Staminali: nuove prospettive per la medicina rigenerativa

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1 Staminali: nuove prospettive per la medicina rigenerativa La medicina rigenerativa rappresenta un nuovo approccio terapeutico per la cura di molte patologie e ha come obiettivo la rigenerazione biologica da parte del corpo del paziente del tessuto/organo deteriorato anziché la sua sostituzione. Con la ricerca sulle cellule staminali la medicina rigenerativa sta facendo grandi passi in avanti ed è quasi sempre abbinata a studi biochimici e, dove è possibile, a banche di tessuti ingegnerizzati. Oggi la ricerca si concentra sul ruolo delle cellule staminali nella rigenerazione di diversi tessuti, anche scheletrici (cartilagine ed osso) danneggiati non solo da traumi ma da malformazioni congenite, patologie degenerative (tra cui immunodeficienze congenite, talassemie, emofilie, tumori del sangue, distrofie muscolari) e neoplasie e sembra essere una terapia medica di potenziale illimitato, che massimizza l'innata capacità rigenerativa del corpo umano. Un gruppo multidisciplinare dell'università di Padova, coordinato da Paolo De Coppi, Michela Pozzobon, Libero Vitiello e Nicola Elvassore - finanziato dalla Fondazione città della speranza e da Telethon - ha messo a punto una nuova strategia per ricostruire il muscolo scheletrico, sfruttando le potenzialità delle cellule staminali. La speciale "miscela" con "cellulemedicina rigenerativa bambine" e un biomateriale è descritta sul "Faseb Journal". Grazie alla commistione di competenze diverse non solo biologia, ma anche ingegneria e chirurgia i ricercatori padovani sono riusciti per la prima volta a indurre la rigenerazione di tessuto muscolare scheletrico nel modello animale, grazie a una miscela di cellule staminali e di un particolare biomateriale. La particolarità della tecnica, spiegano in una nota, sta proprio nel fatto che, per aiutare le cellule staminali a promuovere la riparazione del danno muscolare, queste sono state somministrate disciolte in un liquido a base di acido ialuronico, chiamato hydrogel. Componente normale delle cartilagini, l'acido ialuronico è una sostanza già utilizzata in ambito medico ed è quindi sicura dal punto di vista di possibili reazioni avverse. Illuminato da luce ultravioletta, l'hydrogel diventa un gel semisolido e costituisce quindi un supporto efficiente per le cellule staminali, che hanno così il tempo e l'ambiente adatto per proliferare ed esercitare il proprio ruolo rigenerativo. I ricercatori hanno infatti osservato che i muscoli dell'animale recuperavano non solo la loro massa iniziale e la capacità di contrarsi, ma anche la corretta presenza di nervi e vasi sanguigni. Questi risultati sono quindi "un'incoraggiante premessa allo sviluppo di un nuovo approccio di medicina rigenerativa, applicabile concludono gli autori in numerose patologie che portano alla perdita più o meno estesa di massa muscolare, sia nei bambini che negli adulti". La medicina rigenerativa è quella medicina che ha come scopo quello di riparare organi o tessuti danneggiati da malattie, traumi o dal semplice invecchiamento. L obiettivo è quello di ripristinare la funzionalità di questi organi, o almeno di migliorarla. In questo senso, però, tutta la medicina (ad eccezione di quella preventiva) può essere definita rigenerativa, e dunque oggi si pone l esigenza di una definizione più puntuale e precisa.

