Polimorfismi e la variazione genetica

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1 Polimorfismi e la variazione genetica Variazione individuale nel DNA (con frequenza 1% nella popolazione) SNP (single nucleotide polymorphism)è definito come una variazione a livello di un singolo paio di basi (mutazione puntiforme). Avvenuto generalmente solo una volta nell evoluzione, indica discendenza comune. La variazione del DNA in diversi individui è di ca SNP - ogni nucleotidi in regioni codificanti - ogni nucleotidi in regioni non-codificanti - ~ 60,000 mutazioni non-sinonime/indiv. ( variabilità) Altri tipi di polimorfismi comprendono variazioni nel numero di copie di un gene, inserzioni o delezioni, variazioni nel numero di sequenze ripetute Variabilità strutturale del cromosoma - odine in sequenza di geni (inversioni) - delezione o duplicazione di geni - inserzione di geni - Nel genoma umano ci sono migliaia di Copy number variations (CNV) variazione nel numero di copie dello stesso gene.

2 Polimorfismi e la variazione genetica Un elevato numero di polimorfismi può avvenire a livello di singoli geni - 60,000 SNP nel genoma umano rappresentano mutazioni non-sinonime a livello di geni - corrispondono a 2/3 mutazioni per gene - possono avvenire a livello di sequenze codificanti e/o non codificanti, avendo un effetto: 1) sul livello di trascrizione (es. se nel promotore o nei 5 - o 3 -UTR) 2) sulla funzionalità del prodotto del gene (es. a livello degli esoni alleli diversi variabilità fenotipica) Tipi di variazione genetica 1) SNP = mutazioni puntiformi; 2) CNV = variazione nel numero di copie di un gene, di un blocco di geni o di sequenze satellite; 3) Indel = inserzioni/delezioni di nucleotidi; 4) Satelliti = noncoding tandem sequence repeats

3 Come si formano i polimorfismi? L evento iniziale è una mutazione ma cosa li mantiene e fissa in una popolazione? - Effetto del fondatore: se una popolazione parte con pochi individui (collo di bottiglia o isolamento geografico) un allele particolare presente in un individuo può essere rappresentato in molti sui discendenti. - Deriva genetica: Un allele può aumentare o diminuire la sua frequenza in una popolazione per casualità (random genetic drift). L effetto è particolarmente forte in popolazioni limitate (<100 indiv.) e quando l allele è fenotipicamente neutro (collo di bottiglia o isolamento geografico) - Selezione naturale: > per i CNV copie espressione può essere benefico > Polimorfismo bilanciato - 1 allele sano + 1 allele difettoso gli eterozigoti sono più resistenti a malattie infettivie (es. malaria, dissenteria) degli omozigoti sani. Gli omozigoti difettosi hanno malattia genetica (es. anemia falciforme, fibbrosi cistica). [anche prioni] - Selezione sessuale: - favorisce tratti che aumentano la probabilità di riprodursi - effetti di consanguinità - la selezione naturale può favorire eterozogoti se la selezione sessuale e la selezione naturale favoriscono effetti opposti (porta a polimorfismo bilanciato in eterozigoti)

4 Tipi di polimorfismi Types of SNPs (NB SNPs are the most common form of polymorphism, >90%) Intragenic region - contributes to variation between individuals (forensically useful) Non-coding region - promoter, enhancer - can affect expression intronic - can affect splicing (add/remove splicing site) UTR - can affect transcription and/or translation Coding region Synonymous CCG CCA - has no phenotypic effect (silent mutation) (most common in Pro Pro coding regions) Nonsynonymous CCG CAG Pro - Missense Gln - can alter function TTA - Nonsense TGA Leu Stop - (& vice-versa) normally severely alters function Types of Indels Insertion (not multiple of 3N ) - if in coding region can result in reading frame-shift (multiple of 3N) - insertion of AA residues Deletion (not multiple of 3N ) - if in coding region can result in reading frame-shift (multiple of 3N) - deletion of AA residues Types of Satellites (Variable number of tandem repeats, VNTR, and short tandem repeats, STR) Microsatellite (STR) - one, two, or three base sequence repeated in tandem times Minisatellite (VNTR) - tandem repeats of bp, long sequences (telomeres) Types of CNVs Gene duplications Large deletions - can affect expression - gene knockout

