conservazione sulla risposta di sistemi biologici a raggi γ Viviana De Nadal INFN-Laboratori Nazionali di Legnaro, Legnaro-Padova

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1 XIV CONVEGNO NAZIONALE DELLA SOCIETÀ ITALIANA PER LE RICERCHE SULLE RADIAZIONI (S.I.R.R.) Trieste, Giugno 2008 Effetto della crio-conservazione conservazione sulla risposta di sistemi biologici a raggi γ Viviana De Nadal INFN-Laboratori Nazionali di Legnaro, Legnaro-Padova Per la collaborazione CRIORAD 26 Giugno 2008

2 CRIORAD (CRyo-preserved cells and nizing RAdiation Damage) IOnizing Trieste, Giugno

3 INFN-Cagliari Cagliari: A. Brunetti M. Carpinelli N. Diaz P.L. Fiori B. Golosio G.L. Masala P. Oliva P. Randaccio S. Santona Partecipanti collaborazione CRIORAD INFN-LNF: R. Bedogni A. Esposito Istituto di Istologia ed analisi di Laboratorio, Università di Urbino: G. Cugia INFN-LNGS: L. Zamai M. Balata S. Nisi M. Laubenstein : R. Cherubini S. Gerardi INFN-Pisa Pisa: U. Bottigli Laboratorio di Patologia Clinica AO San Salvatore di Pesaro, Pesaro: F. Centis M. Valentini S. Stramigioli W. Cesarini Trieste, Giugno

4 Sia nell ambito della ricerca che nella pratica clinica, i sistemi biologici vengono mantenuti per lunghi periodi di tempo in condizioni di crioconservazione con rallentamento o arresto delle attività metaboliche cellulari Sistemi biologici crioconservati per molto tempo sono esposti a dosi protratte della radiazione del fondo ambientale (in particolare raggi γ) I sistemi biologici crioconservati non possono riparare i danni prodotti dalla radiazione di fondo se non dopo lo scongelamento con possibile accumulo di danno Trieste, Giugno

5 SCOPO DEL LAVORO Effetto della crio-conservazione sulla risposta di sistemi biologici a raggi γ Valutazione della risposta, in termini di vari end-points biologici, di sistemi biologici diversi mantenuti in condizioni di crio-conservazione conservazione e in condizioni ambientali normali, a seguito di esposizione a raggi γ in funzione della dose e del rateo di dose, "mimando" l'esposizione al fondo naturale per un intervallo temporale di anni o decine di anni. Trieste, Giugno

6 SISTEMI BIOLOGICI Coltura batterica di E.coli (Cagliari) Cellule mononucleari di sangue periferico umano (LNGS) Cellule V79 di Hamster cinese (LNL) Trieste, Giugno

7 Coltura Batterica: E.coli End-points biologici: induzione di mutanti I batteri mutanti sono stati isolati in terreno selettivo contenente D-Cicloserina. I batteri vitali sono stati quantificati con il conteggio delle CFU Trieste, Giugno

8 Coltura Batterica: E.coli I campioni di batteri congelati e non-congelati sono stati irraggiati con una sorgente gamma (di 137 Cs) a 67 Gy in dose frazionata (2 minuti di irraggiamento e 1 di riposo) Rateo di dose: 2.2 Gy/min Trieste, Giugno

9 Peripheral blood mononuclear cells PBMC End-points biologici: processo apoptotico Il processo apoptotico è stato valutato con citofluorimetria, subito dopo scongelamento e a 24, 48 e 72 ore con o senza stimolazione del mitogeno fitoemoagglutinina (PHA) Trieste, Giugno

10 Peripheral blood mononuclear cells PBMC I linfociti sia congelati che non congelati sono stati irradiati con raggi γ ( 137 Cs) a dosi di 0.3 e 3.0 Gy in dose unica (acuta) e a 0.9 Gy sia in dose unica che frazionata (3 dosi intervallate da 3 ore) Rateo di dose: 3.1 Gy/min Trieste, Giugno

11 Cellule V79 End-points biologici: Sopravvivenza cellulare La sopravvivenza cellulare è stata determinata sulla capacità delle cellule di formare colonie di almeno 50 unità Induzione di mutazioni al locus Hprt Le cellule mutanti al locus Hprt sono state isolate in terreno selettivo contenente 6-tioguanina Trieste, Giugno

12 Cellule V79 Le cellule V79 ciclanti e congelate sono state irradiate alle dosi di 0.5, 1 e 3 Gy di raggi γ con una sorgente di 60 Co del CNR-FRAE/INFN FRAE/ ad un rateo di dose di 1 Gy/min e con una sorgente di 137 Cs al Dip.. di Oncologia (Università di Padova) ad un rateo di dose di 3 Gy/min Trieste, Giugno

13 RISULTATI Trieste, Giugno

14 Coltura Batterica: E.coli Numero di mutanti per 10 5 cellule di E. coli Exp.1 Exp.2 Exp.3 Exp.4 Non-congelati 43 +/ / / /- 31 Congelati 15 +/ / / /- 10 Trieste, Giugno

15 Peripheral blood mononuclear cells Percentuale di morte cellulare specifica di PBMC congelati dopo irraggiamento con singola dose di 0.3 e 3 Gy di raggi γ senza e con stimolazione mitogenica (PHA) Cell death of frozen lymphocytes Cell death of frozen lymphocytes Percentage of specific cell death h -PHA 48h -PHA 72h -PHA Time of incubation 0,3 Gy frozen lymphocytes 3,0 Gy frozen lymphocytes Senza PHA Percentage of specific cell death h +PHA 48h +PHA 72h +PHA Time of incubation 0,3 Gy frozen lymphocytes 3,0 Gy frozen lymphocytes Con PHA Trieste, Giugno

16 Confronto della percentuale di morte cellulare specifica tra PBMC non-congelati e congelati dopo irraggiamento con singola dose di 0.9 Gy o con dose frazionata di 3x0.3 Gy 100 0,9 Gy dose radiation 100 0,9 Gy dose radiation Percentage of specific cell death h -PHA 48h -PHA 72h -PHA Time of incubation fractionated dose fresh Lymphocytes fractionated dose frozen lymphocytes Percentage of specific cell death h -PHA 48h -PHA 72h -PHA Time of incubation single dose fresh lymphocytes singole dose frozen lymphocytes Senza PHA Trieste, Giugno

17 Con PHA 0,9 Gy radiation 0,9 Gy radiation percentage of specific cell death h +PHA 48h +PHA 72h +PHA fractionated dose fresh lymphocytes fractionated dose frozen lymphocytes Percentage of specific cell death h +PHA 48h +PHA 72h +PHA Single dose fresh lymphocytes single dose frozen lymphocytes Time of incubation Time of incubation I PBMC irraggiati in crioconservazione presentano una morte cellulare specifica minore rispetto ai PBMC irraggiati non-congelati indipendentemente dal frazionamento della dose e dalla stimolazione mitogenica Trieste, Giugno

18 Cellule V79 Curve di sopravvivenza cellulare di cellule V79 non-congelate e congelate media - cell proliferanti media - cell congelate 1 1 SF Model: lin Chi^2 = R^2 = SF Model: lin Chi^2 = R^2 = alfa ± alfa ± ,1 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 dose (Gy) 0,1 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 dose (Gy) Media 3-4 exp. Trieste, Giugno

19 Induzione di mutazioni al locus Hprt in cellule V79 non-congelate e congelate 5 4 media - cell proliferanti 5 4 media - cell congelate MF (x 10-5 ) MF (x 10-5 ) ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 dose (Gy) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 dose (Gy) Media 3 exp. Trieste, Giugno

20 CONCLUSIONI I risultati ottenuti dalle tre linee di ricerca: sono coerenti tra loro sembrano suggerire un effetto protettivo della crioconservazione contro i danni indotti da radiazione Date le differenze tra le 3 linee di ricerca (sistemi biologici, end-points valutati e facilities di irraggiamento γ), l effetto protettivo non può essere attribuito al metodo sperimentale. Trieste, Giugno

21 Trieste, Giugno

22 Referenze bibliografiche: GERMAN E.: 'Cool' crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage. Curr Opin Struct Biol Oct;13(5): Review. TAUXE R.V.; TAUXE R.V.; Food safety and irradiation: protecting the public from foodborne infections. Emerg Infect Dis. 2001;7(3 Suppl): Trieste, Giugno

23 Software per il conteggio automatico delle colonie cellulari

24 Il prototipo del sistema di conta automatico, realizzato, è basato principalmente su algoritmi di region-growing per l estrazione delle regioni d interesse dell immagine (ROI), di una rete neurale di Sanger per la caratterizzazione di tali regioni e da un classificatore. La classificazione finale migliore è fornita da una rete neurale feedforward (FF-NN) con un errore sulla conta del 2% su un campione di 150 piastre Petri. Trieste, Giugno