Policlinico Umberto I-Sapienza Università. UOS Immunoematologia Speciale. Serelina Coluzzi. Roma

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1 Serelina Coluzzi UOS Immunoematologia Speciale Policlinico Umberto I-Sapienza Università Roma

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3 Obiettivi principali dell esercizio: 1) Indagare sulla tipizzazione D e sulla comunicazione dei risultati per un paziente con partial D (DVI) Risultati restituiti da 65/65 laboratori Qualità dei campioni di sangue intero dei pazienti: accettabili per 62/65 laboratori (95,3%)

4 Risultati accettabili: D negativo, UI (Incapace di Identificare) e D variant (DVI partial). Reazione positiva score >2+ con 2 reagenti anti-d clerical error Identificazione positiva della variante: 56,25% dei laboratori

5 Corretta attribuzione del tipo RhD: alcuni buoni motivi Sistema Rh: secondo per importanza clinica soltanto al sistema ABO Antigene D: il più immunogeno degli AgRh Prevenzione delle reazioni trasfusionali emolitiche e della malattia emolitica del feto e del neonato

6 Geni RHD e RHCE e conformazione degli antigeni RhD ed RhCE nella membrana G Daniels, 2013

7 Discrepanzealla tipizzazione sierologica RhD: principali cause a) Variazioni nell espressione antigenica: epitopi D b) Differenze nei metodi di tipizzazione c) Differenze nei reagenti

8 Antigene RhD: evoluzione del concetto di mosaico Anni : antigene RhDè un mosaico di piccoli pezzi; gli individui che perdono uno o pùpezzi possono formare anticorpi anti-d verso le porzioni mancanti (Tippet, Sanger, 1962; Wiener, Unger, 1962) Ani 80: anticorpi monoclonali: il concetto di mosaico viene sostituito con quello di epitopi: 30 epitopi(isbt, Scott, 2002 ) Antigene RhD: continuum della forza di espressione, per cui Rh+ esprime tutti gli epitopi Circa 200 alleli RHD codificano per varianti della proteina D, differenziabili nella maggior parte dei casi solo con metodi molecolari

9 Varianti RhD Fenotipi : Partial D, prevalenti negli Africani (in origine da DIIa DVII, ora ulteriormente suddivisi: ~90 alleli) Weak D, 0,2-1% nei Bianchi (oltre 80 tipi, ~90% Type1-3) DEL: a più bassa densità antigenica, 10-30% negli Asiatici e 0,027% negli Europei apparentemente Rh-

10 Corretta attribuzione del tipo RhD: possibili problemi Discrepanze alla tipizzazione sierologica : Positività con alcuni reagenti, negatività con altri Reazioni deboli con gli antisieri impiegati Anti-D in pazienti con GR tipizzati come Rh+

11 Discrepanzealla tipizzazione sierologica RhD: principali cause a) Variazioni nell espressione antigenica: epitopi D b) Differenze nei metodi di tipizzazione c) Differenze nei reagenti

12 Discrepanzealla tipizzazione sierologica RhD: principali cause Differenze nei metodi di tipizzazione (fase liquida, colonna, fase solida: diverso approccio nellaricerca delle varianti Weak D) Differenze nei reagenti Policlonali: miscele di anticorpi rivolti verso diversi epitopi RhD Monoclonali: 1 clone 1 epitopo reagenti blended IgM+ IgG IgM+ IgM IgG+ IgG comunque non reattivi verso tutte le varianti antigeniche

13 Credidio DC, 2011

14 Raccomandazioni SIMTI per la determinazione del fenotipo RhD DONATORI Due reagenti anti-d (1 monoclonale e 1 policlonaleo 2monoclonali derivanti da cloni diversi), di cui almeno uno in grado di rilevare la variante DVI Ricerca del D weaknei casi negativi alla definizione di RhDcon test dell antiglobulina indiretto (TAD di controllo negativo) PAZIENTI Due reagenti anti-d (1 monoclonale e 1 policlonaleo 2monoclonali derivanti da cloni diversi), di cui almeno uno non in grado di rilevare la variante DVI Nei neonati negativi alla definizione di RhD ricerca della variante D weak mediante test dell antiglobulina indiretto (TAD di controllo negativo)

