Il genetista nella diagnosi delle immunodeficienze

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1 1. Il genetista nella diagnosi delle immunodeficienze Luciana Chessa* * Sapienza Università di Roma, II Facoltà di Medicina e Chirurgia Nuovi aggiornamenti di Immunologia clinica. Immunomodulazione e anticorpi ISBN: DOI: / pp ottobre 2010 abstract The genetic bases of immunodeficiences are discussed. The recent progress in genetic molecular techniques allowed in the last 15 years the detection of the causative mutations of the main immunodeficiences, showing a great genetic heterogeneity for most of them. The genetic defect could act on the expression and function of the proteins involved in the development of the immune system, in the cascades of cellular signalling and in the maintenance of immune system homeostasys. Mutations of Btk and other genes encoding for pre-b cells receptors or for BLNK protein cause around 90% of defects in B cells maturation. Iper IgM syndromes are due to mutations in CD40 ligand, CD40, AID, or UNG in 70 80% of affected individuals. Rare defects in ICOS or in CD19 are causative of Common Variable Immunodeficiency (CVID), whilst about 10% of patients with CVID show heterozygosity for missense TACI mutations. 11

2 12 L. Chessa Le immunodeficienze primitive (IDP) costituiscono un gruppo eterogeneo di patologie causate da difetti in geni implicati nei normali meccanismi della risposta immunitaria. Ad oggi sono state identificate circa 200 IDP e più di 120 difetti genetici associati. Sebbene in base all incidenza le IDP siano considerate patologie rare, la loro prevalenza nelle diverse popolazioni varia da 1:500 a 1: , dipendendo di fatto dalla situazione sanitaria dei diversi paesi. I deficit dell immunità umorale sono i più frequenti: deficit di IgA 1/500 1/700; malattia di Bruton 1/ Per lungo tempo si è pensato che le IDP fossero delle patologie monogeniche, ad eredità recessiva autosomica o legata al sesso. Negli ultimi anni sono state identificate forme ad eredità autosomica dominante, ad eredità mitocondriale e forme poligeniche; l eredità autosomica recessiva rimane comunque la più frequente. Il difetto genetico può agire sull espressione e la funzione di proteine coinvolte in un ampia gamma di processi biologici, come lo sviluppo del sistema immunitario, le funzioni degli effettori cellulari, le cascate di segnale e il mantenimento dell omeostasi immunitaria. Le IDP possono manifestarsi con un ampio spettro di segni clinici, come suscettibilità alle infezioni, allergia, patologie autoimmuni, malattie infiammatorie, malattie linfoproliferative e cancro. Esse sono dovute nel 65% dei casi a difetti dell immunità umorale, mentre difetti combinati dell immunità cellulare e di quella anticorpale sono responsabili di un ulteriore 15% dei casi. La presentazione clinica è comunque eterogenea anche nell ambito di una stessa patologia e/o di uno stesso difetto genetico. Sofisticate tecniche genetiche hanno reso possibile, negli ultimi 15 anni, l identificazione dei geni responsabili delle più note e meglio descritte immunodeficienze. Mutazioni di Btk, di componenti dei recettori delle cellule pre B e B (λ5, Igα, Igβ), o della proteina BLNK sono responsabili di circa il 90% di casi con difetti nella maturazione delle cellule B. Le sindromi da iper IgM sono causate da mutazioni nel CD40 ligando, CD40, AID, o UNG nel 70 80% dei pazienti affetti. Rari difetti in ICOS o in CD19 possono originare un quadro clinico consistente con la diagnosi di immunodeficienza comune variabile (CVID), così come circa il 10% dei pazienti con questa patologia presentano in eterozigosi sostituzioni aminoacidiche in TACI. I molteplici meccanismi interattivi che compongono il sistema immunitario possono essere raggruppati in 4 sistemi principali: B linfociti e immunità anticorpo mediata, T linfociti e immunità cellulo mediata, fagociti e cascata del complemento. Le IDP vengono classificate a seconda del sistema maggiormente colpito, anche se più sistemi possono essere coinvolti in un unica malattia: 1) IDP da difetti dei B linfociti o ID anticorpali con abnorme suscettibilità alle infezioni da agenti patogeni piogeni ad invasività extracellulare (Agammaglobulinemia X recessiva, XLA; Immunodeficienza Comune Variabile, CVID; Deficit di IgA e Ipogammaglobulinemia transitoria), con una frequenza del 50% dei deficit umorali e del 20% dei deficit combinati; 2) difetti dei T linfociti che provocano una minore capacità di difendersi dai germi ad invasività intracellulare; poiché i T linfociti cooperano con i linfociti B nella risposta anticorpale predispongono anche ad infezioni da germi extracellulari (quindi ID

3 Il genetista nella diagnosi delle immunodeficienze 13 combinate e se il difetto è molto grave ID combinata grave, SCID) con una frequenza del 10%; 3) ID da difetti del complemento, molto rare (2%); 4) ID da difetti dei fagociti con frequenti e gravi infezioni batteriche e fungine (tra queste la Malattia Granulomatosa Cronica, CGD) (18% delle IDP); 5) ID associate a sindromi, cioè malattie in cui oltre al sistema immune sono coinvolti anche altri organi (sindrome di Wiskott Aldrich, WAS; sindrome di DiGeorge, CATCH22; Atassia Teleangiectasia (AT); Candidiasi mucocutanea cronica). maturazione delle cellule b e difetti anticorpali primitivi Le cellule staminali ematopoietiche danno origine alle cellule progenitrici totipotenti che si possono differenziare nei progenitori comuni mieloide (CMPs) o linfoide (CLPs). Le CLPs progrediscono ai precursori delle cellule B, oltre ad originare le cellule T, le natural killer (NK) e le cellule dendritiche plasmacitoidi (pdcs). I precursori delle cellule B passano poi allo stadio di sviluppo pro B CD10+ CD19+ CD34+. Le cellule pro B si differenziano in cellule pre B CD10+ CD19+ CD34 che esprimono la catena H di membrana che associandosi a molecole di segnale (5/14.1 surrogate light chain, CD79a e CD79b) formano il recettore delle cellule pre B (pre BCR). Mutazioni nei componenti di pre BCR e di B cell linker (BLNK) risultano nell agammaglobulinemia autosomica recessiva senza cellule B mature in periferia. Difetti nel pathway di segnale delle cellule B mediati dalla proteina BTK danno origine all agammaglobulinemia X linked. I difetti primitivi nella immunoregulazione costituiscono un modello per la patofisiologia delle malattie linfoproliferative 1 (XLP1) e 2 (XLP2). malattia di bruton (XLA) Nel 1952 Bruton descrisse il caso di un bambino di 8 anni con infezioni polmonari e sepsi ricorrenti. L elettroforesi sieroproteica permise di documentare un deficit di immunoglobuline (Ig) sieriche. Associando alla terapia antibiotica la somministrazione di Ig si assistette ad un progressivo miglioramento clinico del paziente; ma soltanto nel 1993 è stato identificato il gene responsabile della XLA. Le manifestazioni cliniche compaiono dopo il sesto mese di vita, alla scomparsa delle Ig di origine materna. Sono rappresentate da infezioni ricorrenti e gravi a carico di molteplici distretti. I principali microrganismi responsabili sono batteri capsulati (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, stafilococchi), che danno origine a polmoniti, otiti, sinusiti e anche a: piodermiti, artriti (da Mycoplasma), sepsi, gastroenteriti (specie da Giardia), meningoencefalite cronica. Complicanze tardive sono bronchiectasie e sindrome da malassorbimento. Inoltre è stata osservata l associazione con malattie autoimmuni e tumorali (adenocarcinoma gastrico). Il gene mutato è localizzato sul braccio lungo del cromosoma X nella regione q21.3 q22; è formato da 19 esoni e codifica per una proteina di 77 kda, la tirosinchinasi dei linfociti B (Btk), proteina citoplasmatica specifica delle cellule ematopoietiche (cellule mieloidi, piastrine, cellule B), non espressa nelle plasmacellule e nei linfociti T. Il blocco della differenziazione causato da mutazioni nel gene Btk porta all assenza

4 14 L. Chessa di cellule B mature. Sono state individuate più di 500 mutazioni che portano alla produzione di una proteina tronca o di una proteina strutturalmente instabile o con deficit dell attività catalitica (es. mutazioni non senso con formazione di un codone di stop prematuro, mutazioni missenso). È stato osservato che mutazioni analoghe nella stessa famiglia sono correlate con una espressione fenotipica diversa. Ciò suggerisce che altri fattori genetici possono contribuire a determinare la gravità clinica della malattia; infatti l attività di altre protein chinasi citoplasmatiche (TEC) potrebbe compensare il deficit legato a mutazioni di Btk. Non è stata osservata una evidente correlazione genotipo/fenotipo in XLA, tuttavia è stato evidenziato che specifiche mutazioni in Btk sono correlate alla gravità della malattia. Dal 1952, quando l agammaglobulinemia congenita è stata descritta da Bruton, la caratterizzazione delle IDP nell uomo è stata cruciale per la comprensione della biologia della risposta immunitaria innata e adattativa. Recentemente è stata identificata una serie di difetti primari dell immunità innata, insieme a nuovi difetti nella differenziazione delle cellule pre B e B e nella maturazione anticorpale e a patologie monogeniche con alterata omeostasi sia dell immunità innata che di quella adattativa. Nuovi difetti dell immunità innata sono: TLR3 mediated signalling defects in HSV encephalitis; Cytokine induced JAK STAT pathway defects in hyper IgE syndrome; X linked susceptibility to mycobacterial disease; Severe congenital neutropaenia; Leukocyte adhesion deficiency type III. cvid Mutazioni in un gene recentemente scoperto sembrano essere responsabili di molti casi di deficienza immunitaria, in particolare di due sindromi la deficienza di immunoglobulina A (IgA) e l Immunodeficienza Comune Variabile (CVID) che rendono i pazienti estremamente vulnerabili alle infezioni e che spesso non vengono diagnosticate. La deficienza di IgA colpisce una persona su 600; la CVID è meno comune ma più grave. L immunodeficienza comune variabile comprende deficit anticorpali che si presentano con grande eterogeneità clinica sia nella tarda infanzia che, più tipicamente, nella prima media età adulta. I bambini e gli adulti che ne soffrono subiscono infezioni ricorrenti, bronchiti, polmoniti e infezioni gastrointestinali. Le sindromi possono verificarsi nella stessa famiglia e predisporre i pazienti anche all autoimmunità, in particolare colpendo la tiroide e dando origine ad un insufficienza ormonale. I pazienti con la CVID, infine, sono predisposti allo sviluppo di linfomi a cellule B. Le mutazioni di TACI interferiscono con due aspetti della risposta immunitaria relativi alla maturazione delle cellule B; sono state identificate in 4 pazienti su 19 con la CVID e un paziente su 16 con la deficienza di IgA. I pazienti non erano imparentati fra loro. Nessuno dei 50 soggetti di controllo sani analizzati presentava una mutazione di TACI. Altre molecole implicate nell eziopatogenesi della CVID sono ICOS e BAFF/BAFF R. Tutte le proteine finora identificate partecipano alla maturazione di T e B linfociti e all organizzazione della risposta immunitaria. SCID (Severe Combined Immunodeficiency) Le SCID (immunodeficienze combinate gravi) sono un gruppo eterogeneo di malattie ge-

5 Il genetista nella diagnosi delle immunodeficienze 15 netiche che compromettono gravemente la funzione del sistema immunitario, in particolare dei linfociti T (e spesso anche dei linfociti B). A causa di questo difetto, l organismo è incapace di difendersi nei confronti di qualsiasi agente infettivo: virus, batteri, funghi. Si tratta quindi di patologie molto gravi, che portano rapidamente a morte a meno che non si intervenga attraverso il trapianto di midollo osseo. La SCID colpisce 1 su nati vivi. Gli individui affetti da SCID nelle prime settimane di vita non presentano sintomi, dal momento che probabilmente sono ancora protetti dagli anticorpi trasmessi dalla madre attraverso la placenta, ancora in circolo nel sangue. Dai tre ai sei mesi compaiono i primi sintomi, cioè una particolare suscettibilità alle infezioni intestinali e respiratorie, anche a quelle meno aggressive quali la candidiasi. I geni coinvolti nell insorgenza della SCID sono numerosi e quindi troviamo differenti varietà di questa sindrome che proprio dal gene mutato, o dalla proteina correlata assente, prendono il nome. Alcuni esempi sono: il deficit di catena gamma, il deficit di chinasi JAK3, il deficit di purine nucleoside phosphorilase (PNP), il deficit di adenosin deaminasi (ADA), il deficit di MHC di classe II. Nei pazienti con SCID il blocco della produzione di linfociti porta ad immunodeficienza. Mutazioni germinali dei geni necessari per la produzione, la sopravvivenza o la funzione dei linfociti causano varie forme di SCID, con cellule B, T e NK assenti o non funzionali. Il blocco della produzione di cellule immunocompetenti nei pazienti con SCID porta all espansione del pool di cellule progenitrici (CLPs). Il numero di cellule CD34+ ematopoietiche staminali progenitrici presenti nel midollo osseo dei bambini con X linked SCID è relativamente alto, ad indicare che il pool di cellule progenitrici è espanso per l assenza di catene γc, che sono richieste per il signalling delle citochine e la differenziazione delle CLP. La correzione genica delle cellule ematopoietiche e progenitrici porta alla ricostituzione della capacità immunitaria. Nella terapia genica per la SCID X linked viene utilizzato un vettore retrovirale per trasferire il γc cdna umano normale nelle cellule staminali ematopoietiche pluripotenti isolate dal midollo osseo del paziente. L espressione di γc ripristina la risposta delle citochine e permette la differenziazione delle CLP in cellule B, T e NK. Il successo della terapia genica in questi pazienti potrebbe essere dovuto all ampio pool di cellule progenitrici disponibili per la trasduzione e all elevato livello di innesto delle cellule geneticamente corrette, dovuto all assenza di linfociti endogeni maturi. SINDROME DI WISKOTT ALDRICH È un immunodeficienza congenita ad eredità recessiva legata all X; colpisce circa un neonato ogni maschi. Il gene malattia è localizzato sul braccio corto del cromosoma X nella regione p11.2 ed è stato chiamato WASP (Wiskott Aldrich Syndrome Protein). WASP codifica per una proteina espressa selettivamente nelle cellule ematopoietiche necessaria ai processi di riorganizzazione del citoscheletro, e in particolare alla polimerizzazione dell actina. Attraverso il legame con la GTPasi Cdc42, la proteina WASP collega fenomeni di attivazione cellulare con la riorganizzazione del citoscheletro e quindi con la risposta biologica della cellula agli stessi stimoli di attivazione. La malattia è caratterizzata dalla triade: infezioni ricorrenti causate dal deficit di linfociti T e B;

6 16 L. Chessa emorragie causate da carenza di piastrine nel sangue; eczema. La WAS è classificata come immunodeficienza combinata, poiché il deficit immunitario colpisce sia i linfociti B che i T. Il deficit immunitario, pur interessando sia i B che i T, è parziale; in particolare, i pazienti WAS sono capaci di produrre anticorpi contro certi microrganismi (come il tetano) ma sono incapaci di produrne contro altri germi, come l Haemophilus influenzae o lo pneumococco, che presentano sulla loro membrana antigeni polisaccaridici. A causa di questo difetto i pazienti WAS sviluppano frequenti e/o ricorrenti otiti, polmoniti e perfino meningiti. Il numero dei linfociti T è normale alla nascita, ma diminuisce progressivamente nel tempo; inoltre, essi presentano difetti funzionali. A causa di queste alterazioni i pazienti WAS possono sviluppare infezioni da germi opportunisti come la Candida, lo Pneumocistis jirovecii o gli herpesvirus. Le piastrine sono presenti in un numero marcatamente ridotto, intorno alle , e sono molto più piccole (circa la metà) rispetto a quelle normali. A causa di questa trombocitopenia possono insorgere emorragie sulle mucose (cavo orale) o negli organi interni, sia spontaneamente, sia a seguito di piccoli traumi. Le dimensioni ridotte delle piastrine costituiscono il miglior test per confermare la diagnosi di WAS in un bambino con trombocitopenia, in quanto essa è l unica patologia conosciuta con questa caratteristica. Infine, in quasi tutti i pazienti con la WAS è ricorrente l eczema, in forma leggera in alcuni pazienti, fastidioso e ribelle alla terapia in altri. Sindrome di DiGeorge (catch22) La sindrome di DiGeorge o aplasia timica è una delle poche malattie da carenza immunitaria da deficit di linfociti T i cui sintomi si manifestano subito dopo la nascita, a causa di un difetto embrio morfogenetico. I pazienti presentano ipoplasia del timo e delle paratiroidi, con la caratteristica sintomatologia ipocalcemica (tetania, convulsioni) che si verifica nelle prime 24 ore di vita, malformazioni cardiache con difetti settali e interruzione dell arco aortico e mancata chiusura del dotto arterioso, basso impianto auricolare, ipoplasia mandibolare e palatoschisi. L ipocalcemia di questi soggetti è permanente. Questa sindrome causa l insorgenza di infezioni spesso letali. In un ristretto numero di casi è indicato il trapianto di timo fetale e l ipoparatiroidismo va curato con calcio al quale si deve aggiungere vitamina D o paratormone. La CATCH22 (Cardiac anomalies, Abnormal facies, Thymic hypo/a plasia, Cleft palate, Hypocalcaemia) è causata dalla microdelezione, generalmente de novo, della regione genica 22q11.2; colpisce 1/4000 nati. Atassia Telangiectasia (At) L Atassia Telangiectasia è una malattia ad eredità autosomica recessiva, con una frequenza di 1/ nati, caratterizzata da atassia cerebellare progressiva, telangiectasie oculocutanee, infezioni broncopolmonari ricorrenti, deficit di IgA, aumento di alfafetoproteina, difetti endocrini, anomalie ecocardiografiche, ipersensibilità alle radiazioni ionizzanti, predisposizione a leucemie e linfomi T. A livello cellulare si notano un aumento delle rotture cromosomiche

7 Il genetista nella diagnosi delle immunodeficienze 17 spontanee e indotte da radiazioni ionizzanti e da radiomimetici; la presenza di riarrangiamenti cromosomici coinvolgenti soprattutto i cromosomi 7 e 14 nei loci delle immunoglobuline e dei T cell receptors; la sintesi di DNA radioresistente dopo danno al DNA, per il mancato funzionamento dei punti di controllo del ciclo cellulare. Il gene responsabile della malattia appartiene ad una famiglia di geni ben conservati nella scala evolutiva che regolano i punti di controllo del ciclo cellulare e la morte cellulare programmata. Il gene codifica per la proteina ATM che presenta un sito catalitico di tipo fosfatidilinositol 3 chinasico ed è espressa in maniera costante nelle cellule degli individui non mutati. Le mutazioni del gene ATM sono generalmente delezioni, più raramente inserzioni o sostituzioni di base, e nella maggior parte dei casi originano un prodotto proteico tronco, non funzionante. I possibili meccanismi di immunodeficienza in AT sono riconducibili a: ricombinazione V(D)J difettiva; disfunzione timica; repertorio ristretto; funzione linfocitaria difettiva. bibliografia essenziale Bachmeyer C., Monge M., Cazier A., Le Deist F., de Saint Basile G., Durandy A., Fischer A., Mougeot Martin M., Gastric adenocarcinoma in a patient with X linked agammaglobulinaemia. Eur J Gastroenterol Hepatol 12, , 2000 Conley M.E., Dobbs A.K., Farmer D.M., Kilic S., Paris K., Grigoriadou S., Coustan Smith E., Howard V., Campana D., Primary B cell immunodeficiencies: comparisons and contrasts. Annu Rev Immunol 27, , 2009 Devriendt K., Kim A.S., Mathijs G., Frints S.G.M., Schwartz M., Van den Oord J.J., Verhoef G.E.G., Boogaerts M.A., Fryns J. P., You D., Rosen M.K., Vandenberghe P., Constitutively activating mutation in WASP causes X linked severe congenital neutropenia. Nature Genet 27, , 2001 Jawad A.F., McDonald Mc- Ginn D.M., Zackai E., Sullivan K.E., Immunologic features of chromosome 22q11.2 deletion syndrome (DiGeorge syndrome/velocardiofacial syndrome). J Pediat 139, , 2001 Lavin M.F., Delia D., Chessa L., ATM and DNA damage response. EMBO Rep 7, , 2006 Marodi L., Notarangelo L.D., Immunological and genetic bases of new primary immunodeficiencies. Nature Reviews/Immunology 7, , 2007 Park M.A., Hagan J.B., Maddox D.E., Abraham R.S., Common variable immunodeficiency: a new look at an old disease. Lancet 372, , 2008