Fisiologia della crescita microbica

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1 Fisiologia della crescita microbica Gli ambienti naturali sono spesso caratterizzati da un insieme di fattori fisici e chimici e biotici tali da indurre condizioni che possono diventare critiche per la crescita di alcune specie microbiche. Per i microrganismi chemiorganotrofi (eterotrofi) un fattore ambientale che può ridurre la crescita e l'attività metabolica è la disponibilità di carbonio organico. In condizioni di carenza di carbonio le cellule rimangono vitali, anche se tendono a non formare colonie nei mezzi colturali tradizionali. Questi batteri mantengono tuttavia un'attività metabolica misurabile e pertanto sono stati chiamati vitali ma non colturabili (VBNC) (Roszak e Colwell, 1987). Il cosiddetto digiuno cronico, cioè una limitazione da carbonio molto severa (cronic starvation) o il digiuno assoluto, cioè l'assenza della fonte di carbonio (starvation) (Kock, 1985) possono indurre differenti stati fisiologici cellulari che influenzano addirittura le successive fasi di accrescimento generate da variazioni anche minime delle disponibilità nutrizionali. Si può affermare che presenza di certe specie microbiche in un ambiente è strettamente collegato alla loro abilità di superamento di un determinato stress, sia nutrizionale che biotico, che è fondamentale per garantire il perpetuarsi della specie microbica stessa nell habitat. Definizione di crescita batterica Per crescita si intende l aumento del numero di cellule (batteriche o fungine) in una popolazione cellulare microbica (sia monospecie che multispecie). Questo aumento può essere stimato anche in termini di incremento del carbonio biomassa. Le popolazioni batteriche hanno una modalità di crescita caratteristica definita come crescita esponenziale che è generalmente rappresentata in forma grafica riportando le variazioni del logaritmo del numero di cellule in funzione della durata dell evento di accrescimento (grafico semilogaritmico) La modalità di accrescicmento di una popolazione microbica iniziale può essere descritta da alcuni parametri delle crescita cellulare come il tempo medio di generazione (o tempo di duplicazione cellulare) e la velocità di crescita che sono tuttavia sempre riferiti alla fase di accrescimento esponenziale. Conoscendo il numero iniziale e finale delle cellule e la durata della crescita esponenziale si può calcolare direttamente dalla rappresentazione grafica semilogaritmica il tempo medio di generazione della popolazione cellulare esaminata. In base alle relazioni lineari tipiche delle fasi esponenziali è possibile calcolare le pendenze delle rette tangenti in modo da definire un confronto delle velocità di crescita (slope) di popolazioni cellulari di specie diverse o il comportamento di una stessa popolazione clonale cresciuta in condizioni differenziate: ad esempio variando i paramentri di temperatura, umidità del suolo e salinità. La crescita di una popolazione batterica viene misurata seguendo nel tempo la variazione del numero di cellule mediante l applicazione di alcuni metodi di quantificazione come ad esempio la conta diretta microscopica con i fluorocromi e la conta vitale per diluizioni seriali e piastramento per le quali si rimanda alla consultazione di un testo di Microbiologia Generale e del materiale fornito durante le esercitazioni di laboratorio. Lo studio della fisiologia della crescita microbica include non solo la dinamica dell incremento delle cellule nel tempo ma comprende: 1) lo studio delle neosintesi macromolecolari relative ad esempio a sostanze di riserva cellulari o a produzioni esopolisaccaridiche; 2) lo studio della divisione cellulare e la formazione dei biofilm; 1

