NOVA Lite TM Thyroid Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 NOVA Lite TM Thyroid Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso NOVA Lite TM Tiroide è un test immunofluorescenza indiretta per lo screening e la determinazione semiquantitativa degli anticorpi anti microsomi tiroidei ed anti colloide/tireoglobulina nel siero umano. La presenza di anticorpi anti microsomi ed anti colloide può essere utilizzata, assieme ad altre analisi sierologiche e ai riscontri clinici, come ausilio nella diagnosi di malattie autoimmuni della tiroide. Riassunto e Spiegazione del test Gli autoanticorpi anti-tiroide sono grandemente implicati nella eziologia delle malattie autoimmuni della tiroide e sia gli anticorpi anti-tireoglobulina che quelli anti-microsomi sono misurati di routine nella pratica clinica. 1,2 Gli autoanticorpi del siero diretti contro l antigene microsomiale della tiroide si riscontrano comunemente nei pazienti affetti da malattie autoimmuni della tiroide e la loro presenza è ben correlata con le modificazioni istologiche nella tiroidite di Hashimoto. 3 Nel 70-90% dei pazienti affetti da tiroidite cronica l analisi all immunofluorescenza indiretta per la ricerca di anticorpi diretti verso antigeni microsomiali della tiroide risulta positiva. Questi anticorpi si ritrovano anche nel 64% dei pazienti affetti da ipotiroidismo primario, nel 50% dei pazienti affetti da tireotossicosi, nel 10% dei pazienti affetti da gozzo semplice e nel 17% dei pazienti affetti da tumori tiroidei. 4 Gli autoanticorpi anti-tireoglobulina si riscontrano, con titolo elevato, principalmente nella tiroidite autoimmune e nel morbo di Graves. Con la immunofluorescenza si sono riscontrati, nel siero del 40-70% dei pazienti affetti da tiroidite cronica, autoanticorpi antitireoglobulina/colloide; in percentuale minore si sono riscontrati anche in pazienti affetti da tireotossicosi e gozzi non tossici. 5,6 Gli autoanticorpi anti tiroide sono stati studiati tramite precipitazione, 7 fissazione su lattice 8, emoagglutinazione 9 ed immunofluorescenza. 10,11 L immunofluorescenza si è dimostrata essere sia sensibile che specifica nel rivelare gli autoanticorpi anti-tiroide. A differenza delle tecniche di emoagglutinazione comunemente utilizzate, l immunofluorescenza rivela gli anticorpi non precipitati e non è influenzata negativamente dalla presenza dei fattori di inibizione della agglutinazione 12 o da anticorpi eterofili. Principio della Metodica Nel test all immunofluorescenza indiretta dei campioni vengono incubati con il substrato dell antigene e gli anticorpi che non hanno reagito vengono lavati via. Il substrato viene incubato con il coniugato marcato con fluorescina assorbito dal primate specifico e quindi il reagente libero viene eliminato. All'osservazione con un microscopio a fluorescenza, i campioni positivi agli autoanticorpi mostreranno una fluorescenza verde mela corrispondente alle aree del tessuto tiroideo in cui si è legato l autoanticorpo. Reagenti 1. Vetrini di substrato di Tiroide (primate tiroide), 8 pozzetti/vetrino, con essiccante 2. Coniugato anti-igg umano Assorbito dal primate (capra), marcato alla fluoresceina in tampone contenente Blu di Evans ed azoturo di sodio allo 0,09%, 7 ml 3. Tiroide positivo 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ed anticorpi da siero umano diretti verso il Tiroide, prediluto, 0,5 ml 4. Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09%, senza anticorpi di siero umano anti Tiroide, prediluto, 0,5 ml 5. Concentrato PBS (40x), sufficiente per 1000 ml 6. Liquido di montaggio, azoturo di sodio 0,09%, 7 ml 7. Coprivetrini Avvertenze 1. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa 1

2 dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Tiroide positivo ed Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 3. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 4. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato dai pozzetti IFA può causare un un elevato background. 4. L'adattamento di questo test per l'uso con un processatore automatico di campioni ed altri dispositivi di manipolazione di liquidi, in tutto od in parte, può portare differenze nei risultati dei test rispetto a quelli ottenuti eseguendo la procedura manuale. E' responsabilità di ogni laboratorio validare la loro procedura automatizzata affinché fornisca risultati dei test entro limiti accettabili. 