiente Prima di aprire i pacchetti sigillati con le strisce si consiglia di lasciarli riposare a temperatura ambiente, per evitare la condensa. IgG coniugate,16 ml CONJ IgG IgG Conjugate, 16 ml REF EL0917 Una vial di anticorpi di capra anti IgG umana (specifici per la catena pesante) purificati per affinita e coniugati con perossidasi di rafano. Contiene proteine, tampone e conservanti. IgG Controllo fortemente positivo, 0,3 ml CONTROL ++ IgG High Positive Control, 0.3 ml REF EL0908 Una vial di siero umano per ogni livello di controllo. Contiene conservante. Deve essere diluita prima dell uso (vedi il paragrafo sottostante: Campioni, Controlli e Calibrazioni preparatorie). IgG Controllo debolmente positivo, 0,3 ml CONTROL + IgG Low Positive Control, 0.3 ml REF EL0909 Una vial di siero umano per ogni livello di controllo. Contiene conservante. Deve essere diluita prima dell uso (vedi il paragrafo sottostante: Campioni, Controlli e Calibrazioni preparatorie). Controllo negativo, 0,3 ml CONTROL Negative Control, 0.3 ml REF EL0904 Un vial di siero umano per ogni livello di controllo. Conitene 0,1% sodio azide come conservante. Deve essere diluita prima dell uso (vedi il paragrafo sottostante: Campioni, Controlli e Calibrazioni preparatorie). IgG Cut-Off Calibratore, 0,3 ml CONTROL CAL IgG Cut-Off Calibrator, 0.3 ml REF EL0907 Un vial di siero umano per ogni livello di controllo. Conitene 0,1% sodio azide come conservante. Deve essere diluita prima dell uso (vedi il paragrafo sottostante: Campioni, Controlli e Calibrazioni preparatorie). Diluente per i campioni, 100 ml DIL SPEC HerpeSelect ELISA Sample Diluent, 100 ml REF EL0928 Una vial di proteine, detergente, e PBS con conservanti. Stabile tra i 2 e gli 8 C fino alla data di scadenza presente sull etichetta. Lasciare a temperatura ambiente prima dell uso. 10X Tampone di lavaggio, 100 ml BUF WASH 10X Wash Buffer, 100 ml REF EL0405 Una vial di PBS contenente detergente con conservanti. Diluire ad 1X prima dell uso. Per preparare una soluzione 1X di tampone di lavaggio, miscelare 100 ml di 10X tampone di lavaggio con 900 ml di acqua distillata (o deionizzata) e dissolvere tutti i cristalli. Si raccomanda l uso di acqua purificata della massima qualita. E stato osservato che alcuni tipi di acqua deionizzata contengono residui che possono interferire con il saggio. Agitare bene fino a quando la soluzione e ben miscelata e i cristalli sono dissolti. Substrato, 16 ml SUBS TMB Substrate Reagent, 16 ml REF EL0009 Una vial di tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno in tampone. Un colore blu scuro indica contaminazione con perossidasi; in questo caso usare una bottiglia nuova. Soluzione di stop, 16 ml SOLN STOP Stop Reagent, 16 ml REF EL0105 Una vial di acido solforico 1 M. Nastro sigillante Due fogli di nastro sigillante. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI 1. acqua distillata o deionizzata. 2. spruzzette da 250 o da 500 ml o un apparecchio per il lavaggio automatico delle piastre. 3. cilindro graduato da 1 L 4 12 x 75 mm provette di vetro di borosilicato o equivalenti. 5. pipette da 10 L a 100 L con puntali monouso (per saggi con piu di 48 pozzetti si consiglia l uso di una pipetta da 100 L con 8 canali). 6. pipetta da 1 ml o erogatore. 7. pipetta da 5 ml. 8. timer. 9. carta da banco o carta assorbente. 10. lavandino. 11. vortex o equivalente. 12. spettrofotometro per piastre ELISA, lungezza d onda= 450 nm. 13. processore ELISA automatizzato (facoltativo). VALIDITA E CONSERVAZIONE 1. I kit ed i reagenti sono validi fino alla fine del mese indicato sull etichetta se conservati tra i 2 e gli 8 C. 2. Non utilizzare il kit o i reagenti del kit dopo la data di scadenza. 3. Non esporre a luce intensa durante la conservazione e l incubazione.