2 Medicina rigenerativa identifica dunque l insieme delle ricerche e delle terapie che, nel perseguire l obiettivo della rigenerazione, utilizzano le cellule staminali. Le cellule staminali sono cellule primitive non specializzate, dotate della capacità di trasformarsi in diversi altri tipi di cellule del corpo attraverso un processo denominato differenziamento cellulare Caratteristiche distintive Per poter essere definita come staminale una cellula deve soddisfare due proprietà: l'autorinnovamento e la potenza. L'autorinnovamento: Identificato per la prima volta nel 1963 negli studi sul midollo osseo di Becker A.J. e di Siminovitch L., è la capacità di tali cellule di compiere un numero illimitato di cicli replicativi mantenendo il medesimo stadio differenziativo. Ciascuna cellula staminale realizza l'autorinnovamento o tramite la divisione asimmetrica obbligata, dove la staminale dà origine ad un'altra staminale e ad una cellula destinata a differenziarsi oppure mediante differenziamento stocastico, dove una popolazione di cellule staminali si conserva poiché esiste un numero pressoché uguale di staminali che generano due staminali replicandosi e staminali che generano due cellule destinate a differenziarsi. La potenza è la capacità di dare origine a una o più linee o tipi cellulari tramite il differenziamento. All'interno di questo concetto potrebbe essere anche compreso quello di transdifferenziamento, cioè la capacità di una cellula staminale in fase di differenziamento di cambiare la propria linea cellulare modificando il suo programma di sviluppo. Classificazione Le cellule staminali vengono classificate in base alla loro potenza, la potenzialità di differenziarsi nei vari tipi o linee cellulari. Totipotenza La totipotenza è la capacità di una singola cellula di dividersi e produrre tutte le cellule differenziate in un organismo, compresi i tessuti extraembrionali [5]. Le cellule staminali totipotenti sono le spore (nei funghi) e gli zigoti. In alcuni organismi, le cellule già differenziate possono ritrovare la totipotenza. Ad esempio nelle coltivazioni in vitro di tessuti vegetali. Nei mammiferi è conosciuta una singola cellula totipotente, denominata zigote; già fra la terza e la quarta divisione cellulare, le cellule iniziano a perdere la loro totipotenza. A questo punto avviene la formazione della morula, così chiamata perché l uovo fecondato assume la forma di una piccola mora, composta all incirca da sedici cellule. Pluripotenza La pluripotenza è la capacità di una singola cellula di dividersi e di differenziarsi in uno qualsiasi dei tre strati germinali: endoderma (rivestimento interno dello stomaco, del tratto gastrointestinale, i polmoni), mesoderma (muscoli, ossa, sangue, urogenitale), o ectoderma (tessuti epidermici e del sistema nervoso).

3 Tali cellule non possono per tanto dare origine ad un organismo adulto, perché non hanno il potenziale per contribuire ai tessuti extraembrionali, per esempio nel caso dei mammiferi placentati non possono dare origine alla placenta (tessuto extraembrionale). Multipotenza Le cellule progenitrici o multipotenti hanno il potenziale di differenziarsi in un numero limitato di lignaggi cellulari. Un esempio di una cellula staminale multipotente è una cellula ematopoietica (una cellula staminale del sangue) la quale può svilupparsi in diversi tipi di cellule del sangue, ma non può svilupparsi in cellule cerebrali o altri tipi di cellule al di fuori dei tipi di cellule appartenenti al tessuto del sangue. Sono cellule considerate essere permanentemente impegnate ad una funzione tissutale specifica. Oligopotenza Le cellule definite oligopotenti hanno la capacità di differenziarsi solo in alcuni tipi di cellule. Quali ad esempio di dare origine alla linea linfoide o mieloide [13]. Altri esempi di cellule progenitrici oligopotenti sono le cellule staminali vascolari che hanno la capacità di diventare o cellule muscolari lisce oppure endoteliali. Unipotenza Le cellule definite unipotenti o precursori hanno la capacità di differenziarsi in un singolo tipo di cellula. Ad esempio gli epatociti, che costituiscono la maggior parte del fegato, sono unipotenti. La capacità del fegato di rigenerarsi da un minimo del 25% della sua massa originaria è attribuita a questa proprietà [14], altri esempi sono dati dalle cellule staminali unipotenti cubiche o cilindriche presenti a livello dello strato germinativo dell'epidermide. Ciclo cellulare La cellula staminale possiede le proprietà di poter entrare ed uscire dalla fase G0 del ciclo cellulare, tale proprietà assicura alle cellule di poter permanere in uno stato di quiescenza a tempo indeterminato e di mantenere il proprio stato indifferenziato. A seconda dei segnali ambientali che la cellula riceve essa potrà andare incontro ad una replicazione simmetrica, tipica dello stadio di sviluppo embrionale che aumenta il numero delle cellule staminali, o potrà andare incontro alla modalità di divisione non simmetrica, tipica della fase adulta, cioè produce due cellule figlie: una specializzata, che andrà incontro a differenziazione, l'altra staminale, cioè indifferenziata. Questo tipo di divisione asimmetrica, nel tempo, garantisce la presenza di una cellula non-differenziata e quindi la possibilità di riparazione del tessuto a cui la cellula appartiene. In un muscolo, ad esempio, la presenza di cellule staminali garantisce il ricambio cellulare qualora le cellule muscolari fossero diventate troppo vecchie o comunque incapaci di riprodursi. Non tutti i tessuti hanno la capacità di auto-ripararsi o di auto-rinnovarsi: ciò dipende o dall'assenza, in quel tessuto, di cellule non-specializzate o di cellule labili. I tessuti a parziale capacità di rinnovamento sono caratterizzati dalla presenza di cellule dette stabili. Le cellule staminali si definiscono infatti labili quando sono sempre in attiva proliferazione ((cheratinociti, cellule del midollo osseo e della mucosa digestiva)), stabili quando operano seppure in maniera ridotta (ad esempio gli epatociti) e perenni quando cessano la loro attività di sostituzione/creazione di cellule (ad esempio cellule del sistema nervoso).

