CfeaETH *-3. Dipl. neoplastic human muscle cells. Accepted. Inhibition of apoptosis: SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH.

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1 CfeaETH *-3 Diss ETH No Inhibition of apoptosis: a new role for paired domain transcription factors in neoplastic human muscle cells a dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the degree of Doctor of Natural Sciences Presented by Michele Beraasconi Dipl. Sci. Nat. ETH born February 13, 1968 citizen of Novazzano, TI Accepted on the recommendation of Prof. Dr. J. C. Perriard (Examiner) P.D. Dr. B. W. Schafer (Coreferent) Prof. Dr. U. Suter (Coreferent) 1997

2 VI SUMMARY Cancer is a genetic disease. Disruption of the normal genetic program that regulates growth, division and final differentiation of a cell can lead to neoplastic transformation. Chromosomal rearrangements, deletions and amplifications, together with point mutations and methylation pattern changes are among the genetic and epigenetic changes that have been associated with human tumors. How these changes are associated with neoplastic transformation or tumor progression have been object of intensive investigations over the past years and have resulted in first insights in the complexity of transformation. The alveolar subtype of rhabdomyosarcoma, a pediatric tumor of muscle cell origin, is characterized by a specific translocation t(2;13)(q35;ql4) with the breakpoints located at two genes coding for the transcription factors PAX3 on chromosome 2 and FKHR on chromosome 13. The result of this translocation is the generation of a novel chimeric protein, which bears the DNA binding domains of PAX3 and the transactivation domain of FKHR. The aim of this study was to elucidate the role of the t(2;13) translocation in the formation of rhabdomyosarcoma. We developed an antisense oligonucleotide (ODN) approach in order to specifically down-regulate the translocation product in an alveolar rhabdomyo sarcoma cell line. We observed a significant decrease of cell viability upon incubation of alveolar rhabdomyosarcoma (arms) cells with antisense, but not with a number of control ODN. We further investigated two cell lines derived from embryonal rhabdomyosarcoma (erms), the most prevalent subtype, which had no translocation. Interestingly, we found elevated expression of either PAX3 or, the highly related, PAX7. Incubation of erms cells with antisense ODN targeting the overexpressed PAX resulted in a sequence specific decrease of cell viability. We were able to demonstrate that decrease of cell viability correlated with an increase of apoptosis upon antisense ODN treatment. Ectopic expression of Pax-3 was able to protect cells from apoptosis induced by PAX7 antisense ODN incubation. We concluded therefore that deregulated expression of PAX proteins might contribute to the formation of rhabdomyosarcoma, possibly, by blocking the apoptotic mechanism that would normally eliminate these cells. With the aim to elucidate the mechanism of PAX protection from apoptosis, we analyzed the expression of two apoptosis inhibitors Bcl-2 and Bcl-XL, which have been implicated in the formation of several human tumors. Expression of both proteins could be detected in normal muscle and rhabdomyosarcoma cells. We found however no correlation between expression of Pax-3 and Bcl-XL or Bcl-2. Moreover, their expression remained unchanged in rhabdomyosarcoma cells incubated with PAX3 or PAX7 antisense ODN.

3 vn Surprisingly, Bcl-2 or Bcl-XL ectopic expression was able to protect the erms cell line RD from apoptosis by PAX3 antisense treatment. PAX inhibition of apoptosis in rhabdomyosarcoma seems therefore, not to be directly mediated by Bcl-2 nor Bcl-XL, but it probably will involve a pathway regulated by Bel proteins. In a second approach we tried to elucidate the function of Pax-3 and Pax-7 during normal myogenic differentiation. A role for myogenic commitment and regulation of myogenic differentiation had been proposed on the basis of their expression pattern in mouse embryo, where their expression is activated in muscle precursor cells prior to all established myogenic factors, and of the phenotype of Pax-3 mutant mice, which completely lack limb muscle. Down-regulation of Pax-3 and Pax-7 expression was observed in differentiating myoblasts, and their expression was virtually extinguished in differentiated myotubes. However