High Performance IP Processo semiautomatizzato con PureSpeed

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1 Puntali PureSpeed Immunoprecipitazione più veloce Proteine più concentrate Eccellente qualità dei dati IP diretta e indiretta Fino a 12 campioni in una sola volta High Performance IP Processo semiautomatizzato con PureSpeed

2 Puntali per proteine PureSpeed Immunoprecipitazione veloce Proteina di qualità e ad alta concentrazione Protocolli di IP diretta e indiretta Fino a 12 campioni analizzati contemporaneamente in meno di 30 minuti Richiede meno impegno rispetto ai metodi con biglie magnetiche o di agarosio Rispetto alle tecniche con biglie magnetiche o di agarosio offre una elevata riproducibilità campione-campione con fondo trascurabile Registra e documenta automaticamente i protocolli di IP, aumentando la riproducibilità intra-lab e inter-lab Per garantire ai ricercatori la sicurezza dei risultati e ridurre le probabilità di ripetere gli esperimenti, la IP deve assicurare segnali forti e riproducibili. Il sistema PureSpeed IP di Rainin applica una tecnologia innovativa che permette ai ricercatori di controllare gli esperimenti e ottimizzarne i risultati. Il sistema PureSpeed IP di Rainin produce bande di proteine di intensità e riproducibilità superiori su gel SDS-PAGE. La fase di lavaggio dei puntali ProA e ProG PureSpeed elimina le proteine contaminate dal complesso anticorpo-antigene legato, producendo dati SDS-PAGE con fondo minimo un fattore critico per giungere a conclusioni accurate. PureSpeed IP produce proteine più concentrate, con un segnale più forte rispetto alle tecniche della concorrenza. Questo riduce al minimo la necessità di ripetere gli esperimenti. La tecnologia di IP di PureSpeed ottiene proteine più concentrate in meno tempo e a un costo inferiore rispetto ai metodi basati su biglie magnetiche o di agarosio. 2

3 I vantaggi di PureSpeed Il sistema PureSpeed Rainin per l'immunoprecipitazione offre prestazioni impareggiabili. I metodi che si avvalgono di biglie di agarosio e magnetiche in genere analizzano un campione alla volta, mentre PureSpeed è in grado di analizzare fino a 12 campioni in parallelo, in meno di 30 minuti. PureSpeed/biglie di agarosio e magnetiche a confronto: analisi di 12 campioni PureSpeed 26 min. e Preparazione del campione in parallelo Biglie di agarosio Biglie magnetiche 252 o 116 min. Preparazione del campione in sequenza Con PureSpeed l'immunoprecipitazione delle proteine raggiunge velocità comparabili a quelle dei sistemi automatici, ma al costo di un sistema manuale. 3

4 Puntali per proteine PureSpeed Il massimo in termini di flessibilità Validato per IP diretta e indiretta La maggior parte dei prodotti per IP disponibili sul mercato è certificata per la IP diretta o indiretta, mentre PureSpeed è in grado di eseguirle entrambe, offrendo i ricercatori la massima flessibilità. Il metodo diretto prevede di legare un anticorpo specifico su una resina immobilizzante contenuta nel puntale di PureSpeed, quindi di catturare l'antigene desiderato sulla resina. Il metodo indiretto lega il complesso anticorpo/antigene alla resina nel puntale. Con PureSpeed IP, la IP diretta per 1-12 campioni richiede circa 50 minuti, mentre la IP indiretta per 1-12 campioni normalmente non impiega più di 30 minuti. Figura 1. IP diretta e indiretta. A IP diretta B IP indiretta Con la IP diretta, l'anticorpo viene esposto a una resina legante (1). L'anticorpo si lega, l'eccesso viene lavato (2). Dopo l'immobilizzazione dell'anticorpo, la soluzione proteica contenente la proteina antigene viene esposta alla resina (3). L'anticorpo immobilizzato si lega alla proteina antigene, immobilizzandola sulla resina (4). Dopo il lavaggio finalizzato a rimuovere le proteine non specifiche legate, il complesso antigene-anticorpo risulta essere la specie predominante sulla resina (5). Infine, il complesso anticorpo-antigene viene eluito dalla resina (6). Con la IP indiretta, viene preparata una soluzione proteica contenente la proteina antigene (1). L'anticorpo viene aggiunto al campione e si lega all'antigene (2). Successivamente la miscela proteica contenente antigene-anticorpo si applica sulla resina legante (3). Il complesso anticorpo-antigene si lega alla resina come le proteine non specifiche (4). Dopo il lavaggio, il complesso anticorpo-antigene è la specie predominante sulla resina (5). Infine, il complesso antigeneanticorpo viene eluito dalla resina (6). 4

