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1 QUANTA Lite aps/pt IgG ELISA (anti-fosfatidilserina e protrombina) QUANTA Lite aps/pt IgM ELISA (anti-fosfatidilserina e protrombina) Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Codice Prodotto: , Uso previsto I kit IgG aps/pt QUANTA Lite e/o IgM aps/pt QUANTA Lite sono dei dosaggi di immunoassorbimento enzimatico semiquantitativo e qualitativo (ELISA) per la determinazione degli anticorpi di classe IgG e IgM al complesso di fosfatidilserina/protrombina (PS/PT) nel siero o nel plasma, previsti per l uso come ausilio nella diagnosi di alcuni disturbi trombotici autoimmuni, come la sindrome da antifosfolipidi (APS) e dei disturbi secondari al lupus eritematoso sistemico o a malattie lupus-simili, unitamente ad altri risultati clinici e di laboratorio. Introduzione e descrizione del test Gli anticorpi antifosfolipidi (apl) rappresentano un vasto gruppo di immunoglobuline di notevole importanza clinica dovuta alla loro associazione con la trombosi arteriosa e/o venosa, aborto spontaneo ricorrente, disturbi neurologici, ipertensione polmonare e trombocitopenia 1. Gli anticorpi anticardiolipina (ACA) determinati da ELISA e l anticoagulante del lupus (LA) rilevato mediante test di coagulazione sono stati i test più affermati e standardizzati per la diagnosi della sindrome antifosfolipidica (APS). La famiglia di apl è stata recentemente allargata per includere un gruppo eterogeneo di autoanticorpi la cui specificità è diretta contro le proteine legate ai fosfolipidi o contro il loro complesso con fosfolipidi 2-5. Tra le proteine legate ai fosfolipidi, la più studiata è la β 2 -glicoproteina I (β 2 GPI). La β 2 GPI contiene gli epitopi criptici per il legame ACA che vengono esposti quando la β 2 GPI si lega ai fosfolipidi caricati negativamente come la cardiolipina o immobilizzati sulle piastre in plastica ELISA irradiate 6. Un certo numero di studi ha evidenziato la significatività dell anticorpo anti-β 2 GPI mediante ELISA come dosaggio alternativo al test ELISA ACA convenzionale con una più elevata specificità 7-11 e questo metodo è stato adottato dalla comunità clinica. La protrombina (fattore II) è un altra proteina legata ai fosfolipidi con un peso molecolare di , presente nel plasma normale ad una concentrazione approssimativa di 2,5 μmol/l, che svolge un attività procoagulante mediante un complesso protrombinasi, attivando la conversione di fibrinogeno in fibrina 12. L anticoagulante del lupus ha dimostrato di essere diretto contro le proteine multiple del plasma, incluse la β 2 GPI e la protrombina 13,15. Nel 1995, Arvieux et al 16 hanno dimostrato la possibilità di rilevare gli apt mediante ELISA in campioni positivi all anticoagulante del lupus (LA) mediante piastre irradiate in modo simile al dosaggio anti-β 2 GPI. È stata ipotizzata un analogia con l anti-β 2 GPI: gli apt sono stati in grado di riconoscere gli epitopi criptici o i neoepitopi formatisi durante l interazione della protrombina con la superficie anionica. Esistono alcuni rapporti relativi alla prevalenza di apt in pazienti con anticorpi antifosfolipidi (apl). Arvieux et al 16 hanno riportato una prevalenza del 55,4% in pazienti positivi al LA. Galli et al 17 hanno riscontrato apt nel 58% del pazienti con APS. Petri et al hanno riscontrato preliminarmente che gli apt hanno un potenziale valore predittivo per gli eventi trombotici in 100 pazienti con LES 18. Horbach et al 19 hanno studiato la significatività clinica degli apt in 175 pazienti con LES, riscontrando che gli apt IgG e IgM erano più frequenti in pazienti con un anamnesi di trombosi ed erano associati alla trombosi venosa, ma non a quella arteriosa. I titoli degli apt IgM sono risultati leggermente più elevati in pazienti con trombosi rispetto a pazienti senza trombosi, mentre non risultavano differenze tra i due gruppi relativamente ai titoli degli apt IgG. Vaarala et al 20 hanno dimostrato un valore predittivo pari a un aumento di 2,5 volte nel rischio di infarto miocardico o di morte cardiaca in uomini di mezza età con livelli elevati di apt. L associazione tra apt e LA è stata ampiamente studiata. Nel 1988, Fleck et al 21 hanno dimostrato la presenza di attività dell anticoagulante del lupus degli apt. È stato inoltre dimostrato che gli anticorpi responsabili dell attività di LA in certe condizioni sperimentali si legano alla protrombina 14,22. Inoltre, Bevers et al 14 hanno dimostrato che la protrombina era necessaria per l espressione dell attività di LA in 11/16 campioni