Legionella. Catologo prodotti Metodi microbiologici colturali e molecolari
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- Angelica Cappelli
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1 Legionella Catologo prodotti Metodi microbiologici colturali e molecolari
2 Le legionelle sono presenti negli ambienti acquatici naturali e artificiali: acque sorgive, comprese quelle termali, fiumi, laghi, fanghi, ecc. Da questi ambienti esse raggiungono quelli artificiali come condotte cittadine e impianti idrici degli edifici, quali serbatoi, tubature, fontane e piscine, che possono agire come amplificatori e disseminatori del microrganismo, creando una potenziale situazione di rischio per la salute umana. La maggior parte dei casi di legionellosi sono stati attribuiti all inalazione di particelle di acqua aerodisperse, contenenti batteri provenienti da torri di raffreddamento o unità di umidificazione dell'aria; contaminazione di impianti di acqua potabile; apparecchi sanitari, fontane e umidificatori ultrasonici. Focolai epidemici si sono ripetutamente verificati in ambienti collettivi a residenza temporanea, come ospedali o alberghi, navi da crociera, esposizioni commerciali, ecc. 2
3 Generon grazie alla collaborazione con Bio-Rad propone una soluzione completa per la ricerca di Legionella che contempla: Prodotti per il campionamento e la filtrazione Kit di ricerca e quantificazione di Legionella spp. e pneumophila con tecnica Real-Time PCR certificati AFNOR NF T sviluppati secondo lo standard ISO/TS Test di sierotipizzazione di Legionella pneumophila con tecnica Real-Time PCR Terreni di coltura e Latex di conferma, secondo le norme ISO e ISO
4 La ricerca di Legionella si può effettuare con metodo colturale e/o con metodo Real-Time PCR (qpcr). L anello di giunzione tra questi due approcci è rappresentato dall utilizzo della PCR per la conferma e la sierotipizzazione delle colonie isolate su piastra Preparazione del campione Isolamento su terreno selettivo (GVPC) Conferma Legionella spp. su terreno selettivo (BCYE) Conferma e sierotipizzazione di L.pneumophila su Latex Conferma e sierotipizzazione di L. pneumophila SG1 SG2-16 con Colony Real-Time PCR Generon PATHfinder Preparazione del campione Estrazione del DNA con Kit Bio-Rad Aquadien Ricerca del DNA di Legionella spp. o L. pneumophila e loro eventuale quantificazione con kit Real-Time PCR Bio-Rad iq-check Analisi dei dati 5
5 Metodo colturale (durata giorni) A livello internazionale sono state redatte due norme che descrivono la determinazione di Legionella in matrici ambientali: ISO :1998 Water quality- detection and enumeration of Legionella e ISO N : 2004 Water quality- detection and enumeration of Legionella Part 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts. Le matrici ambientali che vengono generalmente utilizzate per la ricerca di Legionella in campioni ambientali sono: acqua, sedimenti, biofilm. Il processo analitico è illustrato di seguito e cliccando sull icona del prodotto. si accede alla scheda completa BR CIP10-M Aerosol Sampler Campionamento Filtrazione Centrifugazione Semina Diretta Trattamento Acido Trattamento termico Selezione di Legionella: il terreno GVPC contiene BCYE (buffered charcoal yeast extract) supplementato con antibiotici per inbire la crescita della flora interferente. Incubare per 8-11 giorni (seguire linee guida ISS) a 36 C. BR GVPC/Agar, 90 mm x 20 plates Conferma di Legionella spp. : si utilizza il terreno BCYE supplementato con L-cysteina. Legionella non è in grado di crescere in assenza di L-cysteina e quindi la semina differenziale in terreno non supplementatio risulta molto utile ad ulteriore conferma. Incubare per 2 giorni (seguire linee guida ISS) a 36 C. BR BCYE Biplate/Agar, 90 mm x 20 plates BR BCYE with L-Cysteine/Agar, 90 mm x 20 plates BR BCYE without L-Cysteine/Agar, 90 mm x 20 plates Conferma di Legionella pneumophila: l ultimo step nell analisi è l identificazione delle colonie di L.pneumophila e la loro serotipizzazione (ne esistono 16 sierogruppi dei quali il SG1 risulta essere il più virulento). Si possono utilizzare più approcci: il metodo di immuno-agglutinazione ed il metodo colony PCR. BR L. pneumophila Latex Kit, SG 1 and 2 16, 50 tests BR Legionella pneumophila and Species Latex Kit, 50 tests PMB15D-SG - PATHfinder Legionella pneumophila ID Assay PMB16A - PATHfinder Legionella Dual Assay
6 Metodo molecolare (durata 4 ore) I metodi colturali richiedono purtroppo più di 7 giorni per fornire risultati. Una soluzione rapida è offerta dall utilizzo della tecnica Real-Time PCR (qpcr). La prima norma relativa all uso di questa metodologia è stata elaborata dall Association Française de Normalisation (AFNOR) che ha sviluppato uno standard (NF T90-471, 2010). Recentemente è stata pubblicata la norma ISO Water quality- Detection and quantification of Legionella spp and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qpcr) (ISO/TS 12869, 2012) che aggiorna e specifica i requisiti metodologici, di valutazione e controllo di qualità del metodo qpcr applicato a Legionella. Il processo analitico è illustrato di seguito e cliccando sull icona prodotto. si accede alla scheda completa del BR CIP10-M Aerosol Sampler Campionamento Estrazione e purificazione del DNA con il kit Aquadien di Bio-Rad BR Aquadien Kit, 96 tests
7 Amplificazione del DNA di Legionella: dopo aver estratto il DNA dei batteri contenuti nel campione è possibile procedere in più direzioni, utilizzando i kit Bio- Rad validati AFNOR secondo la norma NF T e lo standard ISO/TS I kit Bio-Rad iq-check Screen determinano la presenza/assenza di Legionella; i kit iq- Check Quanti ne determinano la concentrazione in unità genomiche grazie agli opportuni standard presenti nel kit. BR iq-check Screen Legionella spp. Kit, 96 tests BR iq-check Screen L. pneumophila Kit, 96 tests BR iq-check Quanti Legionella spp. Kit, 96 tests BR iq-check Quanti L. pneumophila Kit, 96 tests Amplificazione del DNA di Legionella pneumophila SG1: in caso di positività alla L. pneumophila è ora anche possibile determinare la presenza di batteri del sierogruppo-1 utilizzando il kit PATHfinder validato nel laboratorio ricerca Generon sulla base di pubblicazioni scientifiche. In analogia ai kit Bio-Rad lo standard DIGIcount consente di procedere alla quantificazione in unità genomiche. PMB15D-SG1 - PATHfinder Legionella pneumophila Serogroup 1 Assay PMB15R - PATHfinder Legionella pneumophila Serogroup 1 DigiCount
8 Rev.1_ International contacts Mr. Nicola Bortoletto Mobile Mr. Enrico Arletti Mobile Mrs. Caterina Novi Mobile Mrs. Laura De Grandis Mobile Generon S.p.A. Stradello Aggazzotti,104 Modena marketing@generon.it
9 Rev.1_220416
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