3 4. Portare i reagenti a temperatura ambiente prima dell uso. HerpeSelect 2 ELISA IgG Pag. 3 AVVERTENZE E PRECAUZIONI: 1. Questo kit e destinato solo ad un uso diagnostico in vitro. 2. Tutti i derivati del sangue devono essere maneggiati come potenzialmente infetti. I materiali da cui questo prodotto (compresi i controlli) deriva sono stati testati per l antigene di superficie dell epatite B, per l antigene dell epatite C e per gli anticorpi dell HIV-1/2 (AIDS) con metodiche approvate dall FDA e sono risultati negativi. Comunque, poiche nessun test puo escludere al 100% che i prodotti derivati da sangue umano non trasmettano questi o altri agenti infettivi, tutti i controlli, i campioni di siero e gli oggetti che entrano in contatto con questi campioni devono essere considerati potenzialmente infetti e quindi decontaminati o eliminati secondo le disposizioni per i rifiuti contaminati. I Centers for Disease Control and Prevention e i National Institutes of Health raccomandano che la manipolazione degli agenti potenzialmente infetti venga eseguita al livello di biosicurezza 2. 12,18 3. I pozzetti con l antigene sono prodotti con antigeni gg-2 ricombinante. Dopo avere aggiunto i campioni dei pazienti o i controlli, le strisce devono essere considerate potenzialmente infette e trattate di conseguenza. 4. Sodio azide ad una concentrazione dello 0,1% e stato aggiunto ad alcuni reagenti come agente antibatterico. Per evitare la formazione di metalli azidici esplosivi nelle tubature di piombo e rame, questi reagenti (vedi il soprastante paragrafo Materiali Forniti) devono essere eliminati nelle fogne solo se diluiti con abbondante quantita di acqua. Dove possibile, si raccomanda l uso di scarichi privi di rame e di piombo. Occasionalmente si consiglia di decontaminare lo scarico con sodio idrossido (ATTENZIONE: caustico), lasciandolo agire per 10 minuti e facendo poi scorrere molta acqua. 5. Non sostituire o mescolare reagenti di kit differenti o di altri fornitori. 6. Seguire solo i protocolli descritti in questo inserto. Tempi di incubazione o temperature diverse da quelle specificate possono falsare i risultati. 7. Cross-contaminazioni di campioni di pazienti diversi possono anch esse falsare i risultati. Aggiungere i campioni e maneggiare le striscie attentamente, per evitare di mescolare i sieri di pozzetti adiacenti nella piastra. Versare attentamente. 8. La contaminazione batterica dei campioni di siero o dei reagenti puo falsare i risultati. Usare metodiche asettiche per evitare contaminazioni. 9. Effettuare il saggio a temperatura ambiente (20 25 C). 10. Usare le pipette nel modo corretto e nella stessa maniera durante tutta la procedura, per favorire la correttezza e la riproducibilita dei valori. 11. La soluzione di stop contiene acido solforico. Non mettere a contatto con la pelle o gli occhi. Se esposti al contatto, sciacquare con molta acqua. COLLEZIONE DEI CAMPIONI E PREPARAZIONE Il siero e il materiale usato per il saggio. Non e stata valutata la compatibilita del saggio con altri campioni. Sieri iperlipidici, inattivati con il calore, emolizzati o contaminati possono falsare i risultati, percio non devono essere utilizzati. Collezione dei campioni e maneggiamento Il sangue deve essere raccolto asetticamente da personale qualificato tramite venipunture. 12 Lasciare coagulare il campione a temperatura ambiente prima di centrifugarlo. Trasferire asetticamente il siero in un contenitore ben chiuso per la conservazione. Il siero separato non deve rimanere a 22 C per piu di 8 ore. Se non si intende portare a termine il saggio prima dello scadere delle 8 ore, refrigerare il campione a 2 8 C. Se il saggio non viene portato a termine prima delle 48 ore e se i campioni devono essere spediti, congelare a 20 C o a temperature inferiori. Scongelare e agitare bene i campioni prima dell uso. Campioni, controlli e preparazione della calibrazione Diluire ogni campione, controllo e calibratore 1:101. Per esempio, segna le provette e versa 1 ml di diluente in ogni provetta. Aggiungi 10 L di campione, controllo o calibratore in ogni provetta contenente 1 ml di diluente, quindi mescola bene usando il vortex. PROCEDURA PER IL TEST 1. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell uso. Rimuovere il pacchetto con i pozzetti con l antigene dal posto freddo dove sono conservati. Per evitare la condensa, prima di aprire i pacchetti sigillati con le strisce di pozzetti si consiglia di lasciarli riposare a temperatura ambiente. Se la piastra non viene completamente utilizzata, rimettere le strisce nel pacchetto con desiccante e sigillare completamente. Conservare i pozzetti non utilizzati tra i 2 e gli 8 C (Nota bene: alla fine del saggio conservare il supporto per l utilizzo delle rimanenti strisce.). 2. Ammollo FACOLTATIVO di 5 minuti. Se si tralascia l ammollo, andare al Passaggio 3. Riempire i pozzetti con il tampone di lavaggio 1X e tenere a bagno per 5 minuti. Travasare (o aspirare) i pozzetti dell antigene e lavare energicamente con acqua corrente per rimuovere il tampone di lavaggio 1X. Tamponare i pozzetti dell antigene vuoti, a faccia in giù, su salviette di carta pulita o su carta assorbente, per rimuovere ogni traccia del tampone di lavaggio 1X. 3. Pipettare 100 L del diluente nel pozzetto usato come bianco e 100 L di campione diluito, controllo o calibratore (vedi il capoverso soprastante Campioni, controlli e preparazione della calibrazione) nei pozzetti appropriati. (Nota bene: per saggi con piu di 48 pozzetti si consiglia di pipettare 250 L di ogni campione diluito in una micropiastra vuota nella posizione corrispondente a quella del pozzetto per l ELISA. Quindi i campioni possono essere facilmente trasferiti nei pozzetti con l antigene con una pipetta mulicanale da 100 L con 8 o 12 canali). 4. Sigillare i pozzetti con parafilm (o tenerli in una camera umidificata), e incubarli per 60 ± 1 minuti a temperatura ambiente (20 25 C). 5. Rimuovere il parafilm (o rimuovere i pozzetti dalla camera umida) e svuotare il contenuto dei pozzetti nel lavandino o in un contenitore per i rifiuti liquidi. 6. Riempire ogni pozzetto con un leggero spruzzo di soluzione di lavaggio con una spruzzetta, quindi svuotare il contenuto dei pozzetti nel lavandino o in un contenitore per i rifiuti. 7. Ripetere il lavaggio (passaggio 6) per altre 2 volte. 8. Battere vigorosamente sul bancone da lavoro i pozzetti per rimuovere la soluzione di lavaggio. Trasferire i pozzetti faccia in giu su carta da banco o carta assorbente per rimuovere i residui della soluzione di lavaggio. 9. Pipettare 100 L di coniugato in tutti i pozzetti usando una multipipetta da 100 L con 8 o 12 canali. 10. Sigillare i pozzetti con parafilm (o tenerli in una camera umidificata), e incubarli per 30 ± 1 minuti a temperatura ambiente (20 25 C). 11. Ripetere i lavaggi dal punto 5 al Pipettare 100 L di substrato in tutti i pozzetti, usando una pipetta milticanale da 100 L con 8 o 12 canali. Iniziare a misurare il tempo di incubazione partendo dall aggiunta del substrato al primo pozzetto. (Nota bene: non versare il substrato nello stesso modo usato per il coniugato). 13. Incubare per 10 ± 1 minuti a temperatura ambiente (20 25 C). 14. Bloccare la reazione aggiungendo a tutti i pozzetti 100 L di soluzione di stop utilizzando una pipetta multicanale da 100 L con 8 o 12 canali. Aggiungere la soluzione di stop nella stessa sequenza e con la stessa velocita usate nell aggiunta del substrato. Nei pozzetti positivi, il colore deve virare dal blu al giallo. 15. Asciugare con delicatezza i bordi esterni dei pozzetti con carta assorbente per rimuovere gocce che potrebbero interferire con la lettura allo spettrofotometro. Non sfregare con la carta assorbente perche potrebbe graffiare la superficie ottica del pozzetto. (Nota bene: le grosse bolle sulla superficie della soluzione possono influire sulle letture OD). 16. Misurare l assorbanza di ogni pozzetto entro un ora da quando la reazione e stata bloccata. Settare lo spettrofotometro per piastre ad una lunghezza d onda di 450 nm. Azzerare lo strumento con i pozzetti bianchi, o correggere tutte le OD manualmente sottraendo le letture dei bianchi.
