Caratteristiche e problematiche dell analisi del chimerismo

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1 Caratteristiche e problematiche dell analisi del chimerismo Caratteristiche e problematiche dell analisi del chimerismo Daniela Di Martino 7 UKNEKAS U.O.Trapianto Users Meeting di Cellule Staminali Ematopoietiche Daniela Di Martino 7 Milano UKNEKAS 13 Dipartimento novembre Users 2014 Meeting di Ematologia e Oncologia Pediatrica IRCSS G.Gaslini IRCSS IRCCS G.Gaslini Genova U.O.S.D.Trapianto di Cellule Staminali Ematopoietiche Dipartimento di Ematologia e Oncologia Pediatrica Genova

2 Chimerismo Post Trapianto E stato introdotto in medicina da Anderson nel 1951; E stato utilizzato per la prima volta riferito al trapianto da Ford nel 1956; Dopo un trapianto di cellule staminali allogeniche si crea nel paziente una chimera dinamica che coinvolge le cellule del donatore e del ricevente; Studiare il chimerismo post-trapianto significa analizzare percentualmente il contributo del donatore e del ricevente all ematopoiesi e alla linfopoiesi. Un accurato controllo del chimerismo a diversi tempi post-trapianto, sul sangue periferico e/o sul midollo del paziente: a) fornisce importanti indicazioni circa il progredire dell attecchimento b) rappresenta un elemento chiave nel predire o confermare il rigetto o la ricaduta.

3 Analisi quantitativa del Chimerismo Post Trapianto: permette una valutazione della percentuale di ematopoiesi del donatore rispetto a quella del ricevente; è importante nel monitoraggio dei pazienti dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche; fornisce informazioni sull attecchimento in tempi molto precoci dopo il trapianto; la sua dinamica nel tempo permette di ottenere informazioni sull esito del trapianto stesso; contribuisce a porre diagnosi precoce di: fallimento dell attecchimento, parziale o completo attecchimento, recidiva della sottostante malattia, incipiente GvHD.

4 RFLP (restriction fragment length polymorphism analysis) CHIMERISM ANALYSIS Sensitivity (%) Unfavorable Feature 5-10 Long times Cytogenetics 5 Long times Red Cell Phenotype 1-5 lineage specific X/Y FISH sex-mismatched STR-PCR 1-5 moderated sensitivity STR subpopulations expensive Real-Time PCR (SNP) false +/sex mismatched

5 DC (Complete Donor Chimerism) = Chimerismo Completo presenza di DNA del donatore del 99%. MC (Mixed Chimerism ) = Chimerismo Misto presenza di DNA del ricevente > dell 1%. TMC (Transient Mixed Chimerism) Chimerismo Misto Transitorio: Chimerismo Misto che in un tempo più o meno lungo evolve in chimerismo completo. SMC (Stable Mixed Chimerism) Chimerismo Misto Stabile: Profilo misto che si conserva stabile nel tempo con delle oscillazioni. PMC (Progressive Mixed Chimerism ) Chimerismo Misto Progressivo: Chimerismo misto che evolve in una progressiva perdita della quota donatore e aumento della quota ricevente fino al rigetto secondario. (ESH-EBMT Handbook.2008; E.Ozyurek et al. BoneMarrowTransplant.2008; P.Bader et al. 2005)

6 LSC (Lineage Specific Chimerism) Chimerismo Specifico di Linea Cellulare quando il DNA del ricevente può essere presente solo in alcune linee cellulari e/o nelle varie linee cellulari c è una variabile proporzione delle quote donatore/ricevente. RA (Autologous Recovery) Ripresa Autologa quando il DNA estratto dal sistema linfoematopoietico post trapianto è tutto del ricevente. (ESH-EBMT Handbook.2008; E.Ozyurek et al. BoneMarrowTransplant.2008; P.Bader et al. 2005)

7 Dal 2006: Valutazione del chimerismo post trapianto su 221 pazienti pediatrici: 106 > Chimerismo Completo 115 > Chimerismo Misto > 68 > Chimerismo Misto Transitorio 19 > Chimerismo Misto Stabile 28 > Chimerismo Misto Progressivo Chimerismo Completo Chimerismo Misto leucemie linfatiche e mieloidi patologie ematologiche " genetiche 5 8 " metaboliche 5 12 " linfomi 3 8 " neuroblastomi e tumori solidi

8 Osservazioni sulla casistica: Chimerismo Completo è la regola dopo trapianto per malattia neoplastica. Nelle malattie non neoplastiche si associa ad un aumentato rischio di GvHD. Mancato attecchimento/precoce rigetto è un evento non così raro nelle malattie non neoplastiche. Solitamente non è recuperabile. Chimerismo Misto Transitorio in tutti i casi è associato ad un buon esito. Riduce il rischio di GvHD. Chimerismo Misto Stabile non esiste nelle malattie neoplastiche. Nelle altre malattie è associato ad un buon esito e riduce il rischio di GvHD. Chimerismo Misto Progressivo nella nostra esperienza ha sempre avuto il significato di recidiva nelle malattie neoplastiche, e di rigetto secondario nelle non neoplastiche.

9 PB / BM Estrazione DNA AmpFlSTR Profiler Plus PCR Amplification Kit(Applied Biosystem) analisi su sequenziatore (ABI Prism 3130 genetic analyzer) CHIMERISMO MISTO determinazione del chimerismo (Gene Mapper software) CHIMERISMO COMPLETO Lineage Specific Chimerism Separazione sottopopolazioni cellulari CD3+; CD56+; CD19+; CD14+ con Macs Separation Columns

10 Osservazioni sulla casistica Lineage Specific Chimerism: Una maggiore % di linfociti T (CD3+) del donatore correla con chimerismo misto transitorio. Una minore % di linfociti T (CD3+) del donatore correla con evoluzione sfavorevole con possibile esito in rigetto. La % delle cellule NK (CD56+) del donatore è quasi sempre uniformabile alla % dei linfociti T. Nelle patologie metaboliche la % dei monociti (CD14+) è predittiva di chimerismo misto progressivo e rigetto.

