ANALISI MOLECOLARE DEL GENOMA

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1 ANALISI MOLECOLARE DEL GENOMA

2 Come sono disposti i geni nel genoma? MAPPA GENETICA: un set ordinato di geni sul cromosoma, la distanza tra i quali è espressa in unità di ricombinazione genetica (centimorgan) MAPPA FISICA: un set ordinato di frammenti di DNA sul cromosoma, la distanza tra i quali è espressa in unità fisiche (paia di basi).

3 Costruzione di una mappa genetica analisi delle frequenze di ricombinazione Le tecniche che utilizziamo per costruire una mappa genetica umana si basano tutte sull associazione genetica: mappe genetiche = mappe di associazione Uso di marcatori molecolari. Locus genico marcatore

4 MARCATORE GENETICO Qualsiasi carattere polimorfico mendeliano (presenti in due forme alleliche) che può essere impiegato per seguire l ereditarietà di un segmento cromosomico attraverso un albero genealogico NB: I geni sono marcatori utili ma non sono i marcatori ideali: - solo una frazione dei geni è presente con due forme alleliche distinguibili in modo semplice (fenotipi) - i geni sono spaziati da vaste interruzioni Es. di marcatori molecolari sono RFLP, STR, VNTR, SNP

5 POLIMORFISMO I polimorfismi genetici sono variazioni nelle sequenze di DNA presenti in una popolazione con una frequenza maggiore dell 1%. Quando la frequenza e' inferiore a tale valore arbitrario, si preferisce parlare di varianti genetiche rare, che in molti loci sono presenti in aggiunta ai polimorfismi. Quando l allele più comune in tutta la popolazione rappresenta: meno del 99% POLIMORFISMO più del 99% MUTAZIONE

6 Polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) Polimorfismi di lunghezza di sequenze semplici (SSLP, Simple Sequence Length Polymorphism) Polimorfismi di singoli nucleotidi (SNP, Single Nucleotide Polymorphism)

7 SNP Polimorfismi di singoli nucleotidi Singole mutazioni puntiformi presenti in gran numero nel genoma. Solo alcune producono RFLP Nel genoma umano sono stati identificati oltre 10 milioni di SNP Ogni SNP ha solo 2 alleli proprio perché originato da mutazione puntiforme Vantaggi degli SNP come marcatori: sono abbondanti e possono essere individuati con tecniche che non utilizzano elettroforesi

8 Analisi di singoli SNP mediante ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici (ASO) Ibridazione di un oligonucleotide: Tm = (4 x GC) + (2 x AT)

9 NB: affinchè una variazione nella sequenza nucleotidica sia considerata uno SNP, deve essere presente in almeno l 1% l della popolazione!

10 SNP: modificazione di siti di restrizione RFLP

11 RFLP: Polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione Sono stati i primi marcatori molecolari ad essere studiati 1) Presenza o assenza di un sito di restrizione in due sequenze alleliche (causata da SNP) A1 A RFLP nel genoma umano - ovviamente solo 2 alleli per RFLP (c è o non c è il sito) 2) Generazione di frammenti di diversa lunghezza (dovuta a presenza di sequenze ripetute, inserzioni o delezioni) A1 A2

12 Tecniche per identificare RFLP: 1) Southern Blotting 2) PCR + digestione con enzima di restrizione

13 1) Southern Blotting A1 sonda A2 2) PCR A1 A2 Primer 1 Primer 1 Primer 2 Primer 2 Primer 2

14 NB: la posizione di un RFLP sulla mappa genomica è dedotta seguendo l ereditarietà dei suoi alleli, come per i geni. A1 A1 A2 A2 A1A1 A2A2 A1A2 A1A2 A1A2 A2A2 A1A2 A1A1

15 SSLP: Polimorfismi di lunghezza di sequenze semplici Sequenze ripetute che contengono quantità diverse di unità ripetitive nei differenti alleli e quindi mostrano lunghezze diverse Possono essere multiallelici (per ogni SSLP più di due varianti alleliche) Ci sono due tipi di SSLP: -i mini-satelliti satelliti= ripetizioni a tandem a numero variabile (VNTR) Le unità ripetitive sono lunghe nucleotidi e coprono sequenze di 1-5 kb -i micro-satelliti satelliti= ripetizioni a tandem semplici (STR) Le unità ripetitive sono di di- o tetra-nucleotidi

16 STR (Short Tandem repeats) regioni ipervariabili del DNA costituite da sequenze di nucleotidi ripetute in tandem 2 varianti alleliche Nel genoma umano: STR dinucleotidici 8740 STR trinucleotidici STR tetranucleotidici 4300 STR pentanucleotidici 230 STR esanucleotidici Sequenze relativamente corte rilevabili per PCR

17 VNTR (Variable( Number Tandem Repeats) Sequenze anche molto lunghe rilevabili per Southern Blot: - sonde a locus singolo (un solo locus VNTR nel genoma) - sonde multiloci (molte copie di un locus VNTR disperse nel genoma)

18 Un taglio nei siti di restrizione fiancheggianti la ripetizione produce un unico frammento, di lunghezza specifica per ogni allele

19 Uso di un VNTR come marcatore del DNA eterozigote omozigote Southern Blotting

20 Confronta! Multi-loci Singolo locus Da frammenti di restrizione o da amplificato per PCR

21 I polimorfismi sono allelici e vengono ereditati in modo mendeliano 6 alleli (A1 A6) sono presenti in questo albero genealogico, ma ogni individuo può avere un solo tipo di allele (se omozigote) o due (se eterozigote).