di plasma positivi al LA impoveriti di ACA, con la conseguenza che almeno il 69% dell attività del LA dipende dagli anticorpi legati alla protrombina. Il meccanismo mediante il quale tali anticorpi agiscono rimane oscuro. È stato ipotizzato che gli apt inibiscano il rilascio di prostaciclina delle cellule endoteliali mediato dalla trombina e che gli apt inibiscano l attivazione della proteina C 2. Recentemente è stato ipotizzato che la protrombina si leghi ai fosfolipidi anionici esposti sulle cellule endoteliali e che gli apt attivino le cellule endoteliali e inducano le sostanze procoagulanti attraverso la protrombina 23. Bertolaccini et al 24 hanno esaminato la presenza di apt IgG e IgM mediante ELISA in pazienti con LES. Tali anticorpi sono stati riscontrati nel 28% dei pazienti con LES con un 18% di risultati positivi per IgG, un 14% di risultati positivi per IgM e con un 4% di pazienti positivi a entrambi. In questo gruppo è stata riscontrata un associazione tra la presenza di apt e l occorrenza di eventi vascolari dal momento che il 53% dei pazienti con LES con apt presentava un anamnesi con un evento trombotico. In questo studio 24 è stata inoltre rilevata un associazione degli apt con la presenza di ACA e anti-β 2 GPI, benché gli autori affermino che il test ELISA apt non deve essere considerato come un sostituto dei dosaggi di LA, ACA o β 2 GPI convenzionali. In questi ultimi anni è emerso un quadro più preciso relativamente alla rilevanza clinica degli anticorpi anti-apt. Ora sappiamo che gli anticorpi più strettamente associati con la sindrome antifosfolipidica e il LA sono realmente diretti verso un complesso di fosfolipidi anionici quali la fosfatidilserina e la protrombina (PS/PT) piuttosto che la PT sola. Questi dati sono chiaramente descritti in un articolo apparso recentemente su una rivista 25. In un certo numero di studi è stato dimostrato che i dosaggi anti-ps/pt hanno una rilevanza clinica significativa e sono correlati più strettamente con le caratteristiche cliniche della sindrome antifosfolipidica e l anticoagulante del lupus Principi della procedura I kit IgG e IgM aps/pt (anti-fosfatidilserina/protrombina) QUANTA Lite sono immunodosaggi enzimatici (ELISA) per il rilevamento degli anticorpi IgG e IgM nel siero o nel plasma umano al complesso di fosfatidilserina/protrombina mediante la tecnica sandwich ELISA. I pozzetti delle piastre a micropozzetti in plastica vengono rivestiti con un complesso di PS/PT purificato e quindi stabilizzati. In incubazione, il siero contenente anticorpi IgG o IgM anti-ps/pt si lega con la PS/PT. La proteina non legata viene rimossa mediante lavaggio e nei pozzetti viene aggiunto un coniugato anti-igg o IgM umane marcato con perossidasi di rafano (HRP). Dopo l incubazione, il coniugato non legato viene rimosso mediante lavaggio. Viene quindi aggiunto un substrato di perossidasi, che subisce un cambiamento di colore in presenza dell enzima del coniugato. Dopo aver interrotto la produzione enzimatica del prodotto colorato, la presenza o assenza dell anticorpo anti-protrombina viene determinata spettrofotometricamente misurando e comparando l intensità di colore che si sviluppa nei pozzetti del paziente con quella di una curva di calibrazione a cinque punti. 1

2 Reagenti Piastra di micropozzetti di polistirene ELISA rivestita di un antigene purificato, PS/PT, (12-1 x 8 pozzetti), con supporto in involucro contenente un essiccante 2. ELISA Controllo negativo, 1 fiala di tampone contenente conservante e siero umano senza IgG anticorpi umani alla 3. ELISA Controllo IgG aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti PS/PT, prediluito, 1,2 ml 4. ELISA Calibratore A IgG aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti 5. ELISA Calibratore B IgG aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti 6. ELISA Calibratore C IgG aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti 7. ELISA Calibratore D IgG aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti 8. ELISA Calibratore E IgG aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgG anti 9. Coniugato a PS/PT IgG HRP (capra), anti IgG umane, 1 fiala di colore blu contenente tampone, stabilizzanti proteici e conservante, 10 ml 10. Diluente per campioni HRP Plus, 1 fiala di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzanti proteici con calcio e conservante, 50 ml 11. Tampone di lavaggio HRP Plus, 1 fiala di concentrato 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20 e calcio, 25 ml, Per istruzioni relative alla diluizione vedere la sezione dedicata ai metodi. 