Misura della concentrazione intracellulare di ioni calcio con tecniche di video-imaging

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1 Misura della concentrazione intracellulare di ioni calcio con tecniche di video-imaging

2 Variazioni del rapporto di fluorescenza di Fura-2 in miociti di topo FURA-2 RATIO (340/380) s

3 Ione Calcio Lo ione Calcio è il catione più abbondante nel corpo umano La concentrazione intracellulare di Calcio è bassa ( nm) rispetto a quella extracellulare (2-2.5 mm) anche perchè è localizzato in compartimenti specifici (Reticolo endoplasmico, sarcoplasmico, apparato di Golgi ecc.) La concentrazione citosolica di calcio è strettamente controllata da complesse interazioni tra transportatori, pompe, canali Molti studi hanno dimostrato che il Calcio è il più comune secondo messagero delle cellule eucariotiche La mobilizzazione del Calcio tra i vari compartimenti intracellulari è critica non solo per le risposte fisiologiche ma anche per quelle patologiche

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5 Il calcio è un secondo messaggero intracellulare

6 Malattie causate da alterazioni dei flussi di ioni calcio Rosario Rizzuto & Tullio Pozzan Nature Genetics 34, (2003)

7 La fluorescenza èil risultato di un processo a tre stadi che avviene in alcune molecole (generalmente poliaromaticheo eterocicliche) chiamate fluorofori Stadio 1: eccitazione Stadio 2 : stato eccitato Stadio 3: emissione di fluorescenza

8 Misure di Fluorescenza: Gli elementi essenziali sono: 1)sorgente di eccitazione; 2) fluoroforo; 3) sorgente per luce di eccitazione; 4) detector; 5) software e computer

9 Strumenti dedicati all analisi in fluorescenza: 1- spettrofluorimetri che misurano la fluorescenza media in cuvette; 2 - citometria flusso che misurano la fluorescenza in ogni singola cellula che fluisce

10 Strumenti dedicati all analisi in fluorescenza: 3 - microscopi a fluorescenza che risolvono la fluorescenza in funzione di coordinate spaziali; normale invertito

11 Nel microscopio convenzionale la luce arriva al preparato da sotto, lo attraversa e, passando attraverso le lenti, genera l'immagine dell'oggetto. Nel microscopio ad epifluorescenza il preparato è illuminato da sopra (o da sotto in un microscopio invertito) da un fascio di luce che, deviato da un apposito specchio dicroico, attaversa l'obiettivo. Un filtro interposto tra la sorgente di luce ed il sistema ottico provvede a selezionare la lunghezza d'onda opportuna (ultravioletto) per eccitare la fluorescenza del preparato. Questa è di lunghezza d'onda superiore a quella della luce di eccitazione; attraversa lo specchio dicroico senza esserne deviata e può raggiungere l'oculare per generare l'immagine. Un filtro di emissione seleziona solo la lunghezza d'onda desiderata che arriverà al rivelatore (telecamera, macchina fotografica, occhio dell'osservatore).

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13 Strumenti dedicati all analisi in fluorescenza: 3 - microscopi a fluorescenza che risolvono la fluorescenza in funzione di coordinate spaziali;

14 Set-up per video-imaging telecamera microscopio Monocromatore e sorgente Computer e software Axon Workbench 2.2

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17 [Ca 2+ ] i =K d [(R-R min )/(R max -R)]β unità di fluorescenza >38 µm Ca 2+ 0 mm Ca 2+ R = min R = max λ (eccitazione)

18 340 (nm) 380 (nm) nm 340 nm tempo (s) 380 nm tempo (s) Fura-2 ratio F 340 nm F 380 nm Ratio ratio tempo (s)

19 Variazioni del rapporto di fluorescenza di Fura-2 in miociti di topo FURA-2 RATIO (340/380) s

20 Inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors mobilize calcium from a common functional pool in human U373 MG cells Maria Galiano, Giuseppe Gasparre, Claudio Lippe, Giuseppe Cassano Department of General and Environmental Physiology, University of Bari, Via Amendola 165/A, Bari, Italy Received 8 January 2004; received in revised form 11 February 2004; accepted 19 February 2004 Fig. 2. Ca2+ response induced by ryanodine in U373 MG cells, in the presence (a) or absence (b) of 1.8mM Ca2+ in the extracellular medium. Ca2+-free medium obtained by replacing 1.8mM CaCl2 with NaCl, and adding 0.5mM EGTA. Mean values±s.e.m. calculated from recordings of 26 and 17 cells (lines a and b, respectively) and representative of eight experiments (101 and 99 cells, respectively).