4 Classificazione in base all'origine Le cellule staminali possono essere classificate anche in base alla loro sorgente di derivazione: Cellule staminali amniotiche Le cellule staminali amniotiche provengono dal liquido amniotico e possono essere ottenute tramite amniocentesi. Queste cellule hanno caratteristiche biologiche molto simili alle cellule staminali embrionali, ma non hanno le controindicazioni di tipo etico legate alla distruzione dell'embrione. Sono molte le patologie per le quali è prevista l'applicazione sull'uomo dei risultati della ricerca ottenuti: dalle malattie della retina, al diabete, alle malattie neurodegenerative, alla chirurgia ricostruttiva, alle malattie rare. Inoltre è stato dimostrato che le cellule staminali amniotiche possono addirittura ridiventare cellule staminali embrionali, con tutte le caratteristiche biologiche delle staminali embrionali ma senza i problemi etici e di stabilità genomica delle embrionali stesse ]. Cellule staminali da villi coriali Le cellule staminali dei villi coriali sono contenute nelle strutture della membrana placentare denominati villi coriali. Le cellule staminali dei villi coriali sono staminali mesenchimali con prospettive applicative in medicina rigenerativa, avendo buone capacità riproduttive e ottima stabilità genomica. E' possibile conservare ad uso autologo le cellule staminali presenti in un frammento dei villi coriali prelevati durante l'esecuzione della villo centesi ppure da un frammento di placenta prelevato subito dopo il parto: in entrambi i casi una cellula staminale da villo coriale conserva le proprie capacità riproduttive tipiche delle staminali embrionali unite alla stabilità genomica delle adulte ed all'assenza di complicazioni etiche [50] Cellule staminali ottenute dal sangue del cordone ombelicale Il sangue residuo della placenta e del cordone ombelicale costituisce una fonte di cellule staminali emopoietiche adulte (sono cellule staminali che danno origine a tutte le cellule del sangue). Dal 1988 queste cellule staminali da cordone ombelicale sono impiegate per curare il morbo di Gunther, la sindrome di Hurler, la leucemia linfocitica acuta e molte altre patologie che interessano in particolare i bambini. Il sangue è raccolto dal cordone ombelicale - sia in caso di parto spontaneo che di taglio cesareo - facendo un prelievo (in circuito chiuso sterile) dalla vena ombelicale. Una volta raccolto, ne viene calcolato il volume e la quantità di globuli bianchi, che non devono essere inferiori, rispettivamente, a 60 ml e 800 milioni (la quantità dei bianchi minimi alla raccolta è spesso diversa da banca a banca, è però comunemente accettato il fatto che ad unità congelata non debbano essere inferiori a 800 milioni) [51][52][53][54][55][56][57]. Cellule staminali adulte Sono le cellule staminali presenti nell'individuo adulto. Le cellule staminali adulte sono cellule non specializzate che si riproducono giornalmente per fornire alcune specifiche cellule: ad esempio 200 miliardi di globuli rossi sono generati ogni giorno nel corpo da cellule staminali emopoietiche adulte: questo processo è chiamato differenziazione (vedi morfogenesi). Le staminali adulte nello stroma del midollo osseo possono trasformarsi in cellule epatiche, neurali, muscolari, renali e follicolari [58][59][60]. Caratteristiche molto simili o identiche si ritrovano anche nelle cellule staminali contenute nel tessuto adiposo, presenti in abbondanza e facilmente prelevabili con una semplice lipoaspirazione. Il lipoaspirato può essere

