C.d.L. Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche Corso di Microbiologia e Biotecnologie dei Microrganismi

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1 C.d.L. Scienze Biosanitarie e Farmaceutiche Corso di Microbiologia e Biotecnologie dei Microrganismi AA Nutrizione microbica 1 08 BSF 1

2 Fattori di crescita I microrganismi si riproducono quando hanno a disposizione minerali, energia, carbonio, azoto, fosforo e zolfo In genere i microorganismi a partire da questi elementi sono in grado di risolvere tutte le loro esigenze nutrizionali Molto spesso mancando di uno o più enzimi hanno bisogno di assorbire dall esterno alcuni elementi necessari (enzimi) o i loro precursori. Questi elementi si definiscono fattori di crescita : aminoacidi (biosintesi delle proteine), purine e pirimidine (DNA), vitamine (sintesi). 08 BSF 2

3 Macroelementi I macroelementi : sono elementi chimici di cui i batteri hanno bisogno in grandi quantità. Carbonio, Ossigeno, Idrogeno, Azoto, Zolfo, Fosforo. Tutti questi elementi entrano nella sintesi di proteine e lipidi. Altri quattro elementi sono essenziali : Calcio (spora), Potassio (enzimi), Magnesio (ribosomi e membrane cellulari), Ferro (enzimi). 08 BSF 3

4 Micronutrienti Manganese, Zinco, Cobalto, nickel, rame. Elementi che possono essere presenti anche in quantità infinitesimali, (tracce). Si tratta di elementi che si possono trovare anche nei comuni terreni di coltura. 08 BSF 4

5 Fonti di carbonio energia ed e - Carbonio Autrofi: la CO 2 è l unica fonte di carbonio per la biosintesi. Eterotrofi: Molecole organiche ridotte derivanti da altri organismi. Energia Fototrofi : luce Chemiotrofi : ossidazione di composti organici o inorganici Elettroni: Litotrofi : molecole inorganiche ridotte. Energia e : molecole organiche metabolismo Organotrofi: molecole organiche 08 BSF 5

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7 Azoto, Fosforo, Zolfo L azoto è importante per la sintesi di proteine e carboidrati, purine e pirimidine tutti costituenti la cellula batterica. Molti microorganismi utilizzando direttamente l ammoniaca per ricavare azoto, una vasta gamma di organismi riducono l azoto atmosferico. Il fosforo è presente negli acidi nucleici nei nucleotidi, in vari cofattori e proteine. Il fosfato inorganico è la fonte di fosforo, in molti ambienti acquatici la sua mancanza rappresenta un fattore limitante la crescita. Lo zolfo è importante per la sintesi di alcune sostanze quali metionina e cisteina, carboidrati come biotina e tiamina, come fonte viene usato il solfato. 08 BSF 7

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9 Assunzione dei nutrienti Diffusione passiva o diffusione: (glicerolo): processo in cui le molecole si spostano da una regione ad alta concentrazione ad una con bassa concentrazione per effetto dell agitazione termica. Diffusione facilitata : diffusione che avviene in presenza di particolari proteine (carrier) chiamate anche permeasi incluse nella membrana citoplasmatica. La velocità di diffusione in questo caso aumenta. Le proteine di trasporto sono in questo caso simili agli enzimi, ogni carrier trasporta solo una ben determinata tipologia di sostanza. Non richiede alcuna tipologia di energia metabolica. Trasporto attivo : meccanismo che permette il movimento contro gradiente di concentrazione, cioè in direzione di concentrazioni più alte. Differisce dalla diffusione facilitata in quanto utilizza energia metabolica per il trasporto delle sostanze all interno della cellula. 08 BSF 9

10 Assunzione di sostanze dall ambiente esterno Il primo passo per l assimilazione dei nutrienti è il loro assorbimento da parte della cellula microbica. I meccanismi devono essere specifici, devono essere assorbite le sostanze necessarie e non altre. Devono essere in grado di trasportare il nutriente al proprio interno quindi contro gradiente di concentrazione. Le molecole di nutrienti devono esser in grado di passare la membrana citoplasmatica che notoriamente è di tipo selettivo. 08 BSF 10