5. La prestazione del test è influenzata da diversi fattori. Questi includono la temperatura iniziale dei reagenti, la luminosità della lampada del microscopio usato, l'accuratezza e riproducibilità della tecnica di pipettamento, la precisione del lavaggio e la lunghezza dei tempi d'incubazione durante il test. E' richiesto di prestare particolare attenzione alla consistenza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Nel tempo, il Coniugato anti IgG Umana assorbito dal primate può cambiare colore a causa di esposizione alla luce. In ogni caso, il cambiamento del colore non ha effetto sulla prestazione del test. 7. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 4 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 10 8-pozzetti Vetrini Tiroide 1 7 ml Coniugato IgG Assorbito dal primate 1 0,5 ml Tiroide positivo 1 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA 1 25 ml Concentrato PBS (40x) 1 7 ml Liquido di montaggio 1 10 Coprivetrini 2

3 Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grando di erogare volume di μl Acqua distillata o deionizzata Bottiglie di plastica a spruzzo o pipette Pasteur Camera umida Beuta da 1l per diluire il PBS Vaschette Coplin Microscopio a fluorescenza con eccitatore a 495 nm e filtro barriera 515 nm Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire il concentrato PBS: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone contenente il concentrato PBS in 975 ml di acqua distillata o deionizzata e mescolare accuratamente. Il tampone PBS viene utilizzato per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato al massimo per 4 settimane 2 8 C. 3. Diluire i campioni del paziente: a. Screening iniziale: diluire i campioni 1:10 con il tampone PBS diluito (ovvero, aggiungere 100 μl di siero a 900 μl di tampone PBS). b. Titolazione: preparare delle diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti i campioni positivi con il tampone PBS diluito (ovvero 1:20, 1:40,... 1:2560). Esecuzione del test 1. Preparare i vetrini del substrato: lasciare raggiungere la temperatura ambiente al vetrino del substrato prima di toglierlo dal sacchetto. Contrassegnarlo con una matita e porlo in una camera umida adeguata. Aggiungere 1 goccia (70-90μL) dei controlli positivi e negativi non diluiti rispettivamente nei pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (70-90μL) del campione diluito del paziente nei rimanenti pozzetti. 2. Incubazione dei vetrini: incubare il vetrino per minuti in una camera umida (un tovagliolo di carta inumidito disteso sul fondo di un contenitore in plastica o vetro manterrà le condizioni di umidità adeguate). Non lasciare asciugare il substrato durante la procedura d esame. 3. Lavare i vetrini: dopo l incubazione utilizzare una bottiglia di plastica a spruzzo o una pipetta per lavare via delicatamente il siero utilizzando il tampone PBS diluito. Orientare il vetrino e la direzione del flusso del tampone PBS in modo da impedire il più possibile al tampone di scavalcare i vari pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente nei pozzetti per evitare danni al substrato. Se voluto, disponga gli vetrini i in un vaso di Coplin dell'amplificatore diluito di PBS per fino a 5 minuti. 4. Aggiunta del coniugato fluorescente eliminare il tampone PBS in eccesso. Porre nuovamente il vetrino nella camera umida ed immediatamente coprire tutti i pozzetti con una goccia di coniugato fluorescente. Incubare i vetrini per ulteriori minuti. 5. Lavare i vetrini: ripetere la fase Coprire i vetrini: le procedure per coprire i vetrini variano da laboratorio a laboratorio. Le seguenti procedure sono raccomandate: a. Porre un coprivetrino su un tovagliolo di carta. b. Applicare il liquido di montaggio in una linea continua lungo il bordo inferiore del coprivetrino. c. Eliminare il tampone PBS in eccesso e fare combaciare il bordo inferiore del vetrino con il bordo del coprivetrino. Abbassare con delicatezza il vetrino sul coprivetrino in modo che il collante scorra fino al bordo superiore del vetrino senza formare bolle d aria. Controllo di qualità Il Tiroide positivo ed il Controllo negativo sistema IFA dovrebbero essere effettuati su ogni vetrino in modo da assicurarsi che tutti i reagenti e le procedure siano state eseguite nel modo corretto. Si può preparare dell ulteriore siero di controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a < - 70 o C. I risultati dell analisi devono soddisfare tutti i criteri elencati qui di seguito per essere considerati validi. Se uno qualunque non viene soddisfatto, si dovrebbe considerare non valido il risultato dell esame e si dovrebbe 3