22 RFLP associati a malattie genetiche: - all interno del gene alterazione del sito per DdeI nel gene per la β-globina (anemia falciforme) - in sequenze fiancheggianti alterazione del sito HpaI nel gene per la fenilalanina idrossilasi (fenilchetonuria)* - DNA ripetuto (triplette) all interno del gene (Corea di Huntington) o in sequenze regolative (sindrome dell X-fragile fragile) * Il polimorfismo RFLP al 3 del gene segrega con il gene stesso (tranne nel caso di ricombinazione o mutazione de novo)

23 Confronta e rifletti A1 gene A1 gene A2 gene A2 gene Es. Anemia falciforme A1 gene A1 gene A2 gene A2 gene Es. Corea di Huntigton

24 Costruzione di una mappa genetica utilizzando i marcatori molecolari

25 Uso dei polimorfismi di restrizione (RFLP) per determinare le associazioni RFLP A, B, C (aplotipi( aplotipi)

26 Es. associazione RFLP e Corea di Huntington

27 Es. Corea di Huntington, autosomica dominante ipotetici pedigree RFLP A, B, C (aplotipi( aplotipi) H allele mutato dominante h allele normale recessivo (a) Il gene responsabile della malattia e gli alleli RFLP non sono strettamente associati (b) Il gene responsabile della malattia e gli alleli RFLP sono strettamente associati (il figlio che eredita l allele RFLP C, è malato)

28 DNA tagliato con HindIII, sonda utilizzata specifica per il chr.8 il gene H mappa sul chr.8

29 Uso dei polimorfismi del DNA per l analisi l genetica: Posizionamento geni-malattia Test molecolari per mutazioni associate a malattie genetiche (es. Corea di Huntington e anemia falciforme) Tipizzazione del DNA DNA fingerprinting

30 Tipizzazione del DNA (DNA (DNA fingerprinting)

31 In passato, i sistemi più utilizzati in ambito forense sono stati: i polimorfismi degli antigeni eritrocitari dei sistemi AB0, MN, Rh, Duffy, etc i polimorfismi degli antigeni leucocitari del sistema HLA altri Oggi: SNP STR VNTR RFLP polimorfismi del cromosoma Y polimorfismi del DNA mitocondriale

32 STR (microsatelliti( microsatelliti): analisi di un singolo locus E stato stimato che l analisi di 13 loci STR sono sufficienti ad identificare univocamente una persona su tutta la popolazione mondiale VNTR (minisatelliti): analisi di un singolo locus o multi-loci loci Polimorfismi sul cromosoma Y utili per le esclusioni di paternità (trasmissione patrilineare e assenza di ricombinazione) e per distinguere numero di soggetti maschili coinvolti in un crimine Polimorfismi del DNA mitocondriale utili per individuazione di parentele (trasmissione matrilineare ma alta eterogeneità)

33 Per attribuzione di paternità à.

34 Mediante Southern Blotting. Interpretazione di inclusione! Sonda STR Sonda o STR VNTR o VNTR

35 Per la prova di paternità occorre: - usare altre sonde polimorfiche (almeno 5 diverse e combinate) - analizzare la frequenza di quel polimorfismi nello specifico gruppo etnico

36 M B P 1 P 2 Un caso di attribuzione di paternità Sonda multi-loci loci

37

38 Se il profilo genetico del figlio e del padre presunto differiscono per due o più caratteristiche genetiche l'esclusione è certa (0% di probabilità di essere il padre biologico). Nel caso di un attibuzione di paternità viene effettuata un analisi statistica dei risultati (percentuale di attribuzione tanto più prossima al 100% quanto maggiore sarà il numero di regioni del DNA analizzate) NB: L'esame di 15 regioni STR generalmente consente di raggiungere una percentuale di attribuzione (probabilità di paternità) superiore al 99,99%*. Questo valore probabilistico indica che il padre presunto è praticamente il padre biologico. *La probabilità finale di paternità non potrà mai raggiungere il valore del 100% matematico, dato che i microsatelliti hanno una frequenza relativamente elevata di mutazioni (in media ogni meiosi).

39 In medicina forense identificazione del colpevole di un crimine

40 Il caso in cui il DNA scagiona un innocente Charles Chatman - accusato di reato sessuale nel 1981; il test del DNA ha rivelato la sua innocenza dopo 27 anni di carcere.

41 Mediante Southern Blotting vittima campione sospetti 1 2 3

42 e mediante PCR.