12. Cromogeno TMB, 1 fiala contenente stabilizzanti, 10 ml 13. Soluzione di arresto HRP, acido solforico 0,344M, 1 fiala incolore O Piastra di micropozzetti di polistirene ELISA rivestita di un antigene purificato, PS/PT, (12-1 x 8 pozzetti), con supporto in involucro contenente un essiccante 2. ELISA Controllo negativo, 1 fiala di tampone contenente conservante e siero umano senza IgM anticorpi umani alla 3. ELISA Controllo IgM aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti PS/PT, prediluito, 1,2 ml 4. ELISA Calibratore A IgM aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti 5. ELISA Calibratore B IgM aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti 6. ELISA Calibratore C IgM aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti 7. ELISA Calibratore D IgM aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti 8. ELISA Calibratore E IgM aps/pt, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi da siero umano IgM anti 9. Coniugato aps/pt IgM HRP (capra), anti IgM umane, 1 fiala di colore verde contenente tampone, stabilizzanti proteici e conservante, 10 ml 10. Diluente per campioni HRP Plus, 1 fiala di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzanti proteici con calcio conservante, 50 ml 11. Tampone di lavaggio HRP Plus, 1 fiala di concentrato 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20 e calcio, 25 ml, Per istruzioni relative alla diluizione vedere la sezione dedicata ai metodi. 12. Cromogeno TMB, 1 fiala contenente stabilizzanti, 10 ml 13. Soluzione di arresto HRP, acido solforico 0,344M, 1 fiala incolore Avvertenze 1. AVVISO: questo prodotto contiene una sostanza chimica (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per campioni, nei controlli, nei calibratori e nel coniugato nota allo Stato della California come causa di cancro. 2. Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione dei controlli per questo prodotto è stato testato ed è risultato negativo alla presenza di anticorpi al virus dell'immunodeficienza umana (HIV), dell antigene superficiale dell epatite B (HBsAg) e dell epatite C (HCV) in base a metodi approvati dall FDA. Nessun metodo di prova tuttavia può offrire l'assicurazione completa dell assenza del virus dell HIV, HCV o altri agenti infettivi. Di conseguenza, ELISA Controllo aps/pt, ELISA Calibratori aps/pt ed ELISA Controllo negativo devono essere trattati come materiali potenzialmente infettivi L azoturo di sodio viene usato come conservante. L azoturo di sodio è un veleno e può essere tossico se ingerito o assorbito attraverso la pelle o gli occhi. L azoturo di sodio può reagire con le tubature in piombo o rame e formare azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati per lo smaltimento dei reagenti, con grandi volumi di acqua per evitare l accumulo di azide. 4. Il coniugato HRP contiene una sostanza chimica diluita velenosa/corrosiva che può essere tossica se ingerita in grandi quantità. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la pelle e con gli occhi. 5. Il cromogeno TMB contiene un irritante che può essere pericoloso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle. Per evitare lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la pelle e con gli occhi. 6. La soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione diluita di acido solforico. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è un veleno ed è corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire ustioni chimiche, evitare il contatto con la pelle e con gli occhi. 7. Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti. 8. I reagenti rovesciati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie, rispettare tutti i regolamenti ambientali federali, statali e locali. 2

3 Precauzioni 1. Questo prodotto è destinato a un uso diagnostico in vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel sistema può causare risultati incoerenti. 3. Un lavaggio incompleto o inefficiente e un insufficiente rimozione del liquido dalle strip di pozzetti ELISA causa scarsa precisione e/o un elevato rumore. 4. L adattamento di questo dosaggio all uso con unità di sviluppo automatiche dei campioni e altri dispositivi per la manipolazione dei liquidi, anche parziale, può produrre differenze nei risultati del test rispetto a quelli ottenuti utilizzando la procedura manuale. È responsabilità di ogni laboratorio verificare che la procedura automatica dia risultati dei test entro limiti accettabili. 