5 processato anche immediatamente, rappresenta pertanto la fonte maggiormente rapida per ottenere cellule staminali adulte mesenchimali. Le cellule staminali adulte mantengono gradi di versatilità limitati, la differenziazione di un tipo di cellula staminale in un altro è stata definita transdifferenziazione Cellule staminali embrionali Le cellule staminali embrionali (ES) sono cellule pluripotenti ricavate dalla massa cellulare interna della blastocisti. Queste cellule, una volta estratte, possono essere messe in coltura e fatte proliferare quali linee indifferenziate oppure si può procedere facendole differenziare nella linea cellulare voluta dal ricercatore. Grazie a questo tipo di cellule è stato scoperto molto sulla segnalazione e il differenziamento delle cellule degli embrioni, ma sono state anche utilizzate in esperimenti genetici nel topo volti alla comprensione della funzione di alcuni geni, dove sono stati generati topi knockout (cioè in cui è stato volutamente inattivato o deleto un gene dal DNA) e topi knockin (dove un gene è sostituito da una sequenza di DNA mutata). Queste cellule sono il principale strumento degli studi per la rigenerazione di alcuni tessuti che nell'organismo sono quiescienti o non proliferanti come ad esempio i cardiomiociti cardiaci, i neuroni o gli epatociti Cellule staminali pluripotenti indotte (ips Gli scienziati giapponesi Kazutoshi Takahashi e Shinya Yamanaka sono stati i pionieri della riprogrammazione di cellule differenziate in cellule pluripotenti nel topo tramite induzione. Hanno dimostrato che la pluripotenzialità di una cellula staminale dipende dall'espressione di almeno quattro geni (Oct 3/4, c-myc, Sox-2 e Kfl4), tutti fattori di trascrizione a cui si deve aggiungere una proteina homeobox chiamata Nanog che impedisce alle staminali di differenziarsi, anche se quest'ultima non risultò indispensabile. Per fare ciò hanno utilizzato dei fibroblasti umani che sono stati riprogrammati mediante trasfezione dei quattro geni sopra riportati, facendoli diventare cellule staminali pluripotenti. [93]. Un altro laboratorio ha condotto un esperimento simile utilizzando i geni Sox-2, Oct 3/4, Lin28 e Nanog. [94]. Le cellule riprogrammate risultato di questi esperimenti sono state chiamate cellule staminali pluripotenti indotte (ips) e dato che sono generate a partire da cellule somatiche adulte non presenterebbero i problemi etici delle cellule staminali embrionali (ES) e potrebbero essere impiegate più diffusamente nelle terapie basate sulle cellule staminali. Un problema è che uno dei quattro geni, c-myc e Kfl4, è un potente oncogeno, per cui si dovrebbero cercare altri geni che, pur generando ips non siano oncogeni. Sembra che altri laboratori siano riusciti a produrre ips facendo a meno di c-myc. [95] Cellule staminali partenogenetiche: la nascita vergine che fa battere il cuore Nuove prospettive per la medicina rigenerativa arrivano dalle cellule staminali partenogenetiche. Senza ricorrere a cellule embrionali, ricercatori tedeschi sono riusciti a ricreare in laboratorio cellule di tessuto cardiaco. Quando un infarto colpisce il cuore, fino a un miliardo di cellule cardiache va incontro a morte lasciando una cicatrice indelebile. Per fortuna, oggi esistono terapie in grado di limitare i danni di un'ischemia cardiaca, ma la vera cura giace nella possibilità di sostituire il tessuto cardiaco ormai inutile con nuovi cardiomiociti. Nel tentativo di eliminare la necessità di un trapianto di cuore, la medicina rigenerativa lavora da anni con l'obiettivo di produrre cardiomiociti in vitro: nuove

6 prospettive giungono ora dalle cellule staminali partenogenetiche. Senza ricorrere a cellule embrionali, ricercatori tedeschi sono riusciti a ricreare in laboratorio cellule di tessuto cardiaco trapiantate poi con successo in un modello animale. Partenogenesi, la nascita vergine La partenogenesi è una forma di riproduzione asessuata che, nonostante sia assente nei mammiferi, si può riscontrare normalmente in diversi organismi: dalle piante agli insetti, dai pesci agli anfibi e rettili. Durante la partenogenesi (che in greco significa nascita vergine ), un uovo non fertilizzato inizia a dividersi e svilupparsi in un nuovo individuo: tutto ciò avviene, però, senza che sia