15 Raccomandazioni SIMTI per la attribuzione del tipo RhD Positività con entrambi i reagenti anti-d: RhD + Negatività con entrambi i reagenti anti-d e alla ricerca del D weak: RhD- Positività di un solo anti-d e negatività/positività alla ricerca del D weak: IN CASO DI DONATORE:attribuzione cautelativa del fenotipo RhD+ IN CASO DI PAZIENTE: attribuzione cautelativa del fenotipo RhD-

16 Variante partial DVI Reagenti anti-d: IgM non reagiscono con DVI IgG reagiscono con DVI nei test per WeakD E la variante partial D più comune nei Caucasici: 0,02-0,05% 4 sottotipi: tutti hanno un gene ibrido RHD-CE-D, ma gli esoni derivanti da RHCE sono: 4 e5 nel tipo DVI-1 4 e 6 DVI-2 3 e 6 DVI-3 3 e 5 DVI-4 Tutti presentano modifiche nella porzione esterna della molecola del D e tutti codificano un antigene D con caratteristiche epitopiche tipiche del DVI, anche se i fenotipi che ne derivano non sono identici, differendo tra loro per forza di reazione ed espressione dell antigene BARC associato

17 Variante partial DVI N di siti antigenici/gr RhD + normale : PartialDVI-2 : Daniels G, 2013

18 Discrepanze alla tipizzazione sierologica RhD Reagenti monoclonali anti-d possono contenere differenti: anticorpi concentrazioni proteiche potenzianti (polivinilpirrolidone, polietilenglicole) stabilizzanti di reazione

19 Comportamento sierologico principali varianti Partial D (reagenti approvati FDA) Denomme GA, 2008 La variante partial DVI è comunemente associata ad alloimmunizzazione anti-d

20 Pattern di reazione della variante partial DVI Anti-D Albaclone Epitopo LHM76/59 3 ESD1 3 LHM76/55 3 LHM77/64 9

21 Struttura dei fenotipi weak D e partial D Flegel 2002

22 Weak e partial D: problemi correlati alla terminologia corrente 1)Weak D: non producono alloanticorpi anti-d non è sempre vero ( , 11 e 15) e per altre non è ancora escluso Individui con fenotipi DAR e Weak D 4.2 hanno prodotto anti-d Differiscono per una singola mutazione silente, che non modifica la sequenza aminoacidicadella proteina: rappresentano pertanto varianti con identico fenotipo e genotipo quasi identico

23 Weak e partial D: problemi correlati alla terminologia corrente 2) Localizzazione della sostituzione aminoacidica(intra-membranaria, intracitoplasmatica..): definizione non funzionale, anche perché non è nota la precisa localizzazione dei residui di aminoacidi nella membrana Pertanto i termini weak e partial, e qualsiasi classificazione che li distingua rigidamente, sono da considerarsi obsoleti: entrambi i termini dovrebbero essere rimpiazzati dalla singola accezione variant D (Daniels G, 2013).

24 Vrebberoessere trattati come Rh- Corretta gestione clinica delle varianti RhD Una soluzione sierologica per identificare in maniera appropriata le varianti antigeniche non è semplice, pertanto: campioni di pazienti con score <1+ in fase liquida e < 2+ su colonna, dovrebbero essere trattati come Rh- le varianti weakd 1, 2 e 3 (soltanto i metodi molecolari sono in grado di identificarle in maniera sicura) dovrebbero essere considerate come Rh+ in termini di indicazioni trasfusionali e profilassi anti-d.