2 3) la risposta adattativa alla disponibilità di nutrienti. La crescita cellulare e i processi metabolici ad essa correlati non sempre si effettua in condizioni di disponibilità massime dei macroelementi e dei microelementi. 4) il cambiamenti nell espressione di geni e delle relative attività enzimatiche (ad esempio geni che codificano per la produzione di enzimi ligninolitici). Studi in coltura pura hanno dimostrato che la composizione macromolecolare di un di una cellula microbica dipende strettamente dalla velocita' con cui si riproduce e dalla natura delle condizioni di crescita ed in particolare dalle concentrazioni, limitanti o in eccesso, dei differenti nutrienti. Molti microrganismi possono esibire un'ampia varieta' di fenotipi morfologici in risposta alle diverse condizioni ambientali; in alcuni casi questo fenomeno si esprime in con manifestazioni diversificate ad esempio elongazione cellulare o sfericizzazioni alle morfologia coccica. Questo fatto ha portato ad una erronea identificazione di un gran numero di "specie" diverse. E chiaro inoltre che le condizioni ambientali influenzano l'espressione di componenti cellulari come gli enzimi e agiscono sui loro livelli e le loro attivita'. Dinamica della crescita batterica e fasi della crescita della popolazione cellulare L analisi della crescita dei microrganismi costituisce un tema rilevante dell ecologia microbica. Infatti la crescita cellulare microbica genera l aumento della biomassa microbica attiva determinando pertanto l incremento delle relative attività di svolgimento dei processi ambientali. Nella dinamica di accrescimento di una popolazione batterica si possono generalmente identificare diverse fasi di crescita riferite alle fasi di seguito riportate 1) Fase di latenza: nella fase iniziale del ciclo di crescita non si verifica nessun aumento apprezzabile della densità di popolazione cellulare quindi la velocità specifica di crescita è pari a zero. 2) Fase di accelerazionea: indica l inizio rilevabile della crescita e l aumento graduale della velocità specifica di crescita della popolazione. La fase di accelerazione termina allorquando la velocità di crescita raggiunge il valore caratteristico della fase esponenziale. 3) Fase di esponenziale: è la fase del ciclo di crescita in cui la crescita produce nell intervallo di tempo il raddoppio del numero di cellule. E la fase del ciclo di crescita che può essere descritta dalle equazioni basilari. In questa fase generalmente avviene la crescita bilanciata, dato che singolarmente i processi implicati nelle sintesi macromolecolari che portano alla sintesi della biomassa aumentano tutti alla stessa velocità 4) Fase di rallentamento: la velocità specifica di crescita della coltura comincia progressivamente a declinare a causa dell esaurimento delle risorse e dell accumulo di metaboliti inibenti la crescita (variazioni di ph ecc.) 5) Fase stazionaria: la velocità specifica di crescita è nulla e la crescita della coltura si arresta. Questa fase tuttavia costituisce una fase metabolicamente attiva in termini di processo fisiologico adattativo e in termini di neosintesi di metaboliti secondari in quanto le cellule pur arrestando il loro aumento numerico continuano ad esprimere il loro metabolismo endogeno e le varie attività vitali talvolta collegate a processi di neosintesi. 6) Fase di morte: la conta delle cellule vitali diminuisce, le cinetiche esatte di questa fase sono complesse e dipendono dal tipo di organismo dalla natura fisico-chimica dell ambiente, dalla storia fisiologica. 2

3 Si può affermare che la sintesi di macromolecole durante le fasi di crescita stady-state (stazionaria) costituisce uno dei temi ecologicamente rilevanti nello studio della fisiologia microbica adattativa. Specialmente quando si debbono studiare popolazioni miste naturali, è necessario, ricorrere a sistemi controllati di coltura in laboratorio che forniscano un ambiente ben definito, che possa riprodurre il più possibile l ambiente naturale simulando situazioni specifiche. Questo tipo di approccio non dipende necessariamente dalla conoscenza dei singoli organismi, ma può prendere in esame l intero sistema e i processi che in esso avvengono e le conseguenze dei cambiamenti ambientali sulla comunità nella sua unità e complessità. Per studiare la dinamica della crescita microbica sono necessari anche modelli matematici adatti a valutare e a prevedere lo sviluppo di una popolazione di microbica nella fase di crescita