QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso l test ELISA QUANTA Lite TM IgG/IgA per lo screening della PBC è un test di immunoassorbimento enzimatico per la determinazione semiquantitativa di anticorpi mitocondriali, anticorpi gp210 e anticorpi sp100 di classe IgG e/o IgA nel siero umano. La presenza di anticorpi mitocondriali gp210 e sp100 può essere utilizzata, unitamente ad altri risultati clinici ed esami di laboratorio, per agevolare la diagnosi di cirrosi biliare primaria. Riassunto e Spiegazione del test La cirrosi biliare primaria (PBC) è una patologia epatica cronica caratterizzata dalla distruzione dei piccoli dotti biliari intraepatici. La progressiva distruzione dei dotti causa una crescente compromissione della funzionalità epatica e, col tempo, può determinare un insufficienza epatica e rendere necessario un trapianto di fegato. 1,2 L eziologia della PBC è sconosciuta, sebbene una componente genetica e altri fattori potrebbero risultare importanti per lo sviluppo della patologia. 3,4 La PBC si manifesta tipicamente in soggetti di età compresa tra 30 e 65 anni e colpisce più frequentemente le donne (con un rapporto maschi/femmine di circa 9:1). 3,4 La prevalenza della PBC in congiunti di primo grado di pazienti affetti da PBC è compresa tra 1,3 e 6,4%. 4,5 La PBC colpisce tutte le razze ed è presente in tutto il mondo. Sono state riscontrate ampie variazioni nella prevalenza geografica della PBC, con stime comprese tra 2 casi su 100,000 in Giappone e Australia e 40 casi su 100,000 negli Stati Uniti. 3,6 La caratteristica sierologica della PBC è la presenza di anticorpi anti-mitocondriali (AMA) che può essere rilevata nel 90-95% dei pazienti affetti da PBC. Gli anticorpi antimitocondriali sono stati rilevati in soggetti asintomatici con funzioni chimiche del fegato normali e istologia normale. Nel tempo, alcuni di questi soggetti sviluppano la PBC. 7-9 I principali autoantigeni bersaglio dell AMA sono le sottounità E2 del complesso piruvato deidrogenasi (PDC- E2), il complesso dell acido 2-oxodeidrogenasi (BCOADC-E2) a catena ramificata e il complesso 2-oxoglutarato deidrogenasi (OGDC-E2). 10 Gershwin e Leung hanno sviluppato e brevettato un antigene ricombinante (MIT3) che contiene gli epitopi immunodominanti di queste tre sottounità. 11 I test basati sul MIT3 hanno prestazioni migliori rispetto ai test ELISA convenzionali basati sul PDC-E2. 11,12 Oltre all AMA, circa il 50-72% dei sieri ottenuti da pazienti affetti da PBC contiene anticorpi antinucleari (ANA) Due pattern degli ANA sono specificamente associati alla PBC; il primo presenta una colorazione punteggiata del bordo/membrana nucleare, caratteristica della proteina gp210 della membrana porosa del nucleo, mentre il secondo, il cosiddetto nuclear dot multiplo (MND), è caratteristico della proteina sp100 associata al corpo nucleare. Anticorpi anti-gp210 e anti-sp100 sono stati rilevati in circa il 25% di pazienti affetti da PBC e sono altamente specifici della PBC. Inoltre, questi anticorpi si trovano nel 10-50% dei pazienti affetti da PBC AMA-negativi e possono essere gli unici anticorpi specifici della PBC rilevati. Sebbene la maggior parte dei test tradizionali rilevi solo gli anticorpi AMA IgG, nel siero, nella bile, nella saliva e nelle urine dei soggetti affetti da PBC sono presenti anche anticorpi AMA IgA. 13,14 Questa IgA secretoria anti-pbc potrebbe svolgere un ruolo importante nella patogenesi della PBC. 14 I pazienti con sospetta patologia epatica autoimmune, ma che non soddisfano tutti i criteri classici, possono rappresentare una sfida clinica.i nuovi test per la rilevazione degli anticorpi per gp210, sp100 e AMA che utilizzano l antigene MIT3 con sensibilità potenziata, hanno ridotto il numero di pazienti affetti da PBC senza prova sierologica di PBC. Il test ELISA QUANTA Lite TM IgG/IgA per lo screening della PBC rileva gli anticorpi per i marker MIT3, sp100 e gp210 specifici della PBC. Il coniugato con doppia specificità (IgG/IgA) offre una maggiore sensibilità per la rilevazione di campioni che possono risultare deboli o negativi ai test con un coniugato monospecifico (solo IgG) Il test associato per la