Checkpoint ATM-K e ATR-K nella riparazione dei mismatch dopo la trascrizione del DNA Vincenzo Dipierro

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1 Checkpoint ATM-K e ATR-K nella riparazione dei mismatch dopo la trascrizione del DNA Vincenzo Dipierro Le chinasi ATM e ATR sono coordinatrici di un fine meccanismo di controllo noto come checkpoint del ciclo cellulare, deputato al mantenimento dell integrità genomica. Gli eventi biochimici implicati in questo processo hanno luogo sostanzialmente tra le fasi G1/S e tra le fasi G2/M del ciclo cellulare e, oltre ad ATM-k ed ATR-k, coinvolgono complessi macchinari molecolari e molteplici cascate di attivazione e disattivazione che cooperano per un unico scopo: la riparazione di eventuali danni al DNA in condizioni di stress cellulare e, qualora questo non fosse possibile, la morte cellulare per apoptosi. 1 - ATM-k e ATR-k Sono due serina/treonina chinasi: ATM-k ha un peso molecolare di 305 kda, mentre ATR-k di 301 kda, ed il loro locus genico è situato sul cromosoma 11. Queste proteine sono anche dette PI3K-like proteins poiché ambedue mostrano un alta omologia con la proteinchinasi PI3-k (in particolare ATM-k possiede alta omologia con la subunità 110 di PI3-k), ed ambedue sono in grado di fosforilare una grande quantità di targets molecolari dai ruoli fisiologici più disparati. Durante la normale vita della cellula ATM-k e ATR-k hanno un basso grado di fosforilazione che si traduce in una loro scarsa attività, infatti, quando la cellula è in salute, le due proteine pare non investano ruoli basilari per lo sviluppo e per il differenziamento, ma la situazione cambia profondamente nel caso di danno al DNA. L identificazione su ATM-k di un sito di attivazione damage-induced (Ser 1981) ha condotto alla dimostrazione di un meccanismo rapido di azione sull arresto del ciclo cellulare.

2 Checkpoint ATM-k Controllo dell integrità del DNA durante il ciclo cellulare

3 ATM-k checkpoint activation Avviene tra la fase G 1 e S del ciclo cellulare Richiede lo screening del DNA nella ricerca di errori prima della duplicazione Coinvolte ATM ed ATR serina/treonina chinasi ATR è implicata nel checkpoint G M 2

4 ATM-k/ATR-k Locus ATM cr.11 (uman ATM-K 3056aa) - dominio C-terminale: buona omologia con la subunità 110 di PI3-k - ATM e ATR classificate come PI3K-like proteins ATR-k è la ATM-related Kinase, accoppiata all'attivazone di ATM Ruolo centrale nel controllo dell integrità del DNA: - intervengono soprattutto nella rottura del doppio filamento

5 Mismatch repair system Nei Lieviti MutS (MSH2, MSH3, MSH6): - riconoscono il loop di DNAmismatch MutL (MLH1, MLH3, PMS1, PMS2): - excidono il DNAmismatch Nei mammiferi Famiglie di geni RAD e HUS - attivano ATM-K e ATR-k

6 ATM-k/ATR-K UV/IR ATM-k Chk2 p53 Ser20-P - fosforilazione Ser20 di p53 e dissociazione MDM2/p53 -G 1 cell cycle checkpoint control ( G 1 S ) ATR-k Chk1 Cdc25 - fosforilazione di Cdc25 sulla Ser216 inibisce il complesso proteico CDC2/B-Cdk1 responsabile dell ingresso cellulare nella fase mitotica -G 2 cell cycle checkpoint control ( G 2 M ) - attivazione NBS1: STOP S G2

7 ATM-k/ATR-k Indispensabili per la fosforilazione dei domini Ser15 e Ser20 in p53 - attivazione del fattore trascrizionale GBP/300 - espressione di p21 - arresto del ciclo cellulare per consentire la riparazione del DNA o l'apoptosi

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9 Attivazione di p21 Attivazione di p53 e trascrizione di p21 Inibizione G/S-Cdk STOP G1 S

10 ATM-k/ATR-k - esperimenti in vitro rivelano la non diretta interazione di queste chinasi con p53 - individuate Chk1 e Chk2 serina/treonina chinasi effettori downstream di ATMk/ATR-k ATM-k fosforila Chk2Thr68 attivandola - attiva p53 ed inibisce CDC25A: G1 checkpoint - inibisce CDC25C: G2 checkpoint ATR-k fosforila Chk1 attivandola - inibisce CDC25A: G1 checkpoint - inibisce CDC25C e WEE1: G2 checkpoint

11 Chk1/Chk2

12 ATM-k mutata AT cells: derivano da pazienti affetti da ataxia-telangiectasia e sintetizzano una isoforma non funzionale di ATM-k - predisposizione ai tumori - alta instabilità cromosomica - radiosensitività: - UV-induced DNA damage colpisce ATR/Chk1 - IR-induced DNA damage colpisce ATM/Chk2