oggetto di studio: la fase esponenziale, le fasi di latenza e la fase stazionaria. Lo studio della dinamica della crescita batterica può essere effettuato direttamente nell ambiente naturale (ad esempio monitoraggio nel tempo degli effetti rizosfera o analisi nel tempo dell effetto lettiera) ma si avvale anche dell utilizzazione in laboratorio di sistemi di crescita che consentono la riproduzione esatta in condizioni controllate di una particolare fase di crescita. Sistemi di crescita Le tecniche per la coltivazione dei microrganismi possono essere sistemi chiusi o sistemi aperti all immissione di nutrienti o all eliminazione delle cellule. Chesbro (1988), riassumendo le moltissime informazioni sulle diverse tecniche colturali, identifica quattro classi ideali ciascuna delle quali può dare origine ad una particolare cinetica di crescita delle popolazioni. Sistema chiuso sia per quanto riguarda il substrato che la biomassa (Sistema Batch). Il sistema piu' semplice di crescita in ambiente chiuso e' quello costituito dalla crescita di un solo microrganismo in un ambiente completamente favorevole che fornisce tutte le risorse richieste per la crescita in quantita' illimitate e che mantiene costanti le condizioni fisico chimiche. Il microbo utilizza i nutrienti e produce, a seguito di una serie di complesse sequenze biosintetiche, nuovo materiale cellulare o biomassa. Di conseguenza l'organismo aumenta in grandezza e dopo un periodo di tempo durante il quale la biomassa si raddoppia, avviene la divisione cellulare e si costituisce una popolazione contenente due individui. Ciascun nuovo organismo ripete l'intero processo e dopo che una seconda generazione e' stata completata, la popolazione si raddoppia ancora per formare quattro individui.quindi negli organismi unicellulari, la crescita e' un processo che si manifesta con un aumento sia del numero che della biomassa. La velocità di incremento della biomassa e del numero di individui, aumenta con il tempo e la velocità di accelerazione dipende dalla composizione e dalla natura fisica del mezzo colturale, così come dipende dalla capacità intrinseca dei microrganismi di sintetizzare nuova biomassa ad una data velocità. Se le condizioni ambientali sono costanti, il tempo necessario per completare ciascuna generazione e raddoppiare le dimensioni della popolazione, è costante. Questo periodo caratteristico si chiama tempo di duplicazione della coltura (td) espresso in ore. Le dimensioni della popolazione, dopo un certo periodo di crescita, xt, dipende dalle dimensioni della popolazione iniziale, xo, e dal periodo di tempo, t, in cui la crescita avviene e puo' essere formulata matematicamente: 3

4 x t = x o 2 t/td (1) L'equazione (1) descrive una funzione esponenziale e caratterizza il comportamento di una popolazione microbica in un ambiente di crescita ideale. Generalmente però, è più conveniente derivare una forma lineare dalla equazione esponenziale di crescita, trasformando in logaritmi naturali, entrambi i lati dell'equazione (1) : lnx t = lnx o + ln2. t/t d (2) Questa equazione può essere rappresentata graficamente ponendo il logaritmo naturale di x contro il tempo. L'intercetta sull'ascissa rappresenta la dimensione della popolazione iniziale, mentre la pendenza della retta e' uguale a 0.693\t d e rappresenta la velocità di crescita specifica ( ). La velocità di crescita specifica è una misura della quantità di biomassa (o di individui) prodotta dall'unità di biomassa (o di singoli individui) presente, per unitàdi tempo. In un ambiente ottimale, con tutti i nutrienti richiesti in eccesso, la velocità di crescita della popolazione raggiungerà il suo massimo valore potenziale e diventerà la velocità massima di crescita, max. Le equazioni (1) e (2) descrivono l'equazione esponenziale della crescita e vengono chiamate equazioni basilari della crescita. E' evidente che la crescita esponenziale in un ambiente chiuso può durare solo un periodo di tempo limitato. La crescita in un ambiente chiuso è un processo autolimitante per molte ragioni e principalmente a causa dell'esaurimento di qualche nutriente