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Daniele Mantovani
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Seconda Università degli Studi di Napoli FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA INTERFACOLTÀ IN BIOTECNOLOGIE TESI DI LAUREA METODOLOGICO-SPERIMENTALE IN BIOTECNOLOGIE

1 Seconda Università degli Studi di Napoli FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA INTERFACOLTÀ IN BIOTECNOLOGIE TESI DI LAUREA METODOLOGICO-SPERIMENTALE IN BIOTECNOLOGIE GENETICHE METODICHE DI ISOLAMENTO E DI CARATTERIZZAZIONE DI BATTERI PROBIOTICI IN LATTE E DERIVATI RELATORE: Ch. ma Prof. Bruna De Felice CANDIDATO: Matr.957/23 Francesco Netti Anno accademico 2007/2008 0

2 Capitolo I LATTE E DERIVATI 1.1 Il latte Il latte alimentare rappresenta, per definizione, il prodotto ottenuto dalla mungitura regolare, ininterrotta e completa della mammella di animali in buono stato di salute e di nutrizione. Chimicamente, il latte contiene in percentuale: Acqua (87-88%): mezzo disperdente (solvente); Glucidi (4,6-5,0%); Lipidi (3,2-3,8%); Minerali (0,7-1,0%). Per quanto riguarda i glucidi, lo zucchero maggiormente contenuto nel latte è il lattosio (sintetizzato nella ghiandola mammaria a partire dal glucosio). Esso è ad assorbimento lento e può subire varie modificazioni e alterazione ad opera dei batteri lattici. Oltre che nel latte, esso è presente anche nei suoi derivati (formaggi e yogurt) e in prodotti a base di siero di latte. In particolare nel siero il lattosio costituisce circa il 70% della massa secca e può essere isolato per concentrazione e successiva cristallizzazione. Chimicamente il lattosio è un disaccaride costituito da galattosio e glucosio. 8

Fig. 1.1. In alto e a destra, è rappresentata la struttura chimica del lattosio, con particolare riferimento al legame glicosidico, il quale tiene insieme un unità di galattosio e un unità di glucosio.

Essi possono essere di due tipi a catena lunga (di origine alimentare per cui maggiore è il loro introito nella dieta dell animale maggiore è la loro presenza nel latte) o a catena corta (ossia

3 Fig In alto e a destra, è rappresentata la struttura chimica del lattosio, con particolare riferimento al legame glicosidico, il quale tiene insieme un unità di galattosio e un unità di glucosio. Per quanto riguarda i lipidi, essi chimicamente sono presenti sotto forma di globuli. Essi possono essere di due tipi a catena lunga (di origine alimentare per cui maggiore è il loro introito nella dieta dell animale maggiore è la loro presenza nel latte) o a catena corta (ossia quelli che sono sintetizzati a partire dall acetato e provenienti dalla ghiandola mammaria). Gli acidi grassi tipici del latte sono gli acido butirrico (C 4:0), l acido capronico (C 6:0), acido caprilico (C 8:0) e acido caprinico (C 10:0). Altri lipidi contenuti nel latte sono trigliceridi, fosfolipidi, steroli. Per quanto riguarda le proteine, il latte in percentuale contiene due tipologie di proteine: Caseine (78%): sono le più abbondanti presenti nel latte. Esse rappresentano un gruppo eterogeneo di fosfoproteine ad elevato contenuto in residui fosforilati di serina e prolina; queste fosfoproteine sono elaborate esclusivamente dalla ghiandola mammaria dalla cui coagulazione si forma il formaggio. A causa della loro relativa idrofobicità, nelle condizioni ioniche 9

4 del latte si associano a formare micelle (dimensione nm). Esse sono molto ricche in Ca, P, e Mg. Infine, esse non coagulano al calore, coagulano in presenza di acidi a ph 4.6 ed in presenza di enzimi proteolitici di origine animale contenuti nel caglio; Proteine del siero (22%): comprendono albumine, globulina, proteasi e peptoni. Chimicamente sono termolabili e durante la trasformazione del latte in formaggio restano disciolte nella parte liquida, detta siero del latte (da qui il nome proteine del siero). Il latte contiene un elevato numero di enzimi. Alcuni dei quali determinano la stabilità dei componenti del latte durante lo stoccaggio (lipasi e proteasi che attaccano i grassi e le proteine). Altri enzimi hanno la caratteristica di essere inattivati da un processo termico più o meno spinto (perossidasi e fosfatasi alcalina rispettivamente) e vengono impiegati come traccianti del trattamento termico. Ultima componente del latte sono i sali minerali, i quali rappresentano dei componenti essenziali della materia vivente che intervengono sia nella costituzione delle ossa, sia nell attività funzionale dei tessuti. In particolare, il contenuto in sostanza inorganiche, pari a oltre 7g per litro di latte, concorre alla formazione di nuova materia vivente ed alla costituzione di quella in via d usura. Unica eccezione risulta il ferro, che si trova in quantità insufficiente, mentre tutti gli altri elementi di cui ha bisogno l organismo sono contenuti nel latte in rapporti proporzionali e completamente assimilabili. Tra i macroelementi ricordiamo Ca, K, P, Mg; tra gli oligoelementi ricordiamo soprattutto Zn e Si. 10

Esistono vari tipi di latte, che variano in base al contenuto in grassi. In particolare tre sono le categorie di latte presenti in commercio: latte intero, contenente almeno il 3.