5. Le prestazioni del dosaggio sono influenzate da molti fattori. Tra questi figurano la temperatura iniziale dei reagenti, la temperatura ambiente, la precisione e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, l'accuratezza del lavaggio e della rimozione del liquido dai micropozzetti delle strip ELISA, il fotometro usato per misurare i risultati e la lunghezza dei periodi di incubazione durante il dosaggio. Per ottenere risultati accurati e riproducibili è necessario prestare grande attenzione alla coerenza. 6. Si raccomanda un rigido rispetto del protocollo. 7. Una risigillatura incompleta della borsa con cerniera contenente le strip di pozzetti e gli essiccanti causa una degradazione dell antigene e una scarsa precisione. 8. Capacità di assorbimento eccessivamente basse possono essere osservate dopo due o più impieghi da un singolo flacone di coniugato HRP nell arco di un periodo di tempo. Per evitare che questo avvenga è importante seguire tutte le procedure raccomandate per la manipolazione del coniugato HRP. 9. La contaminazione chimica del coniugato HRP può derivare da una pulizia o un risciacquo inadeguati dell attrezzatura o degli strumenti. I residui di comuni sostanze di laboratorio come la formalina, la candeggina, l etanolo o un detergente causano degradazione del coniugato HRP nel tempo. Risciacquare accuratamente tutta l attrezzatura o gli strumenti dopo l uso di detergenti/disinfettanti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e maneggiati in accordo alle istruzioni. 2. Le strip di pozzetti rivestite con antigeni non utilizzate devono essere risigillate in modo sicuro nel sacchetto di alluminio contenente i disseccanti e conservate a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Prelievo del campione Questa procedura può essere eseguita con un campione di siero o plasma. L aggiunta di azide o altri conservanti ai campioni del test può influenzare negativamente i risultati. I campioni microbicamente contaminati, sottoposti a trattamento termico o contenenti particolato visibile non devono essere usati. Evitare campioni o sieri lipemici o fortemente emolizzati. Il CLSI (NCCLS) Document H18-A3 raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i campioni a temperatura ambiente per un massimo di 8 ore; 2) se il dosaggio non verrà completato entro 8 ore, refrigerare il campione a 2-8 C; 3). se il dosaggio non verrà completato entro 48 ore, oppure per la spedizione del campione, congelare a -20 C o a una temperatura inferiore. I campioni congelati devono essere miscelati dopo il decongelamento e prima di eseguire il test. Procedura Materiale fornito Piastra di micropozzetti ELISA aps/pt IgG (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2 ml di ELISA Controllo negativo prediluito 1 1,2 ml di ELISA controllo IgG aps/pt prediluito 1 1,2 ml di ELISA Calibratore A IgG aps/pt prediluito 1 1,2 ml di ELISA Calibratore B IgG aps/pt prediluito 1 1,2 ml di ELISA Calibratore C IgG aps/pt prediluito 1 1,2 ml di ELISA Calibratore D IgG aps/pt prediluito 1 1,2 ml di ELISA Calibratore E IgG aps/pt prediluito 1 50 ml di diluente per campioni HRP Plus 1 25 ml di tampone di lavaggio HRP Plus, 40x concentrato 1 10 ml di coniugato IgG aps/pt HRP, (capra), anti IgG umane 1 10 ml di cromogeno TMB 1 10 ml di soluzione di arresto HRP, 0,344M acido solforico O Piastra di micropozzetti ELISA aps/pt IgM (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2 ml di ELISA Controllo negativo prediluito 1 1,2 ml di ELISA controllo IgM aps/pt prediluito 1 1,2 ml di ELISA Calibratore A IgM aps/pt prediluito 1 1,2 ml di ELISA Calibratore B IgM aps/pt prediluito 1 1,2 ml di ELISA Calibratore C IgM aps/pt prediluito 1 1,2 ml di ELISA Calibratore D IgM aps/pt prediluito 1 1,2 ml di ELISA Calibratore E IgM aps/pt prediluito 1 50 ml di diluente per campioni HRP Plus 1 25 ml di tampone di lavaggio HRP Plus, 40x concentrato 1 10 ml di coniugato IgM aps/pt HRP, (capra), anti IgM umane 1 10 ml di cromogeno TMB 1 10 ml di soluzione di arresto HRP, 0,344M acido solforico Materiale aggiuntivo richiesto ma non fornito Micropipette per l erogazione di 5, 100, e 500 µl Punte per micropipette monouso Provette per diluizione del campione del paziente, 4 ml di volume Acqua distillata o deionizzata Contenitore da 1l per il tampone di lavaggio HRP diluito Lettore di micropiastre in grado di misurare l assorbanza OD a 450 nm (e 620 nm per le letture a doppia lunghezza d onda) 3