5 Equilibrio, disequilibrio, genotipi e aplotipi SNP multipli in un gene o in una zona di un cromosoma possono essere presenti indipendentemente uno dall altro, o la loro può esserci una presenza correlata. Per esempio, nel gene della interleuchina 10 ci sono tre possibili polimorfismi nella regione del promotore. Se questi SNP non sono correlati ed ugualmente probabili, ci dovrebbero essere 8 possibili alleli : (n1 x n2 x n3) dove n i = N alleli in posiz i. In questo caso sono in equilibrio. Se invece lo SNP in una posizione è statisticamente correlato con la presenza di uno SNP in un altra posizione, si dice che sono in disequilibrio (linkage disequilibrium) Questo è il caso per IL-10, poiché solo 4 varianti sono osservate: C-819 è in «linkage disequilibrium» con C-592 e T-819 con A-592, mentre g/a sono in equilibrio. In un organismo diploide, possono essere presenti in maniera omo o eterozigota. Il possibile numero di genotipi per allele è infatti k(k+1)/2, dove k è il numero di alleli. Varianti alleliche ereditate in blocco sono note come aplotipi. È molto più probabile che SNP vicini l uno all altro siano «aplotipici».

6 Utilizzo dei polimorfismi Indipendentemente dal loro ruolo biologico i polimorfismi del DNA sono di utilità fondamentale come MARCATORI GENETICI per: - La mappatura del genoma (mappatura fisica) - La medicina forensica - Diagnosi cliniche (genetiche / prenatali) - Studio dell evoluzione delle popolazioni l analisi del polimorfismo genotipico comprende: - Polimorfismi di sequenza di DNA single nucleotide polymorphism (SNP) genera restriction fragment length polymorphism (RFLP) - Polimorfismi di ripetizione di sequenze di DNA variable number of tandem repeats (VNTR) e short tandem repeats (STR)

7 Restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) - Frammentare DNA con ER - Denaturazione e separazione frammenti in PAGE - Blotting su nitrocellulosa (Southern) - Identificazione con oligonucleotidi complementari marcati complementari a sequenze VNTR Svantaggi laboriosa, richiede molto campione, ER, sonde oligo marcate, reazioni di frammentazione, elettroforesi, blotting, ibridizzazione, lavaggi e poi autoradiografia PCR analysis of STR - Usa il fatto che ormai i loci e le sequenze confinanti a molti STR sono noti. - E possibile quindi usare primer specifici per amplificare quelle regioni con PCR. - I segmenti sono poi separati con El. capillare

8 Determinazione di SNP mediante PCR: metodo TaqMan (low throughput)

9 metodo primer extension (low throughput) - Analizza SNP in sequenze NOTE - Si progetta un primer che termina al sito polimorfico - Si aggiunge la polimerasi e dntp - Se l ultima base del primer corrisponde al nucleotide complementare nel DNA analizzato, il filamento si estende, se è presente una mutazione (SNP), non si estende - Si provano primer che terminano con le altre te basi per identificare la mutazione (quello con la base che corrisponde allo SNP permette l estenzione).

10 metodo primer extension Snapshot (low throughput) + + G A C G T template primer PCR

11 Determinazione di SNP mediante PCR: metodo SNaPshot (cont.) thermocycler T C sequencer Normal sequencing run

12 Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP 1) effetto di SNP Se un SNP inn un segment di DNA genomico introduce o elimina un sito di restrizione altera la lunghezza dei frammenti di restrizione generato utilizzando l endo_ nuclease di restrizione specifica per quell sito. Questo permette la genotipizzazione usando Southern blot o PCR, ed è la base per il DNA fingerprinting nella medicina forenzica RFLP

13 Restriction Fragment Length Polymorphism 2) effetto di repetizioni variabili (es. STR) STR STR Southern blot Enzima di restrizione Individuo ripetizioni Individuo 2 Individuo 3 Individuo 4

14 16 plex Restriction Fragment Length Polymorphism (3) PCR detection I primer sono specifici per il Analisi di Short Tandem Repeats (STR) Numero e sito di loci codificato in precisi protocolli selettivamente amplificati con primer PCR specifici per ogni locus e diversamente colorati I frammenti generati sono separati con gel capillari (si può utilizzare un sequenziatore di 1 gen.) Si includono primer per il gene dell amelogenina (diverse dimensioni nei cromosomi X e Y) che rivela il sesso del donatore Banca dati CODIS (USA) si basa su 13 loci > 7 milioni di genotipi STR Analisi su 16 loci

15 using repetition polymorphism for fingerprinting Chi è il padre? qual è il figlio di 1 matrimonio? il figlio 2 È l individuo 2