5 Pipetta elettronica E4 XLS Esegue e registra ogni fase del protocollo La riproducibilità dei risultati di IP è una considerazione importante nella convalida delle ipotesi e, in ultima analisi, ai fini della pubblicazione. Se i ricercatori di uno o più laboratori ottengono risultati diversi, spesso per fare luce sull'esito dell'esperimento occorrono altro tempo e denaro. La pipetta elettronica Rainin E4 XLS è un componente sostanziale del sistema di IP PureSpeed. Oltre a svolgere quasi tutte le fasi del protocollo di IP, la E4 XLS registra i volumi di cattura, lavaggio ed eluizione, la velocità di pipettaggio, le aliquote e il numero di cicli di pipettaggio. Documentandone e registrandone ogni aspetto, è possibile definire le condizioni per il buon esito dell'esperimento di IP agevolmente e in modo accurato. Selezione della modalità Una volta completata l'installazione, PureSpeed diviene una delle modalità standard nel menu a carosello delle opzioni dell'e4 XLS. Personalizzazione del protocollo Che si tratti del volume di un campione, di un valore di portata o del numero dei cicli, ogni fase del protocollo di purificazione delle proteine può essere facilmente richiamata e modificata ai fini di un impiego ottimale in specifiche applicazioni. Esecuzione del protocollo I protocolli PureSpeed traggono il massimo vantaggio dall'utilizzo dell'e4 grazie al joystick di comando intuitivo e di facile impiego e alla struttura dei menu a carosello. I tasti funzione dell'e4 consentono all'operatore di navigare attraverso le varie fasi del protocollo. 5

6 Puntali per proteine PureSpeed Confronto fra PureSpeed ed altre tecniche di IP Più veloce, proteina più concentrata IP PureSpeed risultati più veloci e proteina più concentrata rispetto alle tecniche con biglie magnetiche o di agarosio Per questo esperimento, 5 μg di antigene marcato con GST sono stati aggiunti a 200 μl su 625 μg/ml totali di campione di proteina di E. coli. 10 μg di anticorpo monoclonale α-gst sono stati impiegati per immunoprecipitare la proteina antigene marcata con GST impiegando il metodo diretto e indiretto. Per il metodo diretto, la IP eseguita con il sistema PureSpeed e puntali ProG da 20 μl è stata confrontata con il metodo della proteina G su biglie magnetiche di un'altra azienda. Per il metodo indiretto, la IP eseguita con il sistema PureSpeed e puntali ProG da 20 μl è stata confrontata con il metodo della proteina G su biglie di agarosio di un'altra azienda. I campioni sperimentali che includevano anticorpo e proteina antigene sono stati processati tre volte per meglio comprendere le caratteristiche di ripetibilità di ciascuna tecnica. Sono state eseguite anche reazioni di controllo con omissione di anticorpo, antigene o entrambe le specie, al fine di verificare il legame di proteine non specifiche alle resine di proteina G. A confronto con le altre tecniche, i risultati mostrano che i puntali ProG di PureSpeed hanno eseguito gli esperimenti di IP più velocemente, producendo una proteina molto più concentrata rispetto agli altri metodi diretti o indiretti. 6