4 Pag. 4 CONTROLLO QUALITA Nel test di ogni piastra (o striscia o pozzetti della stessa piastra) includere il calibratore e i tre controlli. Se vengono usate diverse piastre nello stesso saggio, includere il calibratore e i tre controlli in ogni piastra. Si raccomanda che, fino a quando l utente non abbia familiarizzato con il kit, tutti i campioni, i controlli e i calibratori vengano analizzati in duplicati con il calibratore analizzato due volte per un totale di quattro pozzetti. Se vengono usati singoli pozzetti, i calibratori devono essere analizzati in triplice copia, includendo almeno un pozzetto bianco (contenente solamente diluente) al fine di calibrare lo strumento. I calibratori sono stati pensati per evidenziare nel modo migliore la differenza tra i sieri negativi e quelli positivi. Benche il valore dell assorbanza puo differire tra i singoli test e tra differenti laboratori, il valore medio dei pozzetti calibratori deve essere tra 0,100 e 0,700 unita OD. Tutte le repliche dei calibratori non devono differire dal valore medio per piu di 0,10 unita OD. Riportare i risultati relativi ai calibratori come valori indice. Per calcolare i valori indice, dividere i valori della densita ottica (OD) dei campioni per la media dei valori dell assorbanza dei calibratori. 1. Il valore indice del controllo altamente positivo deve essere maggiore di 3,5. 2. I valori indice del controllo debolmente positivo devono essere compresi tra 1,5 e 3,5. 3. I valori indice del controllo negativo devono essere inferiori a 0,8. Nel caso il calibratore o i controlli non siano conformi a questi parametri, i risultati del test del paziente devono essere considerati non validi e il test deve essere ripetuto. Lo scopo dei controlli negativi e positivi e valutare che i reagenti non siano malfuzionanti. Il controllo positivo non deve essere usato come un cut-off ma solo per assicurare la funzionalita dei reagenti. I calibratori e i controlli possono essere sintetizzati usando gli stessi lotti di materie prime. Controlli ulteriori possono essere effettuati secondo l indicazione o i requisiti locali, statali e/o di regolamenti federali o di organizzazioni accreditate. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEL TEST Riportare i risultati dei pazienti come Valori Indice relativi ai calibratori: per calcolare i Valori Indice, dividere i valori della densita ottica (OD) dei campioni per la media dei valori dell assorbanza dei calibratori. > 1.10 Positivo. Un valore indice >1,10 e presuntivo della presenza di anticorpi IgG anti HSV-2. < 0.90 Negativo. Un valore indice <0,90 indica che non sono stati trovati anticorpi IgG anti HSV e 1.10 Equivoco. Un valore indice 0,90 ma 1,10 e considerato un risultato equivoco. Questi campioni devono essere riesaminati. Se nella ripetizione del test il risultato rimane equivoco, un secondo prelievo deve essere fatto diverse settimane dopo per valutare un aumento del titolo degli anticorpi IgG 14,15. In alternativa, il campione puo essere analizzato usando una metodica diversa come il western blot. 1. Tutti i risultati di questo e di altre sierologie devono essere correlati ad un quadro clinico, a dati epidemiologici e ad altri dati a disposizione del medico curante per la valutazione del paziente. 2. La prevalenza dell infezione puo falsare la validita diagnostica del test. 3. Come riportato per altri test sierologci, risultati negativi non escludono la presenza della malattia herpes simplex. Il tempo necessario al siero per produrre anticorpi al seguito di un'infezione primaria varia negli individui, il campione può essere infettato prima della comparsa degli anticorpi rilevabili 15. Sono noti casi di siero-reversione 15,16. Quando appropriato, per esempio in casi di recente infezione da herpes simplex, il test deve essere ripetuto o eseguito con un saggio differente. 