Effetto dell acido formico sulla crescita e l acidificazione di S. thermophilus e L. delbrueckii subsp. bulgaricus

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1 UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI MILANO Facoltà di Scienze Agrarie e Alimentari Corso di Laurea Magistrale in Scienze e Tecnologie Alimentari Effetto dell acido formico sulla crescita e l acidificazione di S. thermophilus e L. delbrueckii subsp. bulgaricus Relatore: Prof. Diego Mora Correlatore: Dott.sa Stefania Arioli A.A. 2014/2015 Tesi di laurea di: Giulia Della Scala Matricola n

2 La proto-cooperazione tra S. thermophilus e L. delbrueckii subsp. bulgaricus S. thermophilus CO₂ formiato folato LCFA amminoacidi peptidi putrescina ornitina L. delbrueckii 2

3 L acido formico Presente nelle fermentazioni dei prodotti lattiero casearie in conseguenza di due eventi: - Prodotto delle reazioni di Maillard - Prodotto del metabolismo di S. thermophilus CoA Pfl piruvato acetilcoa acido formico 3

4 Studio dell effetto dell acido formico sulla crescita e capacità di acidificazione di S. thermophilus e L. delbrueckii subsp. bulgaricus in latte - Colture miste e singole liofilizzate congelate - Latte fresco pastorizzato di alta qualità - Fermentazione a 42 C fino a ph 4,6 10 mg/l formiato di sodio 20 mg/l formiato di sodio Monitoraggio ph Conta vitale Quantificazione dell acido formico 4

5 Coltura mista ST671 + LB08 7 Acidificazione (ph) 6,5 6 5, mg/l 20 mg/l 4,

6 Coltura singola ST671 7 Acidificazione (ph) 6,5 6 5, mg/l 20 mg/l 4,

7 Coltura singola ST115 6,5 Acidificazione (ph) 6 5,5 5 4,5 10 mg/l 20 mg/l

8 Coltura singola LB08 7 Acidificazione (ph) 6,5 6 5,5 L acido formico stimola l acidificazione in latte 5 4,5 10 mg/l L effetto di stimolazione è ceppo-specifico 20 mg/l

9 Studio dell effetto dell acido formico sui parametri cinetici di crescita di S. thermophilus e L. delbrueckii subsp. bulgaricus in terreno sintetico chimicamente definito (CDM) - 30 ceppi di S. thermophilus - 5 ceppi di L. delbrueckii subsp. bulgaricus - CDM 10 mg/l formiato di sodio 20 mg/l formiato di sodio - Analisi spettrofotometrica Velocità massima di crescita Durata della fase di latenza Concentrazione cellulare finale 9

10 S. thermophilus l effetto dell ACIDO FORMICO sui parametri di crescita è CEPPO-SPECIFICO 40% NESSUN effetto stimolante su nessuno dei parametri di crescita Concentrazione cellulare (OD 600) 2 1,6 10 mg/l 20 mg/l 1,2 0,8 0,4 0 04:48:00 06:00:00 07:12:00 08:24:00 09:36:00 10:48:00 12:00:00 10

11 S. thermophilus l effetto dell ACIDO FORMICO sui parametri di crescita è CEPPO-SPECIFICO 27% DIMINUZIONE la durata della fase di latenza e DIMINUZIONE la velocità massima di crescita, con raggiungimento della STESSA concentrazione cellulare finale Concentrazione cellulare (OD 600) 1,6 1,4 10 mg/l 1,2 20 mg/l 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 04:48:00 07:12:00 09:36:00 12:00:00 14:24:00 11

12 S. thermophilus l effetto dell ACIDO FORMICO sui parametri di crescita è CEPPO-SPECIFICO 13% AUMENTO della concentrazione cellulare finale Concentrazione cellulare (OD 600) 1,4 1, mg/l 0,8 20 mg/l 0,6 0,4 0,2 0 06:00:00 07:12:00 08:24:00 09:36:00 10:48:00 12:00:00 13:12:00 12

13 S. thermophilus l effetto dell ACIDO FORMICO sui parametri di crescita è CEPPO-SPECIFICO 13% DIMINUZIONE della concentrazione cellulare finale Concentrazione cellulare (OD 600) 1,4 1,2 10 mg/l 1 20 mg/l 0,8 0,6 0,4 0,2 0 03:36:00 04:48:00 06:00:00 07:12:00 08:24:00 09:36:00 13

