Le sequenze consenso

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1 Le sequenze consenso Si definisce sequenza consenso una sequenza derivata da un multiallineamento che presenta solo i residui più conservati per ogni posizione riassume un multiallineamento. non è identica a nessuna delle proteine del dataset. si possono definire dei simboli che la definiscano e che indichino anche conservazioni non perfette in una posizione. è possibile utilizzare una formattazione precisa che permetta di capire anche le variazioni in una posizione, non solo le conservazioni. Alcuni modi di indicare le sequenze consenso WebLogo è una risorsa in rete per generare sequenze consenso Consenso esatto Consenso a simboli GRVQGV--R------A--LG -GWV GRVQGh-aRvvvvvvAvvLGivGWV GRVQG[VI]-[FY]R------A L----GWY GRVQGV--R-6A LG--GWV Consenso con variazioni Consenso con ripetizioni 1

2 I PATTERN 2

3 DEFINIZIONE DI PATTERN E SUA CODIFICA I pattern sono espressioni regolari che danno un significato solo ed esclusivamente qualitativo delle porzioni conservate in un allineamento multiplo. Sono un consenso a maggioranza delle posizioni conservate,ad esempio, di un sito funzionale o motivo comune in una famiglia proteica. Si costruiscono con espressione regolari e la loro determinazione ed annotazione viene fatta quasi esclusivamente a mano dall analisi delle regioni conservate in un allineamento. 3

4 COME SI COSTRUISCE UN PATTERN IN REALTA!!!!!!!! ALLINEAMENTI MULTIPLI Allineamento progressivo (Clustal) Metodi iterativi (Multalin) Metodi basati su zone comuni di sequenza conservate (Profili) Metodi statistici e modelli probabilistici (HMM) 4

5 PROFILI 1) Dato un allineamento multiplo M con L colonne, un profilo per M è una tabella in cui ciascuna colonna contiene numeri che indicano la frequenza con cui ciascun simbolo compare in quella posizione. 2) Sono una forma di punteggio dipendente dalla posizione (Position-Specific Scoring Matrix o PSSM). Un PSSM ha tante colonne quante quelle nell allineamento multiplo e 20 righe per ciascuno dei 20 amminoacidi + eventuali punteggi di penalizzazione per gli indels 3) Permettono di usare l informazione che si acquisisce durante l allineamento progressivo: grado di conservazione di un residuo in una certa posizione; presenza di gap in una certa posizione. Da queste PSSM possono esser calcolati i logo oppure le sequenze consenso. SONO INFORMAZIONI DI TIPO QUANTITATIVO OLTRE CHE QUALITATIVO 5

6 MATRICI DI FREQUENZA Sono matrici che a partire da un allineamento multiplo calcolano la frequenza di un amminoacido ovvero quante volte è stato trovato in quella posizione dell allineamento 6

7 MATRICI DI FREQUENZA 1) Calcolo della probabilità di avere la sequenza VTISCTG dalla matrice di frequenza: prodotto delle probabilità di V,T ecc. (le matrici non considerano gli INDELS sono valori fissi): 0.375* 0.375*0.25*0.375*1*0.375*0.25 = 0,0012 oppure il logaritmo naturale o in base 2 (log odds) ln(0.375)+ ln(0.375)+ ln(0.25)+ ln(0.375)+ ln(1)+ ln(0.375)+ ln(0.25) = ) Per capire se il punteggio è significativo dobbiamo confrontarlo con una distribuzione casuale come ad esempio il fatto che in ogni posizione dell allineamento ognuno dei 20 amminoacidi sia equiprobabile Nel caso che non ci sia alcun amminoacido trovato mai in nessuna posizione dell allineamento ovvero con frequenza 0, per evitare che il prodotto delle probabilità sia 0 o che il log allora attribuisco a tali AA un valore molto basso ovvero gli Pseudocounts Esempio di calcolo di pseudocount per L Alanina A che non c è in colonna V Q.. I Q.. R -.. S R.. MATRICI DI PESO o profili (Gribskov) Oltre alla frequenza degli AA in un allineamento multiplo si possono avere delle matrici di peso che considerano anche il peso degli amminoacidi ovvero della loro sostituibilità calcolata nelle matrici di sostituzione PAM o LOSUM. Nella matrice di peso si può notare come nella terza colonna l'aminoacido A, che è presente una volta sola nell'allineamento, ha un punteggio inferiore (-1) nei confronti dell'aminoacido M (+10) che non compare nell'allineamento. Quest'ultimo, però, è più simile agli aminoacidi L, I, V, F presenti in altre sequenze secondo i valori della matrice di sostituzione impiegata. Si è così ottenuto un profilo completo dell allineamento multiplo in grado di codificare le probabilità di ogni AA in ogni posizione dello stesso. 7