essenziale per la crescita e dell'accumulo di prodotti metabolici che la inibiscono. Per questi motivi le semplici equazioni basilari della crescita da sole non danno un modello adeguato dell'intero processo in un ambiente chiuso. La crescita delle colture chiuse, naturali o di laboratorio, segue generalmente una sequenza caratteristica di eventi, che insieme vengono chiamati ciclo di crescita delle colture chiuse o batch. Una delle ipotesi su cui sono state formulate le equazioni basilari della crescita era che la crescita cominciasse immediatamente e quindi procedesse alla velocità massima prevista in quelle condizioni. Normalmente però nella fase iniziale del ciclo di crescita delle colture chiuse non si verifica nessun aumento determinabile della popolazione e quindi la velocità specifica di crescita è uguale a zero (fase di latenza). Molte sono le ragioni che possono essere proposte per spiegare la fase di latenza, tra cui la necessità di adattarsi alle nuove condizioni di crescita. Questo processo potrebbe implicare la sintesi di un enzima specifico necessario per catabolizzare la sorgente di carbonio e di energia fornita nel mezzo colturale, oppure l'esigenza di elaborare una via biosintetica completa per la sintesi di un metabolita. La fase di accelerazione indica l'inizio determinabile della crescita e l'aumento graduale della velocità di crescita specifica della popolazione. La fase di accelerazione finisce allorquando la velocità di crescita raggiunge il valore massimo caratteristico della fase esponenziale. La fase esponenziale è la sola parte del ciclo di crescita che può essere descritto dalle equazioni basilari e la crescita in questa fase è ritenuta essere per lo più bilanciata, dato che i processi singoli implicati nella produzione della biomassa aumentano tutti alla stessa velocità. La fase di rallentamento, avviene quando la velocità di crescita specifica della coltura comincia a declinare e continua fino a che la crescita non cessa. A differenza della fase esponenziale, la fase di rallentamento può essere abbastanza lunga, e, indubbiamente, rappresenta la parte maggiore del ciclo di crescita. Il progressivo declino della velocità di crescita specifica, in questo stadio, è dovuto al graduale aumento degli 4

5 effetti determinati dall'esaurimento delle risorse nutritive o all'accumulo di sostanze tossiche prodotte. Nella fase caratterizzata dal raggiungimento massimo della densità cellulare (talora riportata come fase stazionaria), la popolazione, anche se la crescita è cessata, rimane metabolicamente attiva, mantenendo la potenzialità di riprendere a crescere una volta che vengano ristabilite nuove condizioni. Durante questa fase, può essere mobilizzato il materiale di riserva, per poter mantenere il più a lungo possibile, la sopravvivenza, che chiaramente in queste condizioni è limitata, e infine si può verificare la morte della cellula e la lisi. Durante la fase di morte la conta delle cellule vitali diminuisce, anche se le cinetiche esatte di questa fase sono complesse e dipendono dal tipo di organismo, dalla sua precedente storia colturale e dalla natura dell'ambiente fisico. L equazione logistica è uno dei modelli più utili per descrivere la crescita di una popolazione in un ambiente chiuso e limitato, dall'inizio della fase esponenziale fino alla fase di massima popolazione. Per la maggior parte dei microrganismi, che crescono in una coltura chiusa, questa parte del ciclo di crescita ha una forma ad S e può essere espressa empiricamente da : dx/dt= max. x 1- x/x f (3) dove max e x sono gli stessi termini definiti precedentemente e x f rappresenta le dimensioni della popolazione raggiunte nella fase di massima popolazione. La caratteristica più significativa dell'equazione logistica è il termine [1-(x/x f )] che descrive la riduzione della velocità specifica di crescita quando la fase esponenziale passa alla fase di rallentamento. In molti ambienti chiusi,il declino della velocità di crescita specifica di una popolazione è correlata all'esaurimento di un particolare nutriente e questa relazione può essere