14 NESSUN effetto stimolante su nessuno dei parametri di crescita S. thermophilus l effetto dell ACIDO FORMICO sui parametri di crescita è CEPPO-SPECIFICO 40% 27% 13% 13% 7% DIMINUZIONE la durata della fase di latenza e DIMINUZIONE la velocità massima di crescita, con raggiungimento della STESSA concentrazione cellulare finale AUMENTO della concentrazione cellulare finale DIMINUZIONE della concentrazione cellulare finale Altro 14

15 2/5 NESSUN effetto stimolante su nessuno dei parametri di crescita L. delbrueckii subsp. bulgaricus l effetto dell ACIDO FORMICO sui parametri di crescita è CEPPO-SPECIFICO 2/5 AUMENTO della 1/5 durata della fase di AUMENTO della latenza velocità massima di crescita e AUMENTO della concentrazione cellulare finale 15

16 Indagine della correlazione tra metabolismo dell acido formico e via biosintetica di produzione ex novo delle basi azotate adenina e guanina ceppi di S. thermophilus - CDM - ADENINA E GUANINA 20 mg/l formiato di sodio 50 mg/l formiato di sodio - Analisi spettrofotometrica Velocità massima di crescita Durata della fase di latenza Concentrazione cellulare raggiunta 16

17 S. thermophilus l effetto della presenza di ADENINA e GUANINA sui parametri di crescita è CEPPO-SPECIFICO In ASSENZA delle basi DIMINUZIONE della durata della fase di latenza ma MINORE concentrazione cellulare finale Concentrazione cellulare (OD 600) 1,6 1,4 CDM -AG 1,2 CDM 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 00:00:00 02:24:00 04:48:00 07:12:00 09:36:00 12:00:00 14:24:00 17

18 S. thermophilus l effetto della presenza di ADENINA e GUANINA sui parametri di crescita è CEPPO-SPECIFICO In ASSENZA delle basi DIMINUZIONE della durata della fase di latenza senza effetti sulla concentrazione cellulare finale Concentrazione cellulare (OD 600) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 CDM -AG 0,4 0,2 CDM 0 00:00:00 02:24:00 04:48:00 07:12:00 09:36:00 12:00:00 14:24:00 18

19 S. thermophilus l effetto della presenza di ADENINA e GUANINA sui parametri di crescita è CEPPO-SPECIFICO In ASSENZA delle basi AUMENTO della durata della fase di latenza senza effetti sulla concentrazione cellulare finale Concentrazione cellulare (OD 600) 1,8 1,6 1,4 1,2 CDM -AG 1 CDM 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0:00:00 7:12:00 14:24:00 21:36:00 28:48:00 36:00:00 19

20 Indagine della correlazione tra metabolismo dell acido formico e via biosintetica di produzione ex novo delle basi azotate adenina e guanina. - S. thermophilus ST671 e ST115 - CDM - ADENINA E GUANINA 20 mg/l formiato di sodio 50 mg/l formiato di sodio - Analisi citofluorimetrica Conta totale (SYBR-Green I) Potenziale di membrana (DiOC 6 ) Sintesi della parete cellulare (BODIPY FL vancomycin) 20

21 S. thermophilus ST115 CONTA TOTALE Concentrazione cellulare (eventi/ml) 1,4E+08 1,2E+08 1,0E+08 8,1E+07 6,1E+07 4,1E+07 2,1E+07 1,0E mg/l 50 mg/l

22 S. thermophilus ST115 POTENZIALE DI MEMBRANA Concentrazione cellulare (eventi/ml) 1,4E+08 1,2E+08 1,0E+08 8,1E+07 6,1E+07 4,1E+07 2,1E+07 1,0E mg/l 50 mg/l Fluorescenza - A (DiOC 6 ) mg/l 50 mg/l

23 S. thermophilus ST115 SINTESI DELLA PARETE CELLULARE Fluorescenza - A (BODIPY) mg/l 50 mg/l

24 In conclusione Effetto dell acido formico sui parametri cinetici di crescita in CDM: ceppo-dipendente Effetto dell acido formico sui parametri cinetici di crescita in CDM privo di adenina e guanina: ceppo-dipendente Effetto dell acido formico sulle funzioni cellulari in CDM privo di adenina e guanina: ceppo-dipendente Effetto dell acido formico sulla crescita e acidificazione in latte: ceppo-dipendente e dipendente dall associazione microbica 24

25 purine biosynthesis exogenous formate glucose NAD + GLYCOLYSIS NADH+ H + tetrahydrofolate Fhs HO O C H 2 ATP ATP formate Pfl BCAA Fatty acids AcetylCoA pyruvate ThPP pathway acetate Ldh NADH+ H + NAD + lactic acid 25

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27 Grazie per l attenzione 27