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26 Obiettivi principali dell esercizio Valutare il rilevamento dell incompatibilità ABO e dell incompatibilità dovuta ad anticorpi anti-s nel cross-match Risultati restituiti da 65/66 laboratori (98,5%) Qualità dei campioni: plasma dei pazienti e campioni donatori: soddisfacente per tutti i laboratori sangue intero Paziente 1 e Paziente 3: insoddisfacenti (emolisi) per 7/66 (11%) Sangue intero Paziente 2: insoddisfacente (emolisi) per 8/66 (13%) Risultati attesi: identificazione di anti-s nel Paziente 2 deselezione per incompatibilità ABO del Paziente 2 col Donatore Y cross match del Paziente 2 con il Donatore W e il Donatore Z incompatibili per presenza dell antigene S in eterozigosi (Donatore W) ed omozigosi ( Donatore Z)

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29 Informazioni desunte dal test di screening: Anticorpo - distrutto dal trattamento enzimatico -effetto dose (cellula 2 score 3+, cellula 3 score 4+) -associazione anticorpale Sospetti: anti-m + altro? (K,S)? anti-fyb + altro? (K,M,N,S)? Anti-S?

30 Sospetto: anti-s Non si possono escludere: K (coperto) Fyb+ altro (S,s,N) Esclusoprobabilmente M Cell K Fya Fyb S s M N Risultato

31 Cell K Fya Fyb S s M N Risultato Possono essere esclusi: -K, -Fy b,-m,-s

32 Adozione di una procedura sistematica di esclusione/inclusione delle specificità anticorpali sospette Ruling out esclusione degli antigeni che non reagiscono (un anticorpo reagirà solo con le cellule che esprimono l antigene) Regole: es: regola del tre : il siero/plasma del paziente reagisce con almeno tre cellule che esprimono l antigene, ed è inerte con almeno 3 cellule negative per l antigene sospettato Comportamento sierologico dell anticorpo sospettato (es.:temperatura di reazione, sensibilità al trattamento enzimatico) Score di reazione (effetto dose; miscele anticorpali) Ricorso a metodiche alternative (neutralizzazione, uso reagenti sulfidrilici, impiego tecniche enzimatiche)

33 Adozione di una procedura sistematica di esclusione/inclusione delle specificità anticorpali sospette Ricorso a metodiche alternative (neutralizzazione, uso reagenti sulfidrilici, impiego tecniche enzimatiche) Selezione di cellule da pannelli diversi per la conferma del sospetto diagnostico Controllo autologo (paziente trasfuso??) Considerare il fenotipo eritrocitario del paziente (paziente trasfuso??) Considerare, in ultima analisi, possibili fenomeni di interferenza (es.: interferenza da BLISS, reazione contro antibiotici e sostanze conservanti dei pannelli )

34 Identificazione anticorpale e crossmatching: punti critici Tipologia e qualità del campione, tempo dalla raccolta Composizione antigenica dei pannelli eritrocitariper screening ed identificazione Preparazione e standardizzazione delle sospensioni eritrocitarie per il cross match Mezzi potenzianti Reagenti validati per l uso Sensibilità del metodo impiegato

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36 Identificazione anticorpale e crossmatching: punti critici Cause di risultati falsamente negativi Neutralizzazionedeglianticorpi Inadeguato lavaggio, paraproteinemia Test interrotto, tempi di incubazione abbreviati Dissociazione degli anticorpi Cattiva conservazione dei reattivi Contaminazione, congelamento, invecchiamento Procedure errate Centrifugazione, aggiunta dei reagenti, sospensioni eritrocitarie, rapporto plasma/emazie Temperatura e ph della soluzione fisiologica o delle soluzioni diluenti

37 Identificazione anticorpale e crossmatching: punti critici Attenzione alle indicazioni del fornitore: Impiegare campioni freschi, conformi, prelevati preferibilmente in citrato, EDTA o CPDA. Possono essere impiegati anche campioni senza anticoagulante. Gli eritrociti devono essere mantenuti alla T di C durante l impiego e devono rimanere in sospensione

38 Identificazione anticorpale e crossmatching: punti critici Sospensioni eritrocitarie (0,8%-3%,5%) Il fornitore dichiara la concentrazione della sospensione da usare per la massima garanzia di sensibilità sia con metodo manuale, sia automatico OCD: maggior sensibilità delle preparazioni allo 0,8% in Red Cell Diluent Biorad: ID Diluent2, soluzione a bassa forza ionica modificata, da impiegare per la sospensione al 5% (determinazione gruppo) e allo 0,8% per cross match, autocontrollo,ricerca anticorpale, TAD, gruppo neonato e cellule test preparate in laboratorio)

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