rilevazione della presenza degli anticorpi IgG e IgA per MIT3, gp210 e sp100 fornisce uno strumento per l analisi di soggetti con sospetta PBC. Principio della Metodica Una miscela contenente l antigene ricombinante purificato per affinità (MIT3), comprendente porzioni immunodominanti di PDC-E2, BCOADC-E2, OGDC-E2, un frammento purificato della proteina sp100 e un frammento purificato della proteina gp210, si lega ai pozzetti di una piastra a micropozzetti in polistirene in condizioni che consentono la conservazione degli antigeni allo stato nativo. I controlli pre-diluiti e i sieri diluiti dei pazienti vengono aggiunti a pozzetti separati consentendo agli anticorpi mitocondriali, sp100 o gp210 presenti di legarsi all antigene immobilizzato. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg/iga umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg/iga umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg/iga umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. 1

2 Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene PBC Screen antígeno (miscela di purificati) MIT3, sp100 e gp210 antígenos) purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi a PBC Screen antigeni, prediluito,(pronta all uso), 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per PBC Screen IgG/IgA, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi a PBC Screen antigeni, prediluito, (pronta all uso), 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per PBC Screen IgG/IgA, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi a PBC Screen antigeni, prediluito, (pronta all'uso), 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP PBC Screen IgG/IgA, (montone), anti-igg/iga umane, 1 flacone incolore contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo PBC Screen IgG/IgA, ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 2

3 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell CLSI (NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. 16 Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA PBC Screen IgG/IgA (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo PBC Screen IgG/IgA prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP PBC Screen IgG/IgA, (montone), anti-igg/iga umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA, Controllo ELISA fortemente positivo PBC Screen IgG/IgA ed Controllo ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di PBC Screen IgG/IgA antigeni usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 3

4 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA, ELISA fortemente positivo PBC Screen IgG/IgA ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP PBC Screen IgG/IgA in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA, ELISA fortemente positivo PBC Screen IgG/IgA ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA, ELISA fortemente positivo PBC Screen IgG/IgA ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo PBC Screen IgG/IgA prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo PBC Screen IgG/IgA prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo PBC Screen IgG/IgA servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo PBC Screen IgG/IgA non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A2 dell CLSI (NCCLS) per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. 17 Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA (unità) (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo PBC Screen IgG/IgA La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. 4

5 Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, equivocal o positivo conciliarsi a tabella sotto. Unità Negativo 20 Dubbio 20,1 24,9 Positivo >25 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro PBC Screen IgG/IgA e suggerisce la possibilità di malattie che hanno come caratteristica livelli elevati di anticorpi PBC Screen delle cellule parietali gastriche, inclusa l anemia perniciosa. 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi mitocondriali, gp210 e sp100 o livelli inferiori al cutoff negativo del test. 3. I campioni con risultati positivi possono essere sottoposti al test per la ricerca di anticorpi individuali MIT3, gp210 e sp100 con test ELISA specifici per MIT3, gp210 e sp Non è possibile valutare lo stato anticorpale di un campione con livelli equivoci di anticorpi. Si raccomanda di ripetere il test su un campione fresco o in un momento successivo. 5. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA della INOVA. I valori PBC Screen IgG/IgA ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG/IgA determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 2. Non tutti i pazienti affetti da cirrosi biliare primaria risultano positivi agli anticorpi contro gli antigeni usati nello screening per la PBC. 3. Un risultato negativo non esclude la presenza di anemia perniciosa. 4. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi Range normale Un gruppo di 520 pazienti sani asintomatici residenti negli Stati Uniti è stato analizzato con il test ELISA QUANTA Lite TM IgG/IgA per lo screening della PBC. I dati relativi all età e al sesso erano disponibili per 307 dei campioni. Il gruppo era composto da 150 uomini e 157 donne di età compresa fra 18 e 78 anni. Il valore medio per questa popolazione è risultato pari a 6,6 unità, quello mediano a 4,6 unità. La specificità del test è risultata pari a 98,1 % (510/520) per i soggetti normali. Dei 10 campioni positivi, 7 presentavano reattività al test ELISA IgG per l'm2 EP(MIT3) e 1 campione è risultato reattivo quando analizzato per rilevare la presenza di anticorpi IgA tipo M2 EP(MIT3). Prestazioni caratteristiche specifiche Riassunto degli studi clinici Un totale di 440 pazienti affetti da PBC e 769 pazienti non affetti da PBC, tra cui 520 soggetti normali sani, sono stati a analizzati mediante il test ELISA QUANTA Lite TM IgG/IgA per lo screening della PBC per determinare la specificità e sensibilità del test. Sono stati esclusi i campioni con PBC nota AMA-negativa, i pazienti con malattia sospetta, ma non confermata e i pazienti EAI. Il gruppo PBC (440) comprendeva 426 campioni di soggetti con PBC definita e 14 campioni con sovrapposizione EAI/PBC. Il gruppo non PBC comprendeva campioni ottenuti da 520 controlli sani e campioni ottenuti da soggetti con epatite virale (HBV o HCV) (149), PSC (48), patologia epatica non PBC (23), malattie infettive o altre malattie autoimmuni (29). I valori medi e mediani relativi al gruppo PBC sono risultati pari a 8,1 e 5,3 unità rispettivamente. Tabella 1: Specificità e sensibilità QUANTA Lite PBC Screen IgG/IgA ELISA N=1209 n positivo equivocal negativo PBC Group Non PBC Group Sensibilità: 95,9% (422/440); 95% Riservatezza Intervallo (RI): 93,6% to 97,6% Specificità: 96,1% (739/769); 95% RI: 94,5% to 97,4% Accordo generale (risultati equivoci considerati negativi): 96,0% (1161/1209) 5

6 Confronto con i predicate device Il test ELISA QUANTA Lite TM IgG/IgA per lo screening della PBC è stato confrontato con i singoli test ELISA QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3), ELISA QUANTA Lite TM gp210 ed ELISA QUANTA Lite TM sp100. Nel complesso sono stati analizzati 1209 campioni (440 PBC clinica, 249 non PBC, e 520 soggetti asintomatici sani) con il test per lo screening della PBC e i singoli test ELISA QUANTA Lite MIT3, sp100 e gp210. Specifico QUANTA Lite Prova N=1209 Positivo Equivocal* Negativo Positivo QUANTA Lite PBC Equivocal* Screen IgG/IgA ELISA Negativo *I risultati equivoci sono stati esclusi dall analisi L accordo positivo e quello negativo sono stati calcolati confrontando i risultati ottenuti dallo screening della PBC con i risultati ottenuti dai singoli test. Positivo accordo (escludere equivocals) = 99,5% (437/439) Negativo accordo (escludere equivocals) = 98,9% (730/738) Generale accordo (escludere equivocals): = 99,2% (1167/1177) Reazioni crociate Sono stati analizzati i sieri di 463 pazienti affetti da patologie epatiche diverse dalla PBC (213 EAI-1, 48 PSC, 10 EAI/PSC, 8 AIC, 9 epatiti criptogenetiche, 11 VBDS, 3 EAI-2, 11 patologie epatiche alcolcorrelate, 1 epatite farmaco-indotta, 71 HBV e 78 HCV) e 29 pazienti affetti da malattie autoimmuni o infettive (7 H. pylori, 3 ASCA, 4 ANA, 3 ttg, 2 GPA, 2 GBM e 8 CMV) mediante il test ELISA QUANTA Lite TM IgG/IgA per lo screening della PBC per determinare la