utilizzata per sviluppare un semplice modello della crescita di una coltura chiusa. Monod fu il primo a intuire chiaramente che se vi era una diminuzione nella concentrazione di un substrato, doveva esserci anche una diminuzione della velocità di crescita specifica della popolazione. (Monod, 1942, 1949). Questo significa che la velocità di crescita è limitata dalla concentrazione del substrato che limita la crescita. Inoltre, Monod stabilì che il tipo di relazione era simile all'effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di una reazione enzimatica. Infatti questa relazione può essere descritta da una equazione analoga a quella della cinetica enzimatica di Michaelis-Menten, vale a dire: = max. s/ (K s + s) (5) dove s è la concentrazione del substrato limitante la crescita, è la velocità di crescita specifica e max è la velocita' di crescita specifica massima ottenuta in assenza di limitazione di substrato. Il termine K s (Fig 2) è una costante conosciuta come costante di saturazione che viene definita come quella concentrazione del substrato limitante che consente all'organismo di crescere ad una velocità pari a metà della massima velocità di crescita specifica. La costante di saturazione è il terzo parametro basilare della crescita ed ha le stesse unità della concentrazione del substrato. Essa rappresenta una misura dell'affinità che l'organismo ha per il substrato limitante la crescita; questo significa che più basso è il valore di K s, più alta sarà l'affinita' dell'organismo per il substrato e maggiore la capacità di crescere in ambienti con basse concentrazioni del substrato che limita la crescita. 5

6 La costante di saturazione non ha molto significato nella cinetica della crescita della maggior parte delle colture chiuse, e in particolar modo di quelle di laboratorio, poiché per la maggior parte del periodo di crescita, tutti i substrati sono in eccesso e il solo parametro dominante è la velocità massima di crescita specifica. max =0.5 = max. s / (Ks + s) Velocità di crescita specifica =0.25 Ks Concentrazione di substrato (g L -1 ) Figura 2: Rappresentazione grafica della costante di saturazione e della sua relazione con la velocità di crescita specifica Sistema aperto sia per quanto riguarda il substrato che la biomassa: il chemostato come coltura continua L uso delle colture continue nella fisiologia e nell ecologia microbica ha permesso la comprensione dei meccanismi adottati dai microrganismi in risposta ai cambiamenti delle disponibilità nutrizionali e dei fattori abiotici quali il ph, la concentrazione di ossigeno e l eventuale presenza di sostanze tossiche (Pirt, 1975). In questi sistemi sperimentali controllati è possibile variare l'apporto nutritivo da concentrazioni minime ai limiti dell'oligotrofia a concentrazioni più elevate che possono consentire una attiva crescita dei microrganismi. Con le colture continue si possono creare situazioni diverse sia nutrizionali che ambientali, variare le velocità di crescita delle popolazioni e ottenere sperimentalmente quelle condizioni di crescita minima tipiche degli ambienti oligotrofici. Nei sistemi di crescita aperti vi è una continua entrata di substrati colturali ed un continuo allontanamento di prodotti di rifiuto, di cellule e di substrati non utilizzati.questi sistemi vengono chiamati colture continue (Pirt, 1975). Nelle colture continue la fase esponenziale può essere prolungata all'infinito in modo da stabilire condizioni di equilibrio (steady state). Le colture in steady state, a differenza delle colture in batch, in cui il comportamento delle cellule in un dato momento è influenzato dalla storia precedente della coltura,eliminano l'influenza delle condizioni transitorie. Nella crescita aperta vi sono altri vantaggi importanti: la velocità specifica di crescita può essere controllata direttamente da fattori esterni, si può fare in modo che la crescita limitata dal substrato continui nel tempo, si possono imporre velocità di crescita sub-massimali,e la 6