11 Polimorfismi STR I microsatelliti o STR (Short Tandem Repeat Markers) sono loci polimorfici di DNA, localizzati sui diversi cromosomi (nel genoma umano se ne conoscono ~106) Gli STR contengono sequenze nucleotidiche (da 2 a 7 nucleotidi) ripetute n volte es: TCTA (TCTG)1-3 (TCTA)n Al variare del numero di queste unità ripetute in un locus STR, varia la lunghezza allelica ETEROZIGOSI presenza di 2 alleli con diversa lunghezza OMOZIGOSI presenza di 2 alleli con lunghezza uguale. Analisi dei Polimorfismi = studio delle sequenze STR

12 Ampl Fl STR Profiler Plus Amplification Kit (Applied Biosystems) permette l amplificazione contemporanea di 9 loci polimorfici e di un segmento del gene omologo X-Y dell amelogenina (identificazione maschio-femmina) Locus Designation Chromosome Location Common Sequence Motif Size Range(bp) Dye Label D3S1358 3p TCTA(TCTG) 1-3 (TCTA) n FAM vwa 12p12-pter TCTA(TCTG) 3-4 (TCTA) n FAM FGA 4q28 (TTTC) 3 TTTT TTCT(CTTT) n CTCC(TTCC) FAM Amelogenin X:p JOE Y: p D8S (TCTR) n JOE D21S11 21 (TCTA) n (TCTG) n [(TCTA) 3 TA (TCTA) 3 TCA(TCTA) 2 TCCA TA](TCTA) n JOE D18S51 18q21.3 (AGAA) n JOE D5S818 5q21-31 (AGAT) n NED D13S317 13q22-31 (GATA) n NED D7S820 7q (GATA) n NED

13 H allele D1-2 : H allele D1-2 + H alleli R1 e R2 Post TCSE Donatore D1-2 D1-2 D1-2 Pre TCSE H allele D1-2 : R1 R2 H allele D1-2 + H allele R1-2 R1 R2 R1-2

14 Marcatore informativo: il marcatore analizzato è: in eterozigosi o in omozigosi sia nel ricevente che nel donatore; non è in stutter (dista più di 4 basi nella sequenza nucleotidica); se in eterozigosi, almeno uno dei due alleli del ricevente non corrisponde a quello del donatore e viceversa: R1-R2 e D1-D2 H D = H D1-D2 / H D1-D2 + H R1-R2 R e D1-D2 H D = H D1-D2 / H D1-D2 + H R R1-R2 e D H D = H D / H D + H R1-R2 R e D H D = H D / H D + H R Marcatore non informativo: il marcatore analizzato o in eterozigosi o in omozigosi nel ricevente corrisponde a quello del donatore o è in posizione di stutter : R = D R1-R2 = D1-D2 R1 o R2 = D1 o D2 4 bp D1 o D2 = R1 o R2-4 bp Stutter peaks o 4 peaks: si formano perché durante la PCR, la Taq polimerasi scivola sul DNA template e genera un prodotto che è di una unità ripetuta (4 bp) più piccola dell allele vero.

15 Marcatore informativo Chimerism Analysis Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation Kathleen M. Murphy.Methods in Molecular Biology, vol eterozigosi R e D: a) R1-R2 D1-D2 b) un allele R corrisponde a un allele D: R1=D2 o R2=D1 R1=D1 o R2=D2 2. eterozigosi R e omozigosi D: a) R1-R2 D1-2 b) il doppio allele D corrisponde a un allele R: R1=D1-2 o R2=D omozigosi R e eterozigosi D: a) R1-2 D1-D2 4. omozigosi R e omozigosi D: a) R1-2 D1-2 Importante è che: almeno un allele di R non corrisponda a un allele di D e non in posizione di stutter

16 Da giugno2012 Iscrizione Servizi External Quality Assessment EQA06E-Post-SCT Chimerism Monitoring Secondo Calendario UK NEQAS for Leucocyte Immunophenotyping (LI) 26 settembre 2012 trial n green 20 febbraio 2013 trial n green 17 luglio 2013 trial n green 04 dicembre 2013 trial n green 05 marzo 2014 trial n green 31 luglio 2014 trial n

17 Programmi futuri Proposta per Servizio UK NEQAS passaggio definitivo ad analisi di un maggior numero di marcatori con altri multiplex PCR KIT accreditamento EFI: European Federation for Immunogenetics ( in Italia facoltativo ma raccomandato dall IBMDR Italian Bone Marrow Donor Registry e dal Centro Nazionale Trapianti) inserire un controllo per Lineage Specific Chimerism su linfociti T.

18 Caratteristiche e problematiche Marco Di Duca dell analisi del UOC Nefrologia Dialisi e Trapianto IRCCS G Gaslini Genova chimerismo Edoardo Lanino Giuseppe Morreale Maura Faraci Stefano Giardino Paola Terranova UOSD Trapianto di Cellule Staminali Ematopoietiche Dipartimento di Ematologia e Oncologia Pediatrica IRCCS G.Gaslini Genova Daniela Di Martino U.O.Trapianto di Cellule Staminali Ematopoietiche 7 UKNEKAS Dipartimento Users Meeting di Ematologia e Oncologia Pediatrica IRCSS G.Gaslini Genova

19 Grazie!