13 Difetti molecolari in AT Evidente ritardo nella up-regolazione dell oncosoppressore p53 in risposta ad irradiazioni ionizzanti cancerogene Mancata fosforilazione di Ser15 su p53 nel dominio N-terminale di trans-attivazione - inibizione stabile di p53 da parte di MDM2 - mancata attivazione del fattore trascrizionale CBP/p300 - insorgenza di instabilità cromosomica

14 Inibizione del G2 checkpoint Utilizzo in terapia dei Checkpoint Abrogators - in molte cellule cancerose G2 checkpoint e sempre attivo per via di accumulo di DNA mutato nella fase G1 - prolungamento della fase G2 - G2 Checkpoint abrogators uniti a chmioterapico inducono ad apoptosi le cellule cancerose

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16 Mutazioni del gene codificante per ATM-k ne causano l inattività che costituisce la base molecolare nell insorgenza dell atassia telangiectasia (o sindrome di Luis-Barr), una patologia caratterizzata da progressiva perdita di coordinazione dei movimenti (atassia), degenerazione del cervelletto, immunodeficienza, dilatazione dei piccoli vasi sanguigni e un alta probabilità di sviluppare leucemie e tumori. La malattia si eredita con modalità autosomica recessiva, cioè è trasmessa da due genitori portatori sani e colpisce un bambino ogni nati. 2 Mismatch Repair System Il sistema di checkpoint ATM-k/ATR-k viene innescato nel momento in cui viene rilevato un danno al DNA, più precisamente è molto sensibile alla rottura del doppio filamento, ma in generale è verificato che, anche altre tipologie di mutazioni, ad esempio singole delezioni od insersioni, sono eventi molecolari sufficienti all arresto del ciclo cellulare. Questo implica che, l attivazione delle chinasi ATM ed ATR sia conseguenza di uno screening preliminare del DNA compiuto ad opera del Mismatch Repair System. Esso è costituito da due superfamiglie di proteine: MutS (MSH2, MSH3, MSH6) e MutL (MLH1, MLH3, PMS1, PMS2), identificate per la prima volta nei lieviti e successivamente nell uomo con il nome di RAD e HUS. Nello specifico, la proteina MSH2 forma un complesso con MSH3, e alternativamente con MSH6, in grado di riconoscere rispettivamente errori risultanti in un singolo nucleotide e da di/trinucleotidi, ma anche corti e lunghi loop di DNA mismatched che, in seguito, vengono excisi dai complessi proteici MLH1/PMS1 e MLH3/PMS2. Quindi, il riconoscimento di un danno al DNA da parte di queste proteine causa una conseguente attivazione delle chinasi ATM e ATR che, in mancanza di stimoli da stress cellulare, si trovano sottoforma di omodimeri. Questo è possibile grazie alla fosforilazione della

17 Ser 1981 di ATM che costituisce il sito di attivazione dipendente da stress cellulare. Questo evento causa l immediata dissociazione degli omodimeri che, in tal modo risultano attivi ed in grado di fosforilare un gran numero di substrati come ad esempio p53, BRCA1(breast cancer), SMC1(structural manteinance of chromosome) o NBS1( Nijmegen breakage syndrome) e, ciò che è più importante, di arrestare il ciclo cellulare grazie a meccanismi dipendenti dalle CDKs (cycline-dipendent kinases); tutto ciò consente alla cellula di fare il possibile per riparare gli eventuali danni al DNA: se questo dovesse avvenire la cellula sarebbe in grado di riprendere e portare a termine il ciclo cellulare con successo, nel caso contrario verrebbero innescati i meccanismi proapoptotici. 3 CHK1 e CHK2 Sono serina/treonina chinasi mediatori del checkpoint (dette anche adaptors); essendo chinasi downstream, esse ricevono direttamente il segnale di attivazione di ATM ed ATR. In particolare queste proteinchinasi raccolgono i segnali da stress cellulare trasdotti da ATM e ATR e li convogliano ai diversi compartimenti molecolari. Nell atassia/telangiectasia (AT) le mutazioni a carico del sistema di trasduzione del segnale ATM/ATR causano forte instabilità genetica che, nei casi peggiori, può risultare in un vero e proprio danno cromosomico con la conseguente insorgenza di tumori. I pazienti affetti da questa rara sindrome neurodegenerativa sono particolarmente sensibili alle radiazioni luminose infrarosso/ultravioletto. In particolare è stato appurato che, in cellule tumorali derivate da soggetti AT, si verifica un evidente ritardo della up-regolazione di p53 in risposta alle radiazioni ionizzanti. In condizioni fisiologiche, ATM-k e ATR-k sono in grado, fosforilando rispettivamente CHK2 (sulla Thr68) e CHK1 (sulla Ser345), di attivare due