7 concentrazione di biomassa può essere tenuta indipendente dalla velocità di crescita (Pirt,1975). Il sistema di colture continue più usato è il chemostato (Fi g 3) in cui il controllo della crescita viene ottenuto attraverso un substrato che limita la crescita. Figura 3: Il chemostato un sistema di crescita continuo (al centro la vaschetta di crescita) Un chemostato è costituito da una vaschetta contenente un volume fissato di coltura in crescita (unità=volume). Sia nei sistemi aerobici che in quelli anaerobici,l'agitazione mantiene una coltura omogenea e,nel caso delle colture aerobiche, assicura un trasferimento di ossigeno appropriato. Un mezzo colturale noto, contenente uno dei substrati, S R, in concentrazioni tali da limitare la crescita, viene pompato nella vaschetta di crescita ad una velocità costante F (che rappresenta il volume immesso nella vaschetta tempo -1 ). La coltura, i substrati non utilizzati e i prodotti vengono allontanati mediante un sifone di livello oppure un altro sistema pompante, alla stessa esatta velocità del flusso F. Si presume che il mezzo colturale fresco che entra in una coltura adeguatamente agitata si mescoli istantaneamete alla coltura preesistente. Dentro la vaschetta la coltura cresce fino a raggiungere una certa concentrazione di biomassa, x, (questo valore esprime anche la concentrazione della biomassa nella coltura in uscita dalla vaschetta) e abbassa la concentrazione iniziale del substrato che limita la crescita,s R, a un valore di s. E' stato già mostrato che la velocità di crescita specifica di un organismo dipende dalla concentrazione del substrato limitante.e' chiaro che in un chemostato la concentrazione del substrato limitante dipende sia dalla velocità con cui viene immesso nella vaschetta, sia dal fattore di diluizione, dato che questo nuovo substrato viene sparso nella coltura. Questo significa che la concentrazione del substrato che limita la crescita dipende dalla velocità del flusso, F, e dal volume della coltura, V, e sopratutto dal rapporto di questi due parametri, rapporto noto come velocita' di diluizione,( D). 7

8 D= F/V La velocità di diluizione ha unità espresse con il reciproco del tempo (normalmente espresso come h -1 ) e rappresenta la misura del numero (o delle frazioni) dei cambi di volume della coltura che vengono compiuti nell'unità di tempo. Quindi una velocità di diluizione di 1.0 h -1 significa che vi è stato un cambio di volume completo in un'ora. E' importante comprendere, inoltre che la velocità di diluizione ha le stesse unità della velocità di crescita specifica e che in condizioni appropriate i loro valori sono uguali. Il reciproco del tempo di diluizione e' il tempo medio di residenza, parametro che rappresenta il tempo medio di permanenza di un organismo dentro la vaschetta di crescita. Nella vaschetta la crescita procede e la concentrazione di biomassa tende ad aumentare, ma nello stesso tempo viene perduta la biomassa che esce dalla vaschetta. Quindi si viene a stabilire uno stato di equilibrio della biomassa che può essere espresso come: Velocità di cambiamento della concentrazione di biomassa nella vaschetta = Velocità di produzione della biomassa (crescita) dx/dt = x - Dx - Velocità di perdita della biomassa (scarico) oppure: dx/dt = x ( - D) (7) Sostituendo con l'equazione (5), abbiamo: dx/dt = x max. s/ (k s + s) D (8) Esaminando l'equazione (7) e' necessario considerare le tre differenti situazioni che si possono verificare. 1- Se >D, dx/dt è positivo e la concentrazione della biomassa nella vaschetta di crescita aumenta perchè la velocità di produzione della biomassa eccede la velocità di perdita della biomassa attraverso lo scarico. 2- Se <D, dx/dt è negativo e la concentrazione della biomassa diminuisce perchè la velocità di scarico della coltura è maggiore della sintesi della biomassa. 3- Se = D, dx/dt =0 e la concentrazione della biomassa rimane costante e la coltura è in equilibrio (la coltura viene detta essere allo steady state). La terza situazione è chiaramente la migliore, dato che ogni chemostato, se vengono usati sempre gli stessi metodi, raggiungerà,dopo un certo tempo, uno stato di equilibrio, ammesso che la velocità di diluizione sia minore della velocità di crescita massima. Sulla base di tali premesse, è possibile formulare una equazione per i substrati simile a quella espressa per la crescita: Velocità di cambiamento della concentrazione del substrato limitante nella vaschetta = Velocità di aggiunta del substrato fresco _ Velocità di perdita del substrato (scarico) _ Velocità di utilizzazione del substrato da parte degli organismi (crescita) 8