2,14 Se nel nuovo test, il risultato rimane negativo, il test deve allora essere ripetuto con un secondo campione dopo 4 12 settimane 14, Si possono avere falsi negativi quando il virus infettante e gg deficiente, poiche non e riconosciuto se l antigene del saggio è glicosilato come le cellule di mammifero. Liljekvist ha dimostrato che circa lo 0,2% (5/2400) degli HSV-2 isolati sono gg deficienti Come in altri test sierologici, si possono presentare falsi positivi. Si consiglia la ripetizione del test o l uso di un diverso tipo di test in alcune situazioni, come per esempio pazienti con una bassa possibilità di infezione da HSV 2, Un singolo caso positvo indica che precedentemente e avvenuta una esposizione immunologica; il livello di risposta anticorpale o la classe degli anticorpi prodotti non puo essere usato per determinare l attivita dell infezione o lo stadio 7. L ampiezza del valore indice al di sopra del calibratore non indica la quantita totale di anticorpi presente. 8. La sierologia non distingue tra infezioni orali o genitali. Quando necessario, si raccomanda la cultura per individuare l'origine dell'infezione. Comunque, può accadere che le culture producano falsi negativi per l'hsv, specialmente in pazienti con infezioni ricorrenti o con lesioni in via di guarigione 2. LIMITI DI APPLICAZIONE 1. L uso di questo saggio non e stato previsto per persone non qualificate. 2. L uso di questo saggio non e stato progettato per escludere la presenza di malattie con sintomi simili, e.g., Candida albicans, specie Bacteriodi, G. vaginali e differenti specie di Mobiluncus. Si consiglia invece, l uso di colture o metodiche appropriate. 3. L uso di questo saggio non e` adatto per matrici differenti dal siero, per la determinazione visiva di risultati o per il monitoraggio della terapia HSV-2. VALORI ATTESI Un tecnico ha valutato il saggio con sieri mascherati, archiviati e non selezionati da 1) adulti sessualmente attivi con eta superiore ai 14 anni (n = 246) e 2) da donne gravide (n = 241). Il metodo di riferimento e il Western blot di una universita del nord ovest del Pacifico. La prevalenza osservata e i valori ipotetici previsti per le due popolazioni sono mostrati nelle tabelle sottostanti. I valori positivi previsti diminuiscono proporzionalmente con la prevalenza dell infezione HSV come mostrato nella tabella sottostante. Per i calcoli si considera che Focus Diagnostics HerpesSelect 2 ELISA IgG ha 1) un ipotetica sensibilita del 96,1% & un ipotetica specificita del 97,0% (adulti sessualmente attivi) e 2) un ipotetica sensibilta del 100% e un ipotetica specificita del 96,1% (donne gravide). Prevalenza osservata in adulti sessualmente attivi e donne gravide Popolazione HSV-1 Stato del siero Prevalenza osservata WB Focus ELISA Adulti sessualmente attivi* neg 68.5% 67.2% % 32.4% Donne gravide neg 75.6% 72.3% % 27.3% * Esclusi 5 western blot atipici e 1 ELISA equivoca. Esclusi 3 western blot atipici e 1 ELISA equivoca.
5 Pag. 5 Valori della prevalenza Prevalenza Adulti sessualmente attivi Donne gravide PPV NPV PPV NPV 50% 97.0% 97.0% 96.2% 96.1% 40% 95.5% 98.0% 94.5% 97.4% 30% 93.2% 98.7% 91.7% 98.3% 25% 91.4% 99.0% 89.5% 98.7% 20% 88.9% 99.2% 86.5% 99.0% 15% 85.0% 99.5% 81.9% 99.3% 10% 78.1% 99.7% 74.0% 99.6% 5% 62.8% 99.8% 57.4% 99.8% Nota: Popolazioni di adulti sessualmente attivi e madri gravide in differenti aree geografiche possono produrre una differente distribuzione della frequenza. Ogni laboratorio dovrebbe stabilire la distribuzione di frequenza per la propria specifica popolazione di pazienti. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI Cut-off Calibratore Nel disegnare il saggio, il cut-off e stato convalidato usando cinque pannelli di sieri (n = 383) per valutarne inizialmente l attendibilita : 1) campioni di laboratori clinici (n = 94); 2) campioni di laboratori clinici che erano risultati negativi con test ELISA (n = 37); 3) campioni di laboratori clinici con insoliti risultati con western blot o immunoblot; 4) campioni clinici spagnoli di STD (n = 159) e 5) campioni di un univerista del nord-ovest del Pacifico (n = 62). Il metodo di riferimento e il western blot HSV-2 di un laboratorio clinico autorizzato. Escludendo 7 western blot atipici e 4 ELISA equivoche, il Focus HSV-2 ELISA IgG e il western blot concordano nel 94,3% (231/245) dei casi positivi e nel 87,4% (111/127) di quelli negativi. Sensibilita relativa e specificita relativa per le donne gravide Un tecnico esterno ha testato la sensibilita relativa e la precisione relativa del