intervenuto il gamete maschile a fertilizzarlo. Nei casi di partenogenesi obbligata, ad esempio, l'intera popolazione è costituita da femmine e tutti i discendenti sono geneticamente identici alla madre. Cellule staminali partenogenetiche: che cosa sono e come si producono? Già da diversi anni sono note ai ricercatori molecole in grado di mimare il processo di fertilizzazione e di innescare artificialmente il fenomeno della partenogenesi. Questo sistema di induzione funziona anche con le cellule di mammiferi ed è stato recentemente impiegato per produrre in vitro cellule partenogenetiche pluripotenti: analogamente a quanto osservato per le cellule staminali embrionali, le cellule staminali partenogenetiche sono in grado di rispondere a vari stimoli differenziativi e di dare quindi origine a diversi tipi di tessuti. Nonostante le analogie, esistono però differenze fondamentali tra cellule staminali embrionali e cellule partenogenetiche: a differenza delle embrionali, le cellule ottenute per partenogenesi non derivano da un uovo fecondato e non potrebbero mai dare origine ad un nuovo individuo. Partendo da questa scoperta, ricercatori tedeschi hanno indotto il processo di partenogenesi in cellule somatiche (adulte) di un topolino, generando così cellule staminali partenogenetiche (dette anche PSC, dall'inglese Parthenogenic Stem Cells). Queste cellule sono poi state guidate verso il differenziamento in cardiomiociti, le cellule muscolari che sostengono l'attività contrattile del cuore. I cardiomiociti così generati sono stati fatti crescere attorno ad una struttura di sostegno (chiamata in gergo scaffold), che ne ha permesso l'organizzazione tridimensionale in quello che, a tutti gli effetti, è un tessuto cardiaco. Il muscolo è stato poi trapiantato sul cuore dello stesso topolino da cui era stata presa la prima cellula, quella utilizzata per indurre il processo di partenogenesi. Lo studio, pubblicato sulle pagine del Journal of Clinical Investigation, mostra che le cellule ottenute dalle PSC sono cardiomiociti a tutti gli effetti, con sarcomeri ben sviluppati e in grado di sostenere l'attività elettrofisiologica tipica dei cardiomiociti maturi. Cosa ancora più importante, le cellule trapiantate hanno attecchito e sincronizzato la propria attività elettrica con quella del cuore del topo ricevente il trapianto. Cellule staminali partenogenetiche: un'alternativa per la medicina rigenerativa del futuro? Il vantaggio di utilizzare cellule staminali ottenute per partenogenesi è duplice. Innanzitutto, la generazione di queste cellule pluripotenti non richiede affatto l'utilizzo di embrioni, permettendo di agire nel rispetto delle questioni etiche che invece impregnano l'utilizzo di cellule staminali embrionali. In secondo luogo, le cellule staminali partenogenetiche hanno un notevole vantaggio anche dal punto di vista clinico. Ad oggi, quando un organo viene trapiantato, uno dei rischi maggiori riguarda il rigetto dell'organo: in altre parole, il sistema immunitario del paziente riconosce l'organo trapiantato come estraneo e può attivare una potente risposta immunitaria che, in alcuni casi, può danneggiare seriamente il nuovo organo, vanificando i vantaggi del trapianto. L'ipotesi di poter ottenere, in futuro, cellule partenogenetiche anche dall'uomo potrebbe ridimensionare notevolmente questo problema: poiché le cellule partenogenetiche vengono generate a partire da un solo individuo ed essendo quell'individuo lo stesso che riceverà il trapianto i rischi associati al rigetto dell'organo sarebbero praticamente azzerati. Per la medicina rigenerativa si tratta senza dubbio di una prospettiva affascinante, ma anche molto