18 importanti siti catalitici su p53, Ser20 e Ser15. La prima fosforilazione (Ser20) porta ad un cambiamento conformazionale nel p53/mdm2 interaction domain che causa la dissociazione della proteina dal suo inibitore molecolare (MDM2). La seconda fosforilazione (Ser15) contribuisce all attivazione di p53 nel suo amino-terminal transactivation domain, questo porta ad un aumento del legame tra p53 fosforilata e l attivatore trascrizionale CBP/p300, con la conseguente espressione di proteine fondamentali per l instaurazione del ceckpoint G1 S, come p21. Quest ultima proteina è in grado di inibire il sito attivo del complesso di cicline G 1 /S-Cdk~S-Cdk creando intorno ad esso un ingombro sterico: tale inattivazione causa l arresto del ciclo cellulare tra le fasi G1 ed S. Inoltre, all instaurazione di questo checkpoint, contribuisce anche l inattivazione della fosfatasi Cdc25A da parte della cascata di fosforilazioni ATR-k/Chk1: in queste condizioni Cdc25A non è più in grado di attivare le cicline che normalmente sono deputate all avanzamento del ciclo cellulare nella fase S. A questo punto è facile comprendere come il sistema ATM-k/ATR-k sia in grado di coordinare finemente i diversi meccanismi molecolari conseguenti a condizioni di stress cellulare: 1) essendo in grado di arrestare il ciclo cellulare; 2) fornendo il tempo necessario ai sistemi di riparazione del DNA (RAD50/51, BRCA1/2, NBS1, MRE11) di poter operare per il ripristino delle condizioni normali della cellula; 3) dando la possibilità a proteine proapoptotiche, come p53, di poter innescare i meccanismi di morte cellulare programmata nel caso di una mancata riparazione del danno al genoma. I soggetti che hanno mutazioni a carico di ATM-k e ATR-k, al verificarsi di un danno cellulare dipendente da radiazioni (es. la rottura del doppio filamento di DNA), manifestano, appunto, l inattivazione del sistema a cascata tra ATM-

19 k/chk2 e ATR-k/Chk1. Questo impedisce la fosforilazione delle serine 20 e 15 su p53 che, di conseguenza, non è più in grado di dissociarsi dal proprio inibitore molecolare, MDM2, ed attivare i fattori trascrizionali proapoptotici; inoltre la situazione è talvolta peggiorata per l insorgenza di un ulteriore mutazione (sostituzione Ser20 Ala20) che rende praticamente irreversibile l innattivazione di p53. La risultante di un tale quadro biochimico è la proliferazione incontrollata di cellule malate che trasferiscono alla progenie tutti i difetti genetici a proprio carico, con insorgenza di danno cromosomico e di tumore. 4 G1 e G2 checkpoints Abbiamo visto come la cascata di reazioni del sistema di chinasi ATM/ATR, con Chk2 e Chk1, interagendo con proteine come p53, p21, Cdc25A, etc., provochi l arresto del ciclo cellulare in G1. Ma le due proteinchinasi sono artefici anche di altri due checkpoints: - il checkpoint S G2 è causato dalla fosforilazione di tre differenti trasduttori del segnale: MRE11, NBS1 e RAD50, con meccanismi non ancora noti del tutto; inoltre, questi mediatori, sono coinvolti nei processi di riparazione del DNA oltremodo innescati anche da ATM-k e ATR-k; - il checkpoint G2 M: l attivazione da parte di ATR-k di Chk1, causa l inibizione della fosfatasi Cdc25C (fosforilazione della Ser216); Cdc25C, quando viene fosforilata, causa l inattivazione del complesso proteico CDC2/B-Cdk1 responsabile dell ingresso cellulare nella fase premitotica; inoltre, la fosforilazione di Cdc25C ne provoca il sequestro, e quindi ulteriore inattivazione, da parte del binding site, sito di legame generato dalla defosforilazione della Ser376 di p53. Questo checkpoint è rapidamente implementato e, la sua attivazione è

20 indipendente da quella di p53, sebbene sia stato rilevato che il binding site è in grado di interagire anche con WEE1 (chinasi inibitoria delle CDC2/B-Cdk1) che, una volta attiva, contribuisce all arresto del ciclo cellulare in fase premitotica. 5 G2 checkpoint abrogators In alcune patologie ad alta insorgenza neoplastica, tra le quali anche la stessa atassia-telangiectasia o la sindrome di Lee-Fraumeni, è stato visto che le cellule cancerose, e quindi portatrici di gravi anomalie a carattere cromosomico, tendono ad un eccessivo (a volte irreversibile) prolungamento della fase G2 dovuto ad accumulo di DNA mutato durante la fase G1. Il G2 checkpoint, in tali condizioni, viene giustamente messo in atto dai meccanismi sopra descritti ma, l insorgenza di instabilità genica, e soprattutto di mutazioni nei macchinari molecolari proapoptotici, conferiscono alle cellule danneggiate carattere d immortalità con conseguente sviluppo neoplastico. L utilizzo in terapia di molecole inibenti il G2 checkpoint, insieme con la somministrazione di chemioterapico, od in concomitanza con la radioterapia, potrebbero costituire una buona arma clinica contro l insorgenza di alcuni tumori. Infatti, l inibizione dell arresto del ciclo cellulare in cellule malate porterebbe alla ripresa dei normali meccanismi apoptotici, scatenati dagli stimoli da stress cellulare, mentre i chemioterapici contribuirebbero alla definitiva e selettiva eliminazione delle cellule malate.