4 Metodo Prima di iniziare 1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperature ambiente (20-26 o C) e miscelare bene. 2. Diluire il Tampone di lavaggio HRP Plus nella misura di 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone di Tampone di lavaggio HRP Plus a 975 ml di acqua distillata o deionizzata. Se durante questo periodo non viene eseguita l analisi dell intera piastra, è possibile preparare una quantità minore aggiungendo 2,0 ml di concentrato a 78 ml di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. Il tampone diluito è stabile per 1 settimana a 2 8 C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ogni campione del paziente aggiungendo 5 µl di campione a 500 µl di diluente per campioni HRP Plus. I campioni diluiti devono essere usati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i calibratori aps/pt IgG o IgM aps/pt, ELISA Controllo aps/pt IgG o aps/pt IgM ed ELISA Controllo negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di anticorpi anti-fosfatidilserina/protrombina richiede due pozzetti per ciascuno dei calibratori e controlli e uno o due pozzetti per ogni campione del paziente. Si consiglia di testare i campioni in doppio. 5. Preparazione della curva standard: per i punti da A ad E della curva standard a 5 punti, utilizzare ELISA Calibratore A- E IgG o IgM aps/pt PREDILUITO direttamente dalla fiala. La curva standard a cinque punti ha il seguente valore Punto Unità IgG o IgM PS/PT A ELISA Calibratore A IgG o IgM aps/pt prediluito 150,0 B ELISA Calibratore B IgG o IgM aps/pt prediluito 75,0 C ELISA Calibratore C IgG o IgM aps/pt prediluito 37,5 D ELISA Calibratore D IgG o IgM aps/pt prediluito 18,75 E ELISA Calibratore E IgG o IgM aps/pt prediluito 9,4 Procedura del dosaggio 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI COMINCIARE IL DOSAGGIO. Collocare il numero richiesto di micropozzetti/strip nel supporto. Riporre immediatamente le strip non utilizzate nel sacchetto con l'essiccante e chiuderlo bene per ridurre al minimo l esposizione al vapore acqueo. 2. Aggiungere ai pozzetti 100 µl di ciascuno dei cinque calibratori, i campioni diluiti dei pazienti, ELISA Controllo negativo e ELISA Controllo IgG aps/pt o IgM aps/pt. NOTA ELISA Calibratori IgG aps/pt o IgM aps/pt, Controllo IgG aps/pt o IgM aps/pt ed ELISA Controllo negativo sono prediluiti e pronti all uso. Coprire i pozzetti e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione comincia dopo l ultima aggiunta. 3. Ciclo di lavaggio: aspirare completamente il contenuto di ogni pozzetto. Aggiungere a tutti i pozzetti µl del Tampone di lavaggio HRP Plus diluito quindi aspirare. Ripetere questa sequenza altre due volte per un totale di tre lavaggi. Ribaltare la piastra e percuoterla delicatamente su materiale assorbente per rimuovere eventuale liquido residuo dopo l ultimo lavaggio. È importante svuotare completamente ogni pozzetto dopo ogni ciclo di lavaggio. Rispettare la stessa sequenza di aspirazione impiegata per l aggiunta del campione. 4. Aggiungere a ogni pozzetto 100 μl di coniugato aps/pt IgG o aps/pt IgM HRP. Il coniugato deve essere rimosso dai flaconi in condizioni asettiche standard e impiegando buone tecniche di laboratorio. Estrarre dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per il dosaggio. PER EVITARE UNA POTENZIALE CONTAMINAZIONE MICROBICA E/O CHIMICA, NON REINTRODURRE MAI NEL FLACONE IL CONIUGATO NON UTILIZZATO. Incubare i pozzetti per 30 minuti come nel ciclo Ciclo di lavaggio: ripetere il punto Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di cromogeno TMB e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di soluzione di arresto. Per l'aggiunta della soluzione di arresto HRP rispettare la stessa sequenza e la stessa tempistica utilizzate per il cromogeno TMB. Percuotere delicatamente la piastra con un dito per miscelare accuratamente i pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ogni pozzetto a 450 nm entro un ora dall arresto della reazione. Se si desiderano misurazioni bicromatiche, come lunghezza d onda di riferimento è possibile utilizzare 620 nm. Controllo della qualità 1. ELISA Calibratori IgG aps/pt o IgM aps/pt, ELISA Controllo IgG aps/pt o IgM aps/pt ed ELISA Controllo negativo devono essere analizzati con tutti i lotti di campioni per garantire che tutti i reagenti e tutte le procedure vengano eseguiti correttamente. 2. Si noti che ELISA Calibratori IgG aps/pt o IgM aps/pt, ELISA Controllo IgG aps/pt o IgM aps/pt ed ELISA Controlli negativi sono prediluiti e pertanto non controllano i metodi procedurali associati alla diluizione dei campioni. 