4 ripetere il test. 1. Il Tiroide positivo non diluito deve essere > Il Controllo negativo sistema IFA deve risultare negativo. Interpretazione dei risultati Reazione negativa. Un campione viene considerato negativo se la colorazione specifica del citoplasma delle cellule epiteliali tiroidee (microsomi) o della colloide (tireoglobulina) è uguale o minore al controllo negativo. Reazione positiva agli anticorpi microsomiali. Questa reazione si manifesta come una colorazione fluorescente del citoplasma delle cellule epiteliali. Il nucleo generalmente non risulta colorato. Reazione positiva agli anticorpi anti-tireoglobulina/colloide. Questa reazione si manifesta come un pattern di colorazione della colloide di tipo flocculare o a vetro frantumato. Determinare il grado o l intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri: 4+ Fluorescenza verde chiaro brillante 3+ Fluorescenza verde chiara accesa 2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile 1+ La fluorescenza specifica più bassa che permette di distinguere chiaramente la colorazione cellule epiteliali tiroidee (microsomi) o della colloide (tireoglobulina) rispetto alla fluorescenza di fondo Limitazioni del test 1. Quando nello stesso campione sono presenti due o più autoanticorpi ci possono essere dei fenomeni di interferenza. Questi sono caratterizzati da pattern di fluorescenza che variano con la diluizione del campione e titoli estremi inconsistenti. In questi casi si dovrebbe segnalare la presenza di entrambi gli anticorpi. 2. La sensibilità del test è influenzata da una serie di fattori esterni fra cui il tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, la forza e l età della lampadina, l ingrandimento utilizzato, il filtro utilizzato e l osservatore. 3. Se viene utilizzato un filtro a banda invece di un filtro barriera 515, si può osservare un numero maggiore di artefatti di colorazione. 4. Si dovrebbe utilizzare solamente una matita per marcare i vetrini. Qualunque altro tipo di materiale per scrivere può causare artefatti. 5. Le vaschette Coplin utilizzate per lavare i vetrini non dovrebbero contenere residui di colorante. L utilizzo di vaschette Coplin che contengono residui di colorante può causare artefatti. 6. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 7. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi Il test NOVA Lite TM Tiroide è stato utilizzato per valutare 24 pazienti affetti da tiroidite cronica (di Hashimoto). Sono stati analizzati anche 15 pazienti affetti da diabete tipo 1 e 67 donatori di sangue scelti in maniera casuale senza anormalità tiroidee riferite. I risultati appaiono qui di seguito: Gruppo di pazienti Numero Microsomiale Colloide Tiroidite cronica Diabete tipo Normali Bibliografia 1. Davies TF and DeBernardo, E: Thyroid autoantibodies and disease. In Autoimmune Endocrine Disease, TF Davies, ed., Wiley, New York, NY, 1983, p Wall JR and Kuroki, T: Immunologic Factors in Thyroid Disease. Medical Clinics of North America 69: 913, Hall R and Evered, DC: Autoimmune thyroid disease: thyroiditis. In Endrocrinology, DeGroot LJ et. al., eds., Grune and Stratton, New York, NY, 1979, p

5 4. Delespesse G. et. al.: Thyroid autoimmunity. In Thyroiditis and Thyroid Function, P.A. Bastenie and A.M. Evans, eds., Pergamon Press, Oxford, 1972, p Balfour BM, et. al.: Fluorescent antibody studies in human thyroiditis: autoantibodies to an antigen of the thyroid colloid distinct from thyroglobulin. Br. J. Exp. Pathol. 43:307, Tung KSK, et. al.: Antithyroid antibodies in juvenile lymphocytic thyroiditis. Am. J. Clin. Pathol. 61: 549, Doniach D and Roitt, IM: Autoimmunity in Hashimoto's disease and its implications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 17: 1293, Philip JR, et. al.: A latex particle precipitation test in the diagnosis of thyroid disease. J. Clin. Pathol. 15: 148, Fulthorpe AJ, et. al.: A stable sheep cell preparation for detecting thyroglobulin autoantibodies and its clinical applications. J. Clin. Pathol. 14: 654, Holborrow J, et. al.: Cytoplasmic localization of complement-fixing auto-antigen in human thyroid epithelium. Br. J. Exp. Pathol. 40: 583, Doniach D: Thyroid autoimmune disease: symposium on thyroid gland. J. Clin. Pathol. 20: 385, Wilkikn TJ, et. al.: A passive hemagglutination (TRC) inhibitor in thyrotoxic serum. J. Clin. Endocrinol. 10: 507, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007 Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ITA April 2008 Revision 12 5