11 Coltivazione dei batteri Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare nelle condizioni di laboratorio. Per questo scopo si devono conoscere quali sostanze nutritizie e quali condizioni fisiche essi richiedono. Tali informazioni hanno consentito di sviluppare numerosi terreni o mezzi per la loro coltura. 08 BSF 11

12 Preparazione dei terreni colturali Dissoluzione degli ingredienti in volume di H 2 O. Determinazione del ph ed eventuale correzione. Distribuzione in contenitori idonei. Sterilizzazione. 08 BSF 12

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14 Terreni impiegati per la coltivazione dei microrganismi in laboratorio Stato fisico: liquido; semisolido (+Agar 0,5%); solido (+Agar 2%). 08 BSF 14

15 Terreni impiegati per la coltivazione dei microrganismi in laboratorio L agar è un polimero composto principalmente di D - galattosio, lo si ottiene di solito dalle alghe rosse è un ottimo agente solidificante perché dopo essere stato sciolto in acqua bollente può raffreddare a 42 C, C, prima di di solidificare e poi liquefa a C. Non può essere degradato dai microrganismi non ha caratteristiche di nutriente. Un terreno liquido può essere reso solido mediante l aggiunta di agar 1-2 % il più delle volte 1,5%. 08 BSF 15

16 Terreni impiegati per la coltivazione dei microrganismi in laboratorio Terreni chimicamente definiti (terreni di cui è nota la quantità di ogni singolo componente, spesso a scopo di ricerca è necessario conoscere quello che i batteri metabolizzano). Terreni complessi (si ignora la loro composizione clinica, utili poiché le necessità di un batterio sono sconosciute è quindi impossibile preparare un terreno definito). 08 BSF 16

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19 Terreni usati in batteriologia 1. Terreni arricchiti: sono aggiunti di altre sostanze come sangue, siero ed emoglobina al fine di favorire la crescita di batteri eterotrofi esigenti. Brodo selenite per isolare salmonelle e shigelle da campioni di feci. 2. Terreni selettivi: terreni arricchiti con Sali biliari o coloranti come fucsina basica favoriscono la crescita dei gram negativi sfavorendo i gram postivi. Agar Endo, EMB (agar all eosina e Blu di metilene) e l agar Mac Conkey che contengono coloranti che inibiscono la crescita dei Gram + mentre MSA inibisce la crescita di batteri diversi dagli stafilococchi). Anche il terreno Sabouraud può essere considerato un terreno selettivo per il ph e il contenuto in zuccheri. 3. Terreni differenziali: mettono in evidenza la presenza di particolari generi batterici sfruttando un colorante e il lattosio che fermentando abbassa il ph provocando il viraggio del colorante, la colonia diviene rossa, i gram negativi gastro intestinali patogeni non fermentano il lattosio e vengono identificati facilmente. L agar sangue evidenzia batteri in grado di produrre una lisi dei globuli rossi con diverse forme di emolisi. (Beta emolisi, alfa emolisi, gamma emolisi). 4. Terreni di saggio (ad esempio per antibiotici, disinfettanti). 08 BSF 19

20 Terreni di coltura Terreni di trasporto Conservazione temporanea del microrganismo, non contiene metaboliti essenziali al metabolismo microbiale. Terreni ricchi Terreni di arricchimento Terreni selettivi Contengono un fattore che favorisce selettivamente la crescita di un particolare microrganismo come ad es. il brodo-selenite che favorisce la crescita dei gram negativi. Contengono particolari fattori di crescita che permettono la replicazione della maggior parte dei batteri di interesse medico compresi i patogeni più esigenti, agar sangue agar cioccolato. Terreni solidi che contengono sostanze capaci di inibire la crescita di alcuni generi batterici consentendo la più crescita di altri. EMB, MSA, Sabouraud. Terreni differenziali Contengono sostanze che consentono di sfruttare il diverso aspetto delle colonie distinguendo tra specie di microrganismi differenti. Per i batteri gram negativi Agar Mac Conkey. (diventa rosso al di sotto di ph 6,8). Lattosio positivi di colore rosso. 08 BSF 20