3. È possibile testare controlli aggiuntivi attenendosi alle linee guida o ai requisiti delle normative locali e/o statali o di organizzazioni accreditate. Sieri di controllo aggiuntivi idonei possono essere preparati suddividendo in aliquote campioni di siero umano e conservandoli a < -20 C. 4. Affinché i risultati di test possano essere considerati validi, devono essere soddisfatti tutti i criteri seguenti. Se uno qualsiasi di questi non viene soddisfatto, il dosaggio deve essere considerato non valido e deve essere ripetuto. a. L assorbanza dell'elisa Calibratore A aps/pt IgG o aps/pt IgM prediluito deve essere superiore all assorbanza dell ELISA Controllo IgG aps/pt o IgM aps/pt prediluito che deve essere superiore all assorbanza dell ELISA Controllo negativo prediluito. b. L ELISA Calibratore A IgG aps/pt o IgM aps/pt prediluito deve avere un assorbanza superiore a 1,0 mentre l assorbanza dell ELISA Controllo negativo prediluito non può essere superiore a 0,2. c. L assorbanza di ELISA Controllo IgG aps/pt o IgM aps/pt deve essere oltre due volte superiore rispetto a ELISA Controllo negativo o superiore a 0,25. d. La concentrazione del Controllo ELISA deve rientrare nell intervallo indicato sull etichetta. e. Per indicazioni sulle corrette pratiche di controllo della qualità si raccomanda all utente di fare riferimento a CLSI (NCCLS) Document C24-A3. Calcolo dei risultati 1. Determinare il valore medio per tutte le letture doppie. 2. Tracciare l assorbanza media della curva del calibratore per il dosaggio delle IgG o IgM sulla scala logaritmica delle relative concentrazioni. Utilizzare una linea del tracciato della curva best-fit. Altrimenti è possibile utilizzare un tracciato log/log. Le unità PS/PT assegnate ai calibratori si possono trovare sulla fiala del calibratore. 3. Determinare la concentrazione non nota delle IgG o IgM PS/PT in unità IgG o IgM PS/PT dall asse "X" leggendo la corrispondente assorbanza sull asse "Y". 4. Intervallo dei valori negativi da 0-30 unità. I risultati positivi sono superiori a 30 unità. 4

5 Interpretazione dei risultati Il dosaggio ELISA è molto sensibile alla tecnica ed è in grado di rilevare persino differenze minime nelle popolazioni di pazienti. I valori illustrati di seguito sono solo valori suggeriti. Ogni laboratorio deve definire il proprio intervallo normale in base alle tecniche, ai controlli, all'attrezzatura e alla popolazioni di pazienti propri secondo le procedure consolidate. Quindi il campione può essere classificato come negativo o positivo in base alla tabella riportata sotto. Unita Negativo 30 Positivo > Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi anti IgG o IgM PS/PT e suggerisce la possibilità di alcuni disturbi trombotici da malattie autoimmuni, come l APS o quelli secondari al lupus eritematoso sistemico o altre malattie trombotiche simili al lupus. 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi IgG o IgM anti-ps/pt oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di individuazione del cutoff del dosaggio. 3. Si suggerisce che i risultati riportati dal laboratorio includano la dichiarazione: I seguenti risultati sono stati ottenuti con il test ELISA IgG aps/pt o IgM aps/pt INOVA QUANTA Lite. I valori IgG o IgM PS/PT ottenuti con metodi di dosaggi provenienti da diversi produttori non possono essere utilizzati in modo intercambiabile. Limiti della procedura 1. La rilevanza clinica degli anticorpi IgG o IgM anti-ps/pt in malattie diverse dal LES o dall APS è attualmente in fase di sperimentazione. 2. Quando vengono riscontrati titoli negative di IgG o IgM PS/PT in presenza di indicazioni cliniche, è indicata l esecuzione di un test dell anticoagulante del lupus, dell anticardiolipina, di anti-β 2 o di altre ulteriori analisi. 3. La diagnosi non può essere formulata esclusivamente sulla base dei risultati di IgG o IgM PS/PT. Tali risultati devono essere interpretati unitamente alla presenza di sintomi fisici. 4. Il trattamento non deve essere iniziato esclusivamente in base alla presenza di un titolo positivo di IgG o IgM PS/PT. È necessario che siano presenti anche indicazioni cliniche di supporto. 5. È prevedibile che alcuni campioni possano risultare positivi all anticardiolipina e/o all anti-β 2 GPI pur risultando negativi alla IgG o IgM PS/PT. Il test anti-β 2 GPI è un marker specifico di rischio trombotico. Il test dell anticardiolipina può produrre risultati falsamente positivi in seguito alla reattività incrociata con il dsdna o con certi anticorpi anti-malattie infettive. Allo stesso modo, i pazienti con APS possono risultare positivi alla PS/PT e negativi all anticoagulante del lupus, all anticardiolipina o all anti-β Non sono stabilite prestazioni per matrici diverse dal siero o dal plasma. 