Modelli di regolazione semplici

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1 Modelli di regolazione semplici Regolazione negativa Regolazione positiva Feedback positivo Feedback negativo

2 Circuiti genetici oscillanti

3 Circuiti genetici complessi Aumento del numero dei componenti A B D H Interconnessione tra circuiti G E F C

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5 Caulobacter crescentus C. crescentus presenta tre forme cellulari distinte durante il suo normale ciclo cellulare: Cellule motili e flagellate, swarmer Cellule con stelo, stalk, sessili Cellule predivisionali, con flagello e stalk

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7 Il processo cellulare di differenziamento risponde alla modulazione temporale di tre regolatori principali: CtrA, DnaA, GcrA Questi sono organizzati in un circuito di regolazione complesso

8 Il processo cellulare di differenziamento risponde alla modulazione temporale di tre regolatori lt principali: i DnaA, GcrA, CtrA

9 CtrA E di un regolatore trascrizionale che appartiene alla famiglia dei response regulator fosforilati da uno o più sensori (PleD, DivK e CckA). É il regolatore della forma flagellata. Questa proteina quando è presente e fosforilata è in grado di regolare l espressione di 95 geni dt determinando d : L inibizione della replicazione del DNA legandosi alla regione OriC, il blocco della divisione cellulare attraverso l inibizione trascrizionale del gene ftsz, l induzione della biosintesi del flagello. Inoltre CtrA è in grado di attivare il gene ccrm, reprimere gcra ed esercitare un meccanismo di feedback negativo sul suo promotore P1 e positivo sul promotore P2 quando il DNA è metilato.

10 La sua fosforilazione è determinata da numerosi sensori. Tra questi quello più importante è CckA.

11 GcrA È il regolatore di riferimento per la cellula sessile ÈÈ indotta trascrizionalmente da DnaA Induce l espressione dei geni per la replicazione del DNA Induce l espressione di ctra sul P1 con DNA emimetilato Subisce la repressione trascrizionale da parte di CtrA Induce l espressione degli elementi responsabili del differenziamento.

12 DnaA Èl la proteina ti responsabile dell inizio i i della replicazione nei cromosomi procariotici, controlla anche l espressione di una ventina di geni. È l induttore trascrizionale i di gcraa Il promotore del gene dnaaè scarsamente funzionale quando il DNA è emimetilato, mentre trascrive ad elevati livelli quando il DNA è pienamente metilato. Il gene dnaa mostra un meccanismo di feedback negativo.

13 CcrM È Una metilasi caratteristica di Caulobacter e corrisponde funzinalmente alla metilasi dam di E. coli. E responsabile della metilazione delle sequenze GANTC nel DNA di Caulobacter. Modula l attività del promotore del gene dnaae quella dei due promotori a monte del gene ctra (P1 e P2). Mostra un meccanismo di regolazione di tipo feedback negativo.

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15 Cellula flagellata Nella cellula flagellata, a causa del predominio di CtrA abbiamo: Assenza di GcrA DNA pienamente metilato (CcrM) Elevati livelli di DnaA (che però non determina la replicazione del DNA in quanto questa è repressa da CtrA) Ne consegue che la cellula flagellata non è in grado di replicare ne di dividersi

16 Passaggio alla fase sessile Durante questa fase i pili vengono riassorbiti dalla cellula mentre il flagello viene rilasciato nell ambiente. Nel medesimo polo si ha la formazione dl del peduncolo. Nel passaggio da cellula motile a quella sessile la proteina CtrA viene totalmente degradata nel citoplasma per l'azione dalla proteasi ClpX/P indotta dalla fosforilazione del regolatore DivK. In mancanza di CtrA si ha: l espressione di GcrA il cui gene non è più represso da CtrA ma è indotto da DnaA (sintesi del peduncolo e eliminazione del flagello) si libera OriC che ora è in grado di interagire con DnaA e iniziare la replicazione del DNA si deregola l espressione di ftsze si assiste alla formazione del setto, inizia la divisione cellulare.

17 Cellula predivisionale Avvenuta la replicazione del DNA, GcrA induce l espressione di CtrA a bassi livelli tramite attivazione del P1 con DNA emimetilato. I bassi livelli di CtrA vengono immediatamente fosforilati da CckA e CtrA-P induce l espressione di CcrM. Questa metila il DNA favorendo il feedback positivo o di CtrA-P sul ls suo opromotore P2, aumenta notevolmente l espressione di CtrA istaurando le condizioni tipiche della cellula flagellata tra cui: -la trascrizione dei geni per la biosintesi del flagello - quella dei geni ftsq ed ftsa necessari per portare a termine la la divisione cellulare.

18 Divisione cellulare Alla fine del ciclo, il durante la divisione i i cellulare, la proteina CtrA viene degradata attivamente e selettivamente solo nel compartimento della cellula sessile che, quindi, inizia una nuova divisione cellulare. La proteina GcrA, che ha un emivita i molto breve, nella cellula sessile è sostenuta da un attiva sintesi, mentre in quella flagellata si degrada velocemente e non viene espressa in quanto il gene represso da CtrA

19 RIASSUMENDO..

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21 Localizzazione delle proteine PleC/D, DivJ/K

22 Regolazione polare del sistema Div/Ple

23 Synthetic Biology: Genetic Circuit Design Sulla base dello studio dei sistemi complessi di regolazione (come quelli di Caulobacter) e disponendo delle tecniche e delle conoscenze necessarie alla fine degli anni 90, Gardner et al. (2000) e Elowitz and Leibler (2000) realizzarono i primi semplici circuiti trascrizionali, un interruttore e un oscillatore. Toggles and oscillators: new genetic circuit designs Ellen M. Judd,1,2 Michael T. Laub,2 and Harley H. McAdams2*

24 Oggi si è sviluppata una vera e propria disciplina che permette di teorizzare e realizzare circuiti genetici. Questa disciplina ha mutuato il linguaggio dei circuiti digitali. Si fa riferimento in particolare ai «logic gates», blocchi logici che consistono solitamente in due input e un output. I più comuni sono:

25 I blocchi logici possono essere realizzati con : DNA binding proteins (LacI, AraC, CI, TetR, ZFP e TALEs)

26 invertasi icome Tyr recombinasi i o Ser recombinasi: i

27 o ancora basati su le proteine Cas,. CRISPR con Cas9 wt con dcas9 e un sgrna

28 in particolare la proteina Cas9 modificata (dcas9):

29 o ancora basati sull espressione di srna regolativi. Questi possono agire a livello di controllo traduzionale e, con le opportune modifiche, trascrizionale (tna).

30 UP-SCALE dei circuiti regolativi

31 Nielsen et al 2013