21 Terreni di coltura complessi Non è nota l esatta percentuale dei singoli ingredienti presenti Brodo nutritivo : TSB (Triptic soy broth) Agar nutritivo: TSA (Triptic soy agar) Agar sangue Agar cioccolato Agar Mac Conkey 08 BSF 21

22 Colture pure e caratteri colturali I batteri o gli altri microrganismi, quando crescono su un terreno di laboratorio, sono chiamati coltura. Per coltura pura si intende una coltura costituita da una popolazione di cellule derivate tutte da un unica cellula madre. Essa rappresenta una condizione artificiale per l accrescimento dei batteri ed è una condizione imposta da manipolazioni di laboratorio. Coltura mista: la popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti specie microbiche abitano normalmente varie parti del nostro corpo (orale, intestinale, cutanea) ed in modo analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua). 08 BSF 22

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24 Caratteristiche colturali Il modo in cui le colonie batteriche si sviluppano sulla superficie dell agar è importante nella identificazione dei batteri sia per la dimensione che per l aspetto. Un corretto piastraggio di una popolazione mista può portare al riconoscimento e all identificazione di una specie batterica. In natura i batteri crescono sulle superfici in forma di biofilm ma a volte formano colonie distinte, di norma la crescita batterica è rapida ai margini della colonia e molto più lenta al centro. In alcune colonie la porzione centrale va incontro ad autolisi, ai margini infatti ossigeno e nutrienti sono abbondanti rispetto al centro. 08 BSF 24

25 Variazioni rilevabili a occhio nudo nella morfologia delle colonie, forma e andamento generale del suo margine vengono rilevati osservando la colonia dall alto, lo spessore si rileva osservando la colonia di lato, tenendo la piastra all altezza degli occhi. 08 BSF 25

26 FATTORI AMBIENTALI classificazione e range di tolleranza Temperatura Psicrofili 7 20 C optimum 18 C Mesofili C optimum 37 C Termofili > 40 C 90 C optimum diversificato Ossigeno Aerobi Anaerobi Anaerobi facoltativi Microaerofili ph Terreno colturale per batteri a concentrazione idrogenionica 7 Batteri optimum di sviluppo 6,5 7,5 Lieviti e muffe optimum di sviluppo 4,5 6,5 08 BSF 26

27 Ossigeno Aerobi obbligati stretti Necessitano ossigeno (colture con agitazione e aria, es. M. tubercolosis) Anaerobi obbligati stretti L ossigeno è tossico ( bacteroides intestinali,clostridium ed altri,) Anaerobi facoltativi (germi di interesse medico in flora intestinale, metabolismo sia ossidativo che fermentativo: Vibrio, Escherichia, Klebsiella, Salmonella) Microaerofili (Bassa tensione di ossigeno: < 20%, per sviluppo ottimale streptococchi e lactobacilli) 08 BSF 27

28 Fattori ambientali Grado di umidità (presenza di acqua libera) L acqua rappresenta un elemento indispensabile per la crescita dei microrganismi. In essa avvengono le reazioni biochimiche essenziali al loro metabolismo. I normali terreni solidi di coltura contengono acqua (1-2%) Le sostanze disciolte in acqua determinano la pressione osmotica Un aumento di pressione osmotica dovuto alla concentrazione salina o degli zuccheri determina una stasi della crescita microbica. I batteri hanno meccanismi di protezione contro gli choc osmotici. Microrganismi osmofili in grado di sopravvivere in particolari condizioni di pressione osmotica (lieviti in presenza di elevate concentrazioni di zucchero) Microrganismi alofili in grado di vivere in presenza di elevate concentrazioni saline (stafilococchi) 08 BSF 28

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