7. Tali dosaggi sono per uso In Vitro Caratteristiche specifiche delle prestazioni e studi clinici Riepilogo degli studi clinici Le prestazioni dei kit IgG aps/pt QUANTA Lite e IgM aps/pt QUANTA Lite sono state valutate in uno studio esterno e in uno studio interno. I risultati combinati sono stati inseriti nelle tabelle riportate sotto. Numero di positivi (%) Gruppo di pazienti N. di campioni IgG PS/PT IgM PS/PT IgG e/o IgM Normali (1,2%) 4 (1,6%) 7 (2,8%) Positivi al lupus anticoagulante (LAC) (87,5%) 19 (79,2%) 24 (100%) Sindrome da antifosfolipidi (APS) (46,5%) 34 (47,9%) 48 (67,6%) Artrite reumatoide Morbo di Crohn Colite ulcerosa Celiaci Negativi al LAC (12,5%) 1 (12,5%) Numero di positivi (%) Malattia infettiva (CMV, toxoplasmosi, rosolia, HSV, HBV, HCV) Sifilide Positivi agli anticorpi anti-actina H. pylori L uso combinato di IgG e IgM PS/PT ha consentito la rilevazione di tutti i 24 campioni positivi all anticoagulante del lupus noti e il 67,6% dei pazienti con APS. Solo 3 dei 247 campioni normali e nessuno di altri 52 controlli di malattie sono risultati positivi con il kit IgG per una specificità del 99% (3/299). Solo 4 dei 247 campioni normali e 1 dei 52 sieri di controllo sono risultati positivi con il kit IgM per una specificità del 98,3% (5/299). Concordanza clinica con β 2 GPI I kit IgG aps/pt QUANTA Lite e IgM aps/pt QUANTA Lite sono stati confrontati con dosaggi napprovati ai sensi del 510(k) per il rilevamento di β 2 GPI IgG e β 2 GPI IgM. I campioni analizzati includevano 71 pazienti con APS, 24 campioni positivi all anticoagulante del lupus e 85 campioni normali per un totale di 180 campioni. I risultati sono riassunti qui di seguito. IgG aps/pt + - IgG ** β 2 GPI - 16* 116 *Uno dei 16 è risultato positivo al LAC e gli altri 15 erano pazienti con APS **Tutti e dieci provenivano dal gruppo di pazienti con APS IgM aps/pt + - IgM * β 2 GPI - 25** 120 5

6 *Uno di questi era un campione normale mentre 6 provenivano dal gruppo con APS **Ventidue erano pazienti con APS e 3 erano positivi al LAC L accordo generale dei due kit IgG e IgM PS/PT rispetto ai kit β 2 GPI è risultato dell 85,6% e dell 82,2%. La maggior parte dei risultati discrepanti è dovuta alla maggiore sensibilità dei kit IgG e IgM PS/PT sia per i campioni positivi al LAC che particolarmente per i pazienti con APS benché ci siano stati pazienti con APS risultati positivi a β 2 GPI e negativi aps/pt. I kit IgG più IgM PS/PT hanno rilevato tutti i campioni positivi al LAC e la maggior parte dei pazienti con APS. È stato notato che la gran maggioranza dei pazienti con APS è risultata positiva aps/pt e/o a β 2 GPI. Confronto metodologico I kit IgG e IgM aps/pt sono stati confrontati con i kit IgG β 2 GPI e IgM β 2 GPI mediante un totale di 62 campioni per il confronto IgG e di 63 campioni per il confronto IgM. I campioni selezionati hanno tutti prodotto valori entro il range lineare del dosaggio. I risultati sono riportati sotto assieme alle concordanze positive, negative e relative calcolate. ELISA IgG aps/pt Positivo Negativo Totale ELISA IgG ß 2 GPI Positivo Negativo Totale Percentuale di accordo positivi 65% Percentuale di accordo negativi 83,7% Accordo relativo 77,8% ELISA IgM aps/pt Positivo Negativo Totale ELISA IgG ß 2 GPI Positivo Negativo Totale Percentuale di accordo positivi 81,3% Percentuale di accordo negativi 76,6% Accordo relativo 77,8% Precisione e riproducibilità Sono stati analizzati otto campioni in sei replicati con ELISA IgG aps/pt in sei giorni diversi. N. totale= 36. I risultati dei valori delle unità sono sintetizzati sotto. Valore delle unità di IgG 1,4 139,3 79,3 36,8 22,2 8,3 53,8 1,7 Sdev intra-dosaggio 0,1 6,8 4,9 2,5 1,7 0,8 3,4 0,1 %CV 8,1 4,9 6,2 6,7 7,8 9,9 6,4 7,1 Sdev inter-dosaggio 0,2 4,2 3,3 1,6 1,2 0,4 2,3 0,1 %CV 12,0 3,0 4,2 4,5 5,3 5,2 4,2 8,3 Altri otto campioni sono stati analizzati in sei replicati con ELISA IgM aps/pt negli stessi sei giorni. N. totale= 36. I risultati dei valori delle unità sono sintetizzati sotto. Valore delle unità IgM 3,1 153,2 75,8 36,0 18,2 9,8 58,2 3,2 Sdev intra-dosaggio 0,2 5,9 3,3 1,7 0,7 0,6 2,6 0,2 %CV 5,8 3,8 4,4 4,6 3,8 6,3 4,5 6,4 Sdev inter-dosaggio 0,3 4,3 2,4 1,1 0,5 0,4 2,1 0,2 %CV 9,9 2,8 3,2 3,0 2,6 3,8 3,6 7,4 Range lineare IgG aps/pt: 5,1-150 unità IgM aps/pt: 3,6-150 unità Per campioni con valori superiori a 150 unità, riportare i risultati come >150 unità o positivi. Per campioni con valori inferiori a 5,1 unità per IgG o 3,6 unità per IgM riportare i risultati come <5,1 o <3,6 o negativi. QUANTA Lite è un marchio registrato di INOVA Diagnostics, Inc. Copyright 2010 Tutti i diritti riservati 6