7 ambiziosa: il sistema messo a punto dai ricercatori tedeschi è infatti incentrato sul modello del topo, ma rimane ancora da dimostrare se questa procedura funzionerà anche con le cellule umane. E se funzionerà, quali tessuti potranno essere generati in vitro a partire da queste cellule partenogenetiche? E' lecito pensare che passeranno ancora molti anni prima che si possa dire addio ai trapianti come unica strategia per sostituire un organo malato. Nondimeno, studi come questo sembrano indicare che la possibilità di ingegnerizzare in vitro tessuti ad hoc non sia più un'utopia impossibile da realizzare: molto difficile questo sì ma non impossibile. Si aprono nuove prospettive per il futuro della medicina rigenerativa dei tessuti, grazie alle nuove tecniche della nanotecnologia è possibile differenziare le cellule staminali con minori rischi. Una strada sulla quale sono incamminati diversi team di ricerca nel mondo, che registra un passo avanti grazie ai ricercatori del progetto NanoScale, promosso da un consorzio multidisciplinare coordinato dal prof. Vincent Torre della SISSA di Trieste e costituito da cinque centri europei di eccellenza (SISSA, IOM-CNR insediato in AREA Science Park -, ENS Ecole Normale Supérieure di Parigi, NMI -Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut di Reutlingen e DTU Technical University Denmark di Copenaghen) e da piccole imprese high-tech italiane e tedesche (Glance Vision Srl, Multi Channel Systems Gmbh, Promoscience srl di AREA Science Park). Partito nel 2008 e oggi in fase conclusiva, il progetto, finanziato dalla Commissione Europea con circa 3 milioni di euro, si è concentrato sull influenza di substrati con geometrie definite a livello nanometrico sulla differenziazione in vitro di neuroni e la formazione di reti neurali, eventi e reazioni che avvengono alla scala di 1 Angstrom, ovvero un decimillesimo di micron. Grazie a una serie di nuovi nanodispositivi che integrano in un singolo chip molteplici funzioni proprie dell attività di laboratorio (i cosiddetti Lab-On-Chip), nati dalla collaborazione tra scienziati e imprese industriali, si è riusciti a ottenere una migliore mappatura delle interazioni tra cellule e substrati. Gli esperimenti realizzati hanno dimostrato, in particolare, che, grazie all uso di substrati con strutture a nanopillars (nanopilastri), si registra una maggiore e più rapida differenziazione delle cellule staminali in cellule neuronali rispetto a quanto avviene con substrati tradizionali. Il dato saliente è che con questa tecnica è possibile ottenere la differenziazione cellulare in laboratorio senza l utilizzo di agenti biochimici stimolanti, che comportano un rischio di proliferazione incontrollata, dunque di tumore, abbastanza elevato. E bene sottolineare che non si tratta di risultati definitivi, poiché restano ancora da chiarire pienamente i meccanismi genetici che influiscono sullo sviluppo cellulare indotto. Centocinquanta anni fa abbiamo coperto che le cellule - invisibili a occhio nudo sono i mattoni elementari di tutte le creature viventi. Ogni essere vivente e tutti gli esseri viventi prendono origine da un unica entità, la cellula uovo fecondata. Ma dopo poche ore l unità originaria va perduta e ogni embrione diventa un grappolo di cellule con destini diversi. Pochi anni fa abbiamo scoperto che alcune delle cellule che compongono il corpo dell adulto le cellule staminali mantengono la capacità di moltiplicarsi. In questi anni una serie di straordinari esperimenti (dalla clonazione di Dolly nel 1997 allo sviluppo in laboratorio di cellule staminali prelevate da embrioni o feti umani l anno successivo, dalla scoperta che è possibile invertire il percorso dello sviluppo di una cellula nel 1999 fin all accelerazione della ricerca negli ultimi mesi), ha messo in discussione quello che sapevamo sui processi d invecchiamento e sta aprendo prospettive completamente nuove alla medicina. Invece di sostituire interi organi con un trapianto (con i ben noti problemi di rigetto), diventa possibile curare solo le parti malate di un determinato organi.

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