5 Fig.1.2. In alto, è mostrata la tabella dei valori di sali minerali presenti nel latte in grammi per litro. Il valore nutritivo del latte, infine, è massimo per la specie che lo produce e la specificità di composizione richiede modifiche fondamentali per l uso in specie diverse. Esistono vari tipi di latte, che variano in base al contenuto in grassi. In particolare tre sono le categorie di latte presenti in commercio: latte intero, contenente almeno il 3.2% di grasso; latte parzialmente scremato, contenente almeno da 1% a 1.8% di grasso; latte scremato, contenente meno dello 0.5% di grasso. Inoltre, il contenuto dei macronutrienti varia anche da specie a specie animale. In questa tabella, è messo in evidenza come il latte di bufala presenti il maggiore quantitativo in grammi di grassi (7.5g). 7,5 11

6 Questo spiega il motivo per cui la mozzarella di bufala sia ottenuta, miscelando il latte di bufala a latte di vacca al fine di abbassarne il contenuto di grassi. In particolare, il latte utilizzato per la nostra analisi è stato quello vaccino fresco appena munto senza che abbia subito alcun trattamento a caldo di pastorizzazione o sterilizzazione. 1.2 Lo yogurt Introduzione Tra i microrganismi coinvolti nella preparazione di alimenti fermentati, i batteri lattici vengono utilizzati nella produzione di una grande varietà di alimenti fermentati, come derivati del latte (yogurt e fermenti lattici), della carne, di vegetali, di prodotti da forno, contribuendo in vari modi nel determinare le loro caratteristiche e la loro stabilità. Il loro primo riconoscimento è avvenuto, nel 1857, da parte di Pasteur, mentre il primo isolamento in coltura pura nel 1878 da parte di Lister, che identificò la specie Bacterium lactis (oggi Lactococcus lactis). Solo nel 1890 fu utilizzata la prima coltura starter per la produzione di formaggi, aprendo la strada per l industrializzazione delle fermentazioni alimentari. Da allora molte ricerche sono state condotte in questo campo portando a quello che oggi noi conosciamo come probiotica. I batteri lattici sono considerati a tutti gli effetti organismi di grado alimentare e la maggior parte di essi presentano un elevato profilo di sicurezza; per questo motivo, essi sono denominati anche GRAS (generally recognised as safe). 12

7 Molte specie di batteri lattici, infatti, rappresentano i principali microrganismi dotati di proprietà probiotiche e dunque in grado di contribuire positivamente al mantenimento e al miglioramento della salute dell uomo Definizione e caratteristiche Lo yogurt è un latte fermentato di origine antica. Oggi viene prodotto artigianalmente o industrialmente mediante innesto con colture selezionate di Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus. Le proprietà salutistiche dello yogurt sono note, e sono dovute ai due batteri lattici che operano in sinergia apportando delle profonde trasformazioni di natura fisica, chimica, batteriologica, organolettica e nutrizionale, e modificando completamente le caratteristiche del latte. All inizio della fermentazione, che avviene a 42 C per 3 ore si ha una rapida crescita di Streptococcus thermophilus che rende il latte anaerobio e debolmente acido, successivamente si verifica un aumento dell acidità per l intervento di Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. L azione combinata delle due specie consente la fermentazione di quasi tutto il lattosio con produzione di acido lattico. L acido lattico svolge un attività antinfettiva, regola la flora intestinale e stimola le difese immunitarie. Questi batteri inoltre aromatizzano lo yogurt producendo diacetile (Streptococcus thermophilus) e acetaldeide (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus), sintetizzano vitamine e arricchiscono lo yogurt in sali minerali, facendone un alimento completo. Per sfruttare l attività probiotica dei batteri lattici è bene consumare lo yogurt regolarmente e quando i batteri lattici sono vivi, vitali e in numero elevato. Elaborando i dati raccolti dall Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio- Toscana, ottenuti analizzando un centinaio di campioni di yogurt a diversi giorni dalla data di scadenza, è stato possibile descrivere mediante grafici l evoluzione della microflora lattica. Per la valutazione della densità di Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus sono stati utilizzati due specifici terreni di coltura selettivi solidi: 13

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