7 Anticorpo α-gst Antigene marcato con GST Proteina di E. coli PureSpeed Biglie magnetiche kda 66 kda 45 kda Catena pesante anticorpo Proteina antigene 31 kda Catena leggera anticorpo L S P 50 min per 6 campioni S M 69 min per 6 campioni Figura 2. IP diretta con puntali PureSpeed ProG e proteina G su biglie magnetiche di un'azienda concorrente. In questo esperimento, 10 μg di anticorpo sono stati impiegati per immunoprecipitare 5 μg di antigene marcato con GST utilizzando il metodo diretto con puntali PureSpeed ProG o proteina G su biglie magnetiche di un'azienda concorrente. Le reazioni di IP si sono verificate in 125 μg di proteina di E. coli (volume totale 200 μl). La scala delle proteine è indicata con L, mentre le soluzioni proteiche (contenenti l'antigene per il metodo diretto) sono etichettate S P e S M, (dove P ed M indicano rispettivamente la soluzione per il protocollo PureSpeed e per quello con le biglie magnetiche). Gli eluati dei campioni per IP con PureSpeed e con biglie magnetiche sono rispettivamente collocati nelle file 3-8 e I segni più e meno indicano l'inclusione o esclusione di un determinato componente da una reazione di IP. Infine, i minuti indicati in basso corrispondono al tempo necessario per ciascun protocollo. Anticorpo α-gst Antigene marcato con GST Proteina di E. coli PureSpeed Biglie di agarosio kda 66 kda 45 kda Catena pesante anticorpo Proteina antigene 31 kda Catena leggera anticorpo L S P 30 min per 6 campioni S A 190 min per 6 campioni Figura 3. IP indiretta con puntali PureSpeed Protein G e proteina G su biglie di agarosio. In questo esperimento, 10 μg di anticorpo sono stati impiegati per immunoprecipitare 5 μg di antigene marcato con GST utilizzando il metodo indiretto con puntali PureSpeed Protein G o proteina G su biglie di agarosio. Le reazioni di IP si sono verificate in 125 μg di proteina di E. coli (volume totale 200 μl). La scala delle proteine è indicata con L, mentre le soluzioni proteiche (contenenti l'antigene per il metodo diretto) sono etichettate S P ed S A, (dove P e A distinguono le soluzioni proteiche usate rispettivamente per i campioni PureSpeed e proteina G su agarosio). Gli eluati dei campioni per IP con PureSpeed e con proteina G su agarosio sono rispettivamente collocati nelle file 3-8 e I segni più e meno indicano l'inclusione o esclusione di un determinato componente da una reazione di IP. Infine, i minuti indicati in basso corrispondono al tempo necessario per ciascun protocollo. *Il tempo della IP indiretta non include l'incubazione dei campioni a 4 C per una notte. L'incubazione è illustrata in figura 1B, passaggio 2. 7

8 PureSpeed per IP Immunoprecipitazione ad alte prestazioni Il sistema PureSpeed per IP include puntali PureSpeed ProA o ProG, la pipetta elettronica E4 XLS e il kit di accessori PureSpeed. I puntali PureSpeed ProA o ProG sono disponibili con 5 o 20 μl di resina (volume max. 200 μl ) e 20 o 80 μl di resina (volume max μl ). Impostate rapidamente i vostri esperimenti di IP con gli starter kit PureSpeed. I kit multicanale analizzano fino a 12 campioni in parallelo. Numero di catalogo Numero d'ordine MT Descrizione Puntali e accessori PureSpeed PT-2-A Resina ProA 5 µl, puntale da 200 µl, 12 puntali PT-2-A Resina ProA 20 µl, puntale da 200 µl, 12 puntali PT-2-G Resina ProG 5 µl, puntale da 200 µl, 12 puntali PT-2-G Resina ProG 20 µl, puntale da 200 µl, 12 puntali PT-10-A Resina ProA 20 µl, puntale da 1000 µl, 12 puntali PT-10-A Resina ProA 80 µl, puntale da 1000 µl, 12 puntali PT-10-G Resina ProG 20 µl, puntale da 1000 µl, 12 puntali PT-10-G Resina ProG 80 µl, puntale da 1000 µl, 12 puntali PT-ACC Accessori PureSpeed LR-P2-96P Piastra a 96 pozzetti profondi da 2,2 ml Starter Kit PureSpeed monocanale PT-S2-A Starter Kit: E4-200XLS + puntali ProA PureSpeed PT-S2-G Starter Kit: E4-200XLS + puntali ProG PureSpeed PT-S10-A Starter Kit: E4-1000XLS + puntali ProA PureSpeed PT-S10-G Starter Kit: E4-1000XLS + puntali ProG PureSpeed Starter Kit PureSpeed multicanale PT-S2-E Starter Kit: E8-200 XLS e Kit accessori PT-S10-E Starter Kit: E XLS e Kit accessori PT-S2-E Starter Kit: E XLS e Kit accessori PT-S10-E Starter Kit: E XLS e Kit accessori I puntali PureSpeed Rainin sono adatti a pipette E4 XLS dotate di LTS. Rainin, Pipetting 360,LTS E4, XLS, PureSpeed e High Performance IP sono marchi depositati di Rainin Instrument, LLC e Mettler-Toledo, Inc. Certificazione di qualità ISO9001 Certificazione ambientale ISO14001 neutral Stampato No myclimate The Climate Protection Partnership Soggetto a modifiche tecniche 5/2012 Mettler-Toledo AG Stampato in Svizzera Marketing Rainin Europa Global MarCom Svizzera Stampato su carta certificata FSC.