9 Ds/dt = D S R _ D s _ x/y oppure ds/dt = D ( S R - s) - x/ Y (9) Anche in questo caso è necessario esaminare le tre situazioni che si possono verificare. 1- Se e' > D, ds/dt è negativo e la concentrazione del substrato limitante diminuisce. In queste condizioni la biomassa aumenta e quindi utilizza più substrato disponibile. 2- Se e' < D, ds/dt è positivo e la concentrazione del substrato limitante aumenta. 3- Infine se =D, ds/dt=0 e la concentrazione del substrato limitante raggiunge un valore costante nello stesso tempo in cui la concentrazione della biomassa raggiunge lo steady state. Una delle caratteristiche più importante del chemostato è che si possono ottenere sempre condizioni di crescita allo steady state, che è un sistema auto-regolante in cui vengono mantenuti valori costanti di biomassa e di concentrazioni di substrato per tutto il tempo in cui la velocità di diluizione viene tenuta costante. Nella coltura allo steady state, =D e i valori di dx/dt e ds/dt sono dati dalle equazioni (8) e (9).Quindi dalla equazione (8): 0 = x [ max. š/ (Ks + š) - D] (10) dove š e x indicano rispettivamente la concentrazione del substrato limitante e la concentrazione della biomassa. Ne segue: e dall'equazione (9): š = D K s / (µ max - D) (11) 0= D (S R š) - µ x / Y š = Y ( S R š ) (12) Le equazioni (11) e (12) ci permettono di prevedere, per ogni velocita' di diluizione, le concentrazioni allo steady state, purchè si conoscano la concentrazione del substrato limitante iniziale, e i tre parametri fondamentali della crescita, cioè µ max, K s, e Y. L'equazione (11) dimostra che,in un dato organismo,con µ max e K s costanti,la concentrazione del substrato che limita la crescita dipende solo dalla velocità di diluizione che è stata scelta ed è indipendente dalla concentrazione iniziale del substrato limitante (S R ). Infatti, è il valore della concentrazione residua del substrato limitante, s, che determina la velocita' di crescita dell'organismo. L'equazione (12) indica che la concentrazione della biomassa allo steady state dipende non solo dal valore di s (e dai parametri ad esso associati) ma anche dalla resa e dalla concentrazione iniziale del substrato che limita la crescita. Le equazioni (11) e (12) descrivono la situazione che esiste una volta che è stato raggiunto lo steady state. Tuttavia, una delle caratteristiche più importanti del chemostato è che, qualunque siano le concentrazioni iniziali della biomassa e del substrato, il sistema si autoregola e raggiunge le concentrazioni proprie di quello steady state, ammesso che la velocità di diluizione sia tenuta costante 9

10 Dall'equazione (7) si può dedurre che vi è un limite al di sopra del quale non può essere raggiunta una condizione di steady state. Questo avviene perchè la velocità di crescita specifica di un organismo ha un valore massimo, µ max, che è determinato geneticamente e che, perciò, non può essere oltrepassato. Quindi se D > µ max, dx/dt deve diventare negativo,e non è possibile ottenere una coltura allo steady state e di conseguenza la coltura viene "lavata" via dalla vaschetta (washout). Esiste una sola velocità di diluizione, la velocità di diluizione critica, ( Dcrit), al di sotto della quale colture allo steady state sono teoricamente possibili e al di sopra delle quali avviene il washout. Bibliografia Chesbro, W. (1988). The domains of slow bacterial growth. Can. J. Microbiol., 34: Monod, J. (1949). The growth of bacterial cultures. Annu. Rev. Microbiol., 3: Pirt, S.J. (1975). Principles of microbe and cell cultivation. Oxford: Blackwell Scientific. Roszak, D.B. Colwell. R.R. (1987). Survival strategies of bacteria in the natural enviroment. Microbiol Rev, 51: