C. I. di Genetica e Biol. Mol. GENETICA

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1 C. I. di Genetica e Biol. Mol. GENETICA a.a Prof. Pier Franco Pignatti Lezioni N Mutazione, mutagenesi e malattie da difetto di riparazione Neri-Genuardi cap. 10 Xeroderma Pigmentoso, Atassia Teleangiectasia, Anemia di Fanconi, S. Bloom, S. Lynch

2 Conversione genica Scambio non reciproco Connor e Ferguson-Smith, Essential Medical Genetics, Blackwell 1993

3 Ricombinazione gene CYP21 Geni CYP21 e C4 del complemento duplicati nella regione HLA. 21A: pseudogene. 21B: gene espresso steroido-21-idrossilasi. Mutazioni 21B: iperplasia surrenale congenita con diminuita produzione di cortisolo. Tre forme: con perdita di sali, semplice virilizzante, o attenuata con inizio tardivo solo nelle femmine

4 Microconversione: mutazioni CYP21derivano dallo pseudogene Strachan e Read, Genetica Umana Molecolare, UTET 2000

5 Inversione Lewin B, Il Gene, Zanichelli 1985

6 Inversione gene F8 ed emofilia Rettangoli rossi: sequenza nell introne 22 e due copie invertite a monte del gene. Nella meiosi maschile non c è partner: si può formare un ansa con due copie appaiate con lo stesso orientamento. La ricombinazione produce una inversione cromosomica di circa 500 kb che interrompe il gene. Il 40% dei casi gravi di emofilia A è provocato da inversione

7 Trasposizione I trasposoni sono stati scoperti da Barbara McClintock nel mais negli anni 40 Premio Nobel nel 1983

8 Trasposizione replicativa Es: il retrotrasposone L1 si può inserire nei geni F-VIII o DMD: inattivazione inserzionale

9 Variazioni in gemelli MZ da retrotrasposizione con inserzione di L1 Gemelli geneticamente identici al concepimento, ma alla nascita i loro cervelli sono diversi a causa di nuove inserzioni L1 che avvengono durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale nel feto. In relazione ai geni bersaglio ed ai neuroni colpiti dalle inserzioni, i gemelli possono essere diversi nella funzione o disfunzione cerebrale Martin SL, Developmental biology: Jumping-gene roulette, Nature 2009

10 MUTAZIONI SPONTANEE Avvengono durante la vita normale della cellula, cioè in individui non esposti a mutageni o radiazioni. Costituiscono il materiale usato dalla selezione naturale per l evoluzione biologica. Cause possibili: tautomeria, deaminazione, depurinazione delle basi; radicali liberi; errori replicativi, riparativi o ricombinativi E. Friedberg, DNA Rapair, Freeman 1985

11 TAUTOMERIA delle BASI T-A G-C T en -G C- G C-G G en -T A- T A-T C im -A A im -C : errore repicativo per tautomeria : replicazione normale T- A G- C

12 DEAMINAZIONE C Me -G T-G T-A Le transizioni C/T rappresentano il 35-50% di tutte le mutazioni puntiformi nell uomo. Il dinucleotide CpG muta per deaminazione 8,5 volte più dell atteso: 5 Me C è hot spot di mutazione (anche C viene deaminata a U, ma il DNA può essere riparato)

13 DEPURINAZIONE T C G C C T A A G C G G A T T C C C T A A G C G G A T Sito AP In condizioni fisiologiche, sono perdute giornalmente circa purine per genoma di mammifero per rottura del legame beta-glicosidico

14 MUTAZIONI INDOTTE Mutageni fisici Radiazioni ionizzanti (raggi X, γ, cosmici, radioattività artificiale e naturale), radiazioni UV Mutageni chimici Deaminanti, analoghi delle basi, alchilanti, intercalanti, prodotti di pirolisi, sostanze naturali, prodotti sintetici

15 MUTAGENESI DA RAGGI X Hartl. Genetica Umana, Zanichelli 1986 (senza frazionamento di dose)

16 ESPOSIZIONE PRENATALE alle ESPLOSIONI ATOMICHE 8-15 settimane: divisione e migrazione delle cellule nervose nella corteccia cerebrale Curtoni et al, Manuale di Genetica, UTET 1991

17 EFFETTI DELL INCIDENTE NUCLEARE di CHERNOBYL (Aprile 1986)

18 EFFETTI DELLE RADIAZIONI UV anello ciclobutanico Un dimero di Timina è prodotto dalla formazione di legami covalenti fra basi adiacenti Lewin, Il gene IV, Zanichelli 1992

19 Alcuni MUTAGENI CHIMICI Deaminanti Analoghi delle basi Alchilanti Intercalanti Hartl, Genetica Umana, Zanichelli 1996

20 MUTAGENESI DA DEAMINANTI C-G HNO 2 A-T U-G U-A T-A H-T H-C G-C Modificazione della base Replicazione

21 MUTAGENESI DA ANALOGO DI BASE (BU) Errore di incorporazione C-G Errore di replicazione T-A BU en -G BU ch -A T-A BU ch -A BU en -G C-G

22 MUTAGENESI DA ALCHILANTI 7 alchil G 7 alchil G Magni, Quaderni di Biologia 11, Piccin 1976

23 MUTAGENESI DA INTERCALANTI La distorsione della doppia elica dovuta a inserzione di una molecola di acridina porta durante la replicazione a inserzione o delelezione di una singola coppia di basi Magni, Quaderni di Biologia 11, Piccin 1976

24 MUTAGENI AMBIENTALI Sostanze naturali: es. aflatossina Prodotti di pirolisi: es. cibi cotti, tabacco Prodotti sintetici: es. additivi alimentari, cosmetici, tinture permanenti capelli, farmaci citostatici e immunodepressivi, insetticidi e fungicidi, erbicidi e fitormoni, casa (ipoclorito sodio), lavoro (cloruro vinile, diossina), atmosfera (formaldeide, fumo di sigaretta)

25 MUTAGENI E CANCEROGENI Test di mutagenesi di Ames his - Revertenti his+ Test di Ames per tre tinture di capelli

26 IL COSTO UMANO DELL USO DEL TABACCO Più di 5 milioni di morti/anno: la prima causa mondiale di morte prematura prevenibile NEJM 330:907, 1994

27 Cancro del polmone Il fumo di sigaretta è la causa del 90% dei Ca del polmone. E carcinogeno per la presenza di più di 60 sostanze chimiche che legano e mutagenizzano il DNA. Si formano addotti ingombranti caratteristici alle basi puriniche, come 8-oxoG. Dallo studio con Next Generation Sequencing (NGS) del genoma di linee cellulari derivate da un tumore polmonare a piccole cellule (SCLC) si deduce che si forma circa una nuova mutazione ogni 15 sigarette fumate Pleasance ED et al, Nature 2010; Hecht SS, Nature

28 Ca polmone: scarsa riparazione di 8-oxoG Il 40% dei pazienti con Ca polmonare hanno bassa attività OGG1. I fumatori con bassa attività enzimatica sviluppano Ca polmonare con frequenza 5-10x rispetto ai fumatori con attività normale Brower V Nature

29 RISPOSTA al DANNO del DNA Rovesciamento del danno: fotoriattivazione, riparo di O 6 -alchilg, inserzione di Pu, legatura di incisione (SSB), riparazione della rottura del doppio filamento (DSB) Excisione del danno: excisione di base (BER), di nucleotide (NER), accoppiata a trascrizione (TC-NER), da accoppiamento errato (MMR) Tolleranza del danno: sintesi translesione (TLS) Friedberg E et al DNA repair and mutagenesis, ASM Press 2006

30 Riparazione e tolleranza del danno TOLLERANZA TLS : danno RIPARAZIONE MMR NER BER Friedberg, Nature 2003; 421:436

31 MALATTIE DA DIFETTO DI RIPARAZIONE (Malattie AR) XP Gruppi Compl. (2007) 9* AT FA 6 13 BS 1-2 *XP: es. gruppo D (DNA elicasi), E (DNA BP), Curtoni et al, Manuale di Genetica, UTET 1991

32 Test di complementazione Strachan e Read, Genetica umana molecolare, UTET 2001, p.61 Test per deficit riparazione del DNA: cellule di un paziente sono trasformate con DNA umano normale o estratto da pazienti con altro gene malattia che ripristina fenotipo N

33 XERODERMA PIGMENTOSUM (XP) RR Ca cute: x Friedberg DNA repair Freeman 1985

34 Difetto di riparazione in cellule XP c.normali irradiate c.xp irradiate Test UDS: in XP non c è sintesi di DNA in cellule non in fase S Difetto NER (e TLS, difetto di sintesi translesione: mutazioni di Pol eta, responsabile di sintesi translesione di dimeri di Timina incorporando correttamente due A, producono XPV, la forma variante di XP)

35 ATASSIA TELEANGIECTASIA (AT) Friedberg, DNA repair, Freeman 1985

36 Riparazione in Atassia Teleangiectasia Test crescita cellulare Test incorporazione H 3 T Gene ATM (AT Mutated): sensore del danno al DNA. Difetto di risposta alle rotture del DNA Friedberg E, DNA Repair, Freeman 1985