8 MATRICI DI PESO o profili (Gribskov) 8

9 PSI-LAST Position Specific Iterated LAST utilizza una procedura iterativa per cui tutte le sequenze che superano la soglia imposta partecipano alla creazione di un modello detto PSSM (Position Specific Substitution Matrix) utilizzata nei cicli successivi per ricercare sequenze evolutivamente distanti. la PSSM e' il "prodotto" della matrice di sostituzione con la matrice di frequenza calcolata dagli allineamenti della sequenza query contro gli hit che hanno superato la soglia imposta. nella fase successiva per la ricerca di nuovi hit la procedura rimane uguale a quella dell'algoritmo originale ma anziche' usare una matrice 20X20 di sostituzione (tipo LOSUM o PAM) la matrice sara' data dalla PSSM di dimensioni LX20 dove L e' la lunghezza della sequenza query. Il calcolo della PSSM prevede la normalizzazione delle sequenze ridondanti o sovrarappresentate nell'allineamento affinche' non sia calcolata in modo sbagliato la matrice di peso risultante. La soglia di penalita' per i gap rimane uguale in tutte le fasi iterative. 9

10 Procedura 1) Sequenza in input. 2) Ricerca di LAST. 3) Creazione di una PSSM a partire dall allineamento multiplo di tutti gli hit che superano un certo threshold. Procedura 4) Ricerca successiva con la PSSM ottenuta (ricerca di similarità profilo -> sequenze del database). 5) Creazione dell allineamento pairwise sulla base del profilo tra la sequenza di partenza ed i nuovi hit. 6) Creazione di una nuova PSSM se esistono nuovi hit sopra al threshold rispetto al ciclo precedente. Lo score di alcune sequenze precedentemente non sopra al threshold può aumentare e salire sopra la soglia imposta poiché potrebbero essere degli omologhi distanti di una famiglia genica che ha solo alcuni AA conservati (ad esempio quelli di un sito attivo) che pesano di più nell allineamento multiplo e quindi fanno aumentare lo score. 10

11 7) Ripeti dal punto 4 al 6 Procedura 8) La fine del processo avviene quando si arriva a convergenza ovvero non sono state trovate altre sequenze sopra al threshold rispetto al ciclo precedente In genere si compiono 4-6 iterazioni massimo per evitare fenomeni di deriva (drift, profile wander): la sequenza iniziale si può perdere durante le iterazioni se esiste una famiglia proteica numerosa simile alla stessa (crowding out). Esempio: A C 1) Sequenza in input 2) Ricerca di LAST procedura 3) Creazione di una PSSM a partire dall allineamento multiplo di tutti gli hit che superano un certo threshold 4) Ricerca successiva con la PSSM ottenuta (ricerca di similarità profilo -> sequenze del database) 5) Creazione dell allineamento pairwise sulla base del profilo tra la sequenza di partenza ed i nuovi hit 6) Creazione di una nuova PSSM se esistono nuovi hit sopra al threshold rispetto al ciclo precedente. Lo score di alcune sequenze precedentemente non sopra al threshold può aumentare e salire sopra la soglia imposta poiché potrebbero essere degli omologhi distanti di una famiglia genica che ha solo alcuni AA conservati (ad esempio quelli di un sito attivo) che pesano di più nell allineamento multiplo e quindi fanno aumentare lo score. 7) Ripeti dal punto 4 al 6 8) La fine del processo avviene quando si arriva a convergenza ovvero non sono state trovate altre sequenze sopra al threshold rispetto al ciclo precedente In genere si compiono 4-6 iterazioni massimo per evitare fenomeni di deriva 11

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