specificità del test. Nel gruppo delle malattie autoimmuni/infettive (29 pazienti) solo un campione CMV positivo è stato interpretato come positivo (34,4 unità) allo screening della PBC. Questo paziente presentava una debole colorazione del nucleo e del citoplasma al test IFA, non specifica di alcuno dei pattern antigenici della PBC. Nel gruppo di patologie epatiche non PBC composto da 463 pazienti, 53 sono risultati positivi allo screening della PBC. 42 dei 53 pazienti positivi presentavano un certo grado di reattività a uno o più dei singoli test, mentre 9 pazienti sono risultati negativi a tutti i marker. È possibile che 53 pazienti positivi del gruppo con patologie epatiche non PBC siano affetti da una patologia sovrapposta alla PCB non diagnosticata o in evoluzione. Precisione e riproducibilità Le prestazioni sono state valutate fra i test analizzando 7 campioni, il controllo alto positivo (HPC) del kit e il controllo negativo (NC) per un totale di 5 volte ciascuno. Tabella 2: Prestazioni intra-test del test ELISA QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA HPC NC A B C D E F G Unità medie 100,6 1,1 61,6 39,8 27,9 13,6 27,5 26,5 23,6 Deviazione standard 2,2 0,1 2,3 1,0 0,8 0,3 0,9 0,6 0,5 Coefficiente di variazione % 2,2 6,5 3,7 2,4 3,0 2,4 3,2 2,2 2,2 Le prestazioni inter-test sono state valutate testando, in doppio, 8 compioni, il controllo alto postivo (HPC) del kit e il controllo negativo (NC) due volte al giorno (mattina e pomeriggio) per 3 giorni. Tabella 3: Prestazioni inter-test del test ELISA QUANTA Lite TM PBC Screen IgG/IgA ELISA HPC NC A B C D E F G H Unità medie 104,8 1,6 67,5 8,4 29,7 35,2 6,3 31,5 29,8 25,2 Deviazione standard 1,9 0,3 1,7 0,3 1,2 0,6 0,6 1,9 1,3 0,25 Coefficiente di variazione % 1,8 21,9 2,6 3,6 4,0 1,6 9,2 6,1 4,5 1,0 Bibliografia 1. Heathcote EJ. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 2000;31: Kaplan MM, Gershwin ME. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 2005;353: Feld JJ, Heathcote EJ. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 2003;18: Talwalkar JA, Lindor KD. Primary biliary cirrhosis. Lancet 2003;362:53: Jones DE, Watt FE, Metcalf JV, Bassendine MF, James OF. Familial primary biliary cirrhosis reassessed; a geographically-based population study. J Hepatol 1999;30: Kim W.R. et.al Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology (2000) 119,

7 7. Kisand KE, Metskula K, Kisand KV, Kivik T, Gershwin ME, Uibo R. The follow-up of asymptomatic persons with antibodies to pyruvate dehydrogenase in adult population samples. J Gastroenterol 2001;36: Metcalf JV, Mitchison HC, Plamer JM, Jones DE, Bassendine MF, James OF. Natural history early primary biliary cirrhosis. Lancet 1996;348: Prince M, Chetwynd A, Newman W, Metcalf JV, James OF. Survival and symptom progression in a geographically based cohort with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 2002:123: Fussey SP, Guest JR, James OF, Bassendine MF, Yeaman SJ. Identification and analysis of the major M2 autoantigens in primary biliary cirrhosis. Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Moteki S, Leung PS, Cappel RL, Dickson ER, Kaplan MM, Munoz S, Gershwin ME. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 1996;24: Miyakawa H, Tanaka A, Kikuchi K, Matsushita M, Kitazawa E, Kawaguchi N, Fujikawa H, et al. Detection of antimiochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMA-negative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantibodies autoantigens. Hepatology 2001;34: Milkiewicz P, Buwaneswaran H, Lee L, Coltescu C, Shums Z, Norman GL, Heathcote EJ. Value of "new" autoantibody testing in the differential diagnosis of autoimmune liver conditions. Hepatology 2005;42:292A. 14. Tanaka A, Nalbandian G, Leung PS, Benson GD, Munoz S, Findor JA, Branch AD, et al. Mucosal immunity and primary biliary cirrhosis: presence of antimitochondrial antibodies in urine. Hepatology 2000;32: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), CLSI (NCCLS). Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline- 2 nd edition NCCLS Document C24-A2, Vol. 19(5), Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ITA June 2009 Revision 1 7