sistema con sieri di donne gravide (n = 241). In sequenza i sieri sono stati mandati al laboratorio, archiviati e mascherati. Il metodo di riferimento e l HSV-2 Western blot (WB) di una univerista del nord-ovest del Pacifico. Dei 3 WB atipici, un ELISA era equivoca e 2 negative. Dei 58 WB positivi, per l ELISA 58 erano positivi. Dei 180 WB negativi, per l ELISA 172 erano negativi e 7 positivi e uno equivoco. Sensibilita relativa e precisione relativa per donne gravide(n =241) Sensibilita relativa al Western blot 100% (58/58) % Precisione relativa al Western blot 96.1% (172/179) % * Escluso tre Western blot atipici e un ELISA equivoco. Sensibilta relativa e precisione relativa per gli adulti sessualmente attivi Un tecnico esterno ha testato la sensibilita relativa e la precisione relativa del sistema con sieri di adulti sessualmente attivi con piu di 14 anni di eta (n = 246). I sieri sono stati mandati in successione al laboratorio, archiviati e mascherati. Il metodo di riferimento e l HSV-2 Western blot (WB) di una universita del nord-ovest del Pacifico. Dei 5 WB atipici, per l ELISA 2 erano equivoci, 2 negativi e uno positivo. Dei 76 WB positivi, per l ELISA 73 erano positivi, 3 negativi. Dei 165 WB negativi, per l ELISA 159 erano negativi, 5 positivi e uno equivoco. Sensibilta relativa e precisione relativa per gli adulti sessualmente attivi (n = 246) Sensibilita relativa al Western blot 96.1% (73/76) % Precisione relativa al Western blot 97.0% (159/164) % * Esclusi 5 Western blot atipici e un ELISA equivoco. Sensibilita relativa per colture positive Un tecnico esterno ha testato la sensibilita relativa e la precisione relativa del sistema con sieri di pazienti con colture positive (n = 63). Il metodo di riferimento comprende la coltura (infezioni) e l HSV-2 Western blot (anticorpi) di una univerista del nord-ovest del Pacifico. Dei 5 WB atipici, per l ELISA 2 erano equivoci, 2 negativi e 1 positivi. Delle 63 colture positive, per l ELISA 61 erano positivi e 2 negativi e per WB 62 erano positivi e uno negativo. Dei 62 WB positivi, l ELISA era positivo in 61 casi e negativo per uno. Sensibilita relativa per le colture (n = 63) Caratteristica % (EL/WB o Colture) 95% CI Sensibilita relativa alla coltura 96.8% (61/63)* % Precisione relativa al Western Blot 98.4% (61/62)* % * Dei due ELISA negativi, uno era positivo per WB e l altro negativo per WB. Confronti con le tabelle del CDC Le seguenti informazioni derivano da tabelle di sieri del CDC e testate dalla Focus Diagnostics. I risultati sono presentati come medie per esprimere ulteriori informazioni sulle prestazioni di questo saggio con un gruppo di sieri mascherati e caratterizzati. Questo non implica l approvazione da parte del CDC. Il gruppo consiste di campioni positivi nel 37% dei casi positivi e nel 63% dei casi negativi. Focus Diagnostics HerpeSelect 2 ELISA IgG ha mostrato di essere in accordo con il CDC nel 100% dei casi. Dei risultati ottenuti dalla Focus Diagnostics, c e una concordanza con il 100% dei casi positivi e del 100% con quelli negativi.
6 Pag. 6 Sensibilita relativa con una popolazione a bassa prevalenza Un tecnico esterno ha testato la sensibilita relativa e la precisione relativa del sistema con sieri di studenti di college che hanno dichiarato di non avere avuto rapporti sessuali (n = 81) e avendo una prevalenza di anticorpi anti HSV-2 del 2% (4/186) 13. Il metodo di riferimento e l HSV-2 Western blot di una univerista del nord-ovest del Pacifico. Un WB atipico era negativo per l ELISA. Dei 78 WB negativi, per l ELISA 77 erano negativi, 1 positivo. Dei 2 WB positivi, per l ELISA 2 erano positivi. Sensibilita relativa con una popolazione a bassa prevalenza (n = 81) Sensibilita relativa al Western blot 98.7% (77/78) % Precisione relativa al Western blot 100% (2/2) % * Escluso un WB atipico. Tipo specificita con western blot HSV-1 positivi Un tecnico esterno ha testato la sensibilita relativa e la precisione realtiva del sistema con sieri della popolazione sopra descritta con HSV-1 positivi al Western blot e HSV-2 negativi al