7 Bibliografia 1. Hughes GRV. The antiphospholipid syndrome: ten years on. Lancet 342:341-4, Roubey R. Autoantibodies to Phospholipid-Binding Plasma Proteins: A New View of Lupus Anticoagulant and Other Antiphospholipid Antibodies. Blood 84: , McNeil HP, et al. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipidbinding inhibitor of coagulation: beta 2-glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA 87:4120-4, Galli M, et al. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet 335:1544-7, Matsuura E, et al. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. 6. Matsuura E, et al. Anticardiolipin antibodies recognize β2-glycoprotein I structure altered by interacting with oxygen modified solid phase surface. J Exp. Med. 179:457-62, Roubey RA, et al. Comparison of an enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to β2 Glycoprotein I and a conventional anticardiolipin immunoassay. Arthritis Rheum 39:1606-7, McNally T, et al. Increased levels of β2 Glycoprotein I antigen and β2 Glycoprotein I binding antibodies are associated with a history of thromboembolic complications in patients with SLE and primary antiphospholipid syndrome. Br J Rheumatol 34:1031-6, Teixido M, et al. Anti β2 Glycoprotein I antibodies: a useful marker for the antiphospholipid syndrome. Br J Rheumatol 36:113-6, Amengual O, et al. Specificity of ELISA for antibody to β2 Glycoprotein I in patients with antiphospholipid syndrome. Br J Rheumatol 35: , Lewis S, et al. Standardized measurement of major immunoglobulin class (IgG, IgA and IgM) antibodies to β2 Glycoprotein I in patients with antiphospholipid syndrome. J Clin Lab Analysis 12:293-97, Mann KG, et al. Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Blood 76:1-16, Galli M, et al. Kaolin clotting time and dilute Russell s viper venom time distinguish between prothrombindependent and β2 glycoprotein I-dependent antiphospholipid antibodies. Blood 86:617-23, Bevers EM, et al. Lupus anticoagulant IgG s (LA) are not directed to phospholipids only, but to a complex of lipid bound human prothrombin. Thromb Haemost 66:629-32, Perpimkul P, et al. Functional and binding studies of the roles of prothrombin and β2 Glycoprotein I in the expression of lupus anticoagulant activity. Blood 83: , Arvieux J, et al. Development of an ELISA for autoantibodies to prothrombin showing their prevalence in patients with Lupus Anticoagulant. Thromb Haemost 74:1120-5, Galli M. Non β2-glycoprotein I cofactors for antiphospholipid antibodies. Lupus 5:388-92, Petri M, et al. Anti-plasma protein antibodies are predictive of thrombotic events (TE). Arthritis Rheum 37:S 281, Horbach D, et al. Lupus anticoagulant is the strongest risk factor for both venous and arterial thrombosis in patients with systemic lupus erythematosus. Thromb Haemost 76:916-24, Vaarala O, et al. Antibodies to prothrombin imply a risk of myocardial infarction in middle-aged men. Thromb Haemost 75:456-9, Fleck RA, et al. Anti-prothrombin antibodies and the Lupus Anticoagulant. Blood 72:512-9, Oosting JD, et al. Antiphospholipid antibodies directed against a combination of phospholipids with Prothrombin, Protein C, or Protein S: an explanation for their pathogenic mechanism?. Blood 81: , Arnout J. The pathogenesis of the antiphospholipid syndrome: a hypothesis based on parallelisms with heparin-induced thrombocytopenia. Thromb Haemost 75:536-41, Bertolaccini M, et al. Autoantibodies to human prothrombin and clinical manifestations in 207 patients with systemic lupus erythematosus. J Rheumatol 25: , Amengual O, et al. Specificities, properties and clinical significance of antiprothrombin antibodies. Arthritis Rheum 48:886-95, D Agnillo P, et al. Prothrombin binds to the surface of apototic, but not viable cells and serves as a target of Lupus Anticoagulant antibodies. J of Immunol 170: , Atsumi T. et al. Association of autoantibodies against the phosphatidylserine-prothrombin complex with manifestations of the antiphospholipid syndrome and with presence of lupus anticoagulant. Arthiritis Rheum 43: , Atsumi T. Antiprothrombin antibodies are they worth assaying? Thrombosis Research 114: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition,

8 Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ITA December 2010 Revision 0 8