Western blot (n = 287): donne gravide, adulti sessualmente attivi, individui con bassa prevalenza e colture HSV-1 positive. Dei 287 HSV-1 positivi al WB e HSV-2 negativi al WB, per l ELISA 276 erano negativi, uno equivoco e 10 positivi. Tipo specificita con western blot HSV-2 positivi (n = 287) Tipo-specificita relativa al WB 96.5% (276/286) % Tipo cross-reattivita relativa al WB 3.5% (10/286) % * Escluso un ELISA equivoco Cross-reattivita con virus tassonomicamente simili Focus ha valutato la cross-reattivita usando sieri (n = 27) che erano 1) HSV siero-negativi secondo il test ELISA di un altra ditta autorizzata dalla FDA e 2) IFA IgG positivi per virus tassonomicalmente simili: CMV, EBV VCA, HHV6 e VZV. Discrepanze tra i risultati dell ELISA della ditta autorizzata dalla FDA e quelli delle apparecchiature Focus sono stati analizzati con uno specifico Western blot da una grossa universita situata nel nord ovest degli Stati Uniti. Cross-reattivita con virus tassonomicamente simili (n = 27) IFA IgG Pos % Focus EL Neg (n/n)* 95% CI CMV 91.7% (11/12) % EBV VCA 90.9% (20/22) % HHV6 90.9% (20/22) % VZV 90.5% (19/21) % Totale 90.9% (70/77) % * Escluso un 3 WB positivi e una discrepanza che non e stata analizzata perche il volume era insufficiente Riproducibilita intra-saggio ed inter-saggio Un tecnico interno ha valutato la riproducibilita intra-saggio e inter-saggio del test analizzando sette campioni in duplicato, due volte al giorno per 20 giorni, per un totale di 40 corse. Due serie di campioni erano duplicati mascherati Riproducibilita all interno dello stesso lotto Un tecnico interno ha valutato la riproducibilita all interno dello stesso lotto. Sono stati analizzati 5 campioni in 3 giorni separati e con tre lotti differenti. Per un lotto i campioni sono stati analizzati in triplicato e in duplicato per gli altri due. Ognuno dei tre lotti aveva un lotto differente per i pozzetti con l antigene. Riproducibilita tra laboratori diversi Un tecnico interno e due laboratori esterni hanno valutato la riproducibilita del saggio. Ognuno dei tre laboratori ha analizzato sette campioni in triplicato in tre giorni differenti. Tre punti sono stati esclusi perche era stato analizzato per un giorno un campione sbagliato (al posto del 27). Riproducibilita Inter- & Intra-saggio Inter-lotto Inter-laboratorio Campione Indice medio Intra-saggio %CV Inter-saggio %CV Indice medio Indice %CV Indice medio Media del Lab %CVs %CV medie del Lab 21* % 15.9% % % 17.3% 26* % 12.4% NA NA % 20.7% 22** % 6.2% % % 7.8% 27** % 6.3% NA NA % 8.8% % 5.5% % % 7.1% % 7.9% % % 10.8% % 6.9% % % 4.5% * #21 & #26 sono lo stesso materiale. ** #22 & #27 sono lo stesso materiale. % Accordo tra i Metodi Manuale e Automatizzato (n = 257) Un investigatore interno ed uno esterno hanno analizzato la % di accordo tra il metodo automatizzato HerpeSelect ed il metodo manuale, durante il porcesso CLIA di validazione per un importante laboratorio situato nella California del Sud.L investigatore esterno ha selezionato in maniera sequenziale e testato poi manualmente 257 campioni. Ciascun campione proveniva da un individuo adulto ed è stato sottoposto al test per l HSV. 255 campioni provenivano dagli Stati Uniti e 2 campioni da paesi stranieri. Di questi 257 campioni, il metodo manuale ha identificato 175 negativi, 3 equivoci e 79 positivi. Dei 175 negativi al test manuale, il metodo automatizzato ne ha confermati il 99.4 % (174/175). Dei 3 equivoci al test manuale, lo 0% è stato confermato dal metodo automatizzato (0/3). Dei 79 postivi al metodo manuale, il metodo automatizzato ne ha confermati il 98.7% (78/79). In totale, i due metodi hanno dato risultati in accordo al 98.1% (252/257). Dei 5 campioni in disaccordo, 2 si sono risolti in favore del metodo automatizzato, mentre gli altri due non hanno avuto risoluzione.
7 Pag. 7 % Accordo tra i Metodi Manuale e Automatizzato Interpretazione* % Accordo 95% CI Negativo 99.4% (174/175) % Equivoco 0% (0/3) % Positivo 98.7% (78/79) % Totale 98.1% (252/257) % * Interpretazione tramite metodo manuale. Riproducibilità utilizzando uno strumento automatizzato Un investigatore interno ha valutato la riproducibilità inter- ed intra- saggio dll apparecchio, utilizzando uno strumento automatizzato. 10 campioni sono stati analizzati in triplicato, in 3 giorni diversi. Il metodo manuale e quello automatizzato sono risultati in accordo al 98.9% (89/90). Un punto del campione 3 non rientrava nell indice. (162 deviazioni standard dalla media). Stabilità dopo apertura dei reagenti Un investigatore interno ha valutato la stabilità dei reagenti, una volta aperti ed utilizzati con uno strumento automatizzato. Il kit era stato utilizzato nello studio di riproducibilità inter- ed intra-saggio (vd. sopra), richiuso, conservato a 2 8 C per almeno 30 giorni e quindi utilizzato ancora per ritestare i medesimi campioni. È stata valutata una percentuale di accordo dell indice pari al 100%, rispetto all analisi effettuata all apertura dei reagenti.. BIBLIOGRAFIA 1. Aurelian, L. Herpes Simplex Viruses In Specter, S & G Lancz (eds.). Clinical Virology Manual. 2 nd Ed. Elsevier, New York. (1992). 2. Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines MMWR 2002:5 1 (No. RR-6). 3. Arvin, A, C Prober. Herpes Simplex Viruses In Murray, P, E Baron, M Pfaller, F Tenover, and R Yolkenet (eds.). Manual of Clinical Microbiology. 6th Ed. ASM, Washington, D.C. (1995). 4. Whitley, R. Herpes Simplex Viruses In Fields, B, D Knipe, P Howley, et al. (eds.). Fields Virology 3 rd Ed. Lippincott-Raven, Philadelphia. (1996). 5. Whitley, R, A Nahmias, A Visintine, C Fleming, C Alford. Natural history of herpes simplex virus infection of mother and newborn. Pediatrics 66: (1980). 6. Whitley, R. Herpes simplex, in J Klein & J Remington (ed.), Infectious diseases of the fetus and newborn infants, 3 rd ed., p Prober, C, W Sullender, L Yasukawa, D Au, A Yaeger, A Arvin. Low risk of herpes simplex virus infections in neonates exposed to the virus at the time of vaginal delivery to mothers with recurrent herpes simplex virus infections. N Engl J Med 3 16: (1987). 8. Brown, Z, S Sleke, J Zeh, J Kopelman, A Maslow, R Ashley, D Watts, S Berry, M Herd, L Correy. The acquisition of herpes simplex virus during pregnancy. N Engl J Med 337: (1997). 9. Prober CG, Corey L, Brown ZA et al The management of pregnancies complicated by genital infections with herpes simplex virus. Clin Infect Dis. 15: Brown ZA, Benedetti J, Ashley R et al Neonatal herpes simplex virus infection in relation to asymptomatic maternal infection at the time of labor. N Engl J Med. 324: Stewart, J. Herpes Simplex Virus In Rose, N, E demacario, J Fahey, H Friedman, G Penn (eds.). Manual of Clinical Laboratory Immunology. 4 th Ed. ASM Press, Washington, D.C. (1992). 12. NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2 nd Ed. (1999). 13. Corey, L., A. Wald, New Developments in the Biology of Genital Herpes, in Clinical Management of Herpes Viruses, p Ashley RL. Performance and use of HSV type-specific serology test kits. Herpes 2002 Jul;9(2): Ashley-Morrow R, Krantz E, Wald A. Time Course of Seroconversion by HerpeSelect ELISA After Acquisition of Genital Herpes Simplex Virus Type 1 (HSV-1) or HSV-2. Sex Transm Dis Apr;30(4): Cherpes TL, Ashley RL, Meyn LA, Hillier SL. Longitudinal reliability of focus glycoprotein G-based type-specific enzyme immunoassays for detection of herpes simplex virus types 1 and 2 in women. J Clin Microbiol 2003 Feb;41(2): Liljeqvist et al. Typing of Clinical Herpes Simplex Virus Type 1 and Type 2 Isolates with Monoclonal Antibodies. J Clin Micro 37: (1999). 18. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4 th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO mdi Europa GmbH, Langenhagener Str. 71, Langenhagen-Hannover, La Germania INFORMAZIONI PER ORDINARE Telefono: (800) (U.S.A. only) (562) (International) Fax: (562) PI.EL0920G-IT Rev. K Data scritta: 31 Marzo 2011 ASSISTENZA TECNICA Telefono: (800) (U.S.A. only) (562) (International) Fax: (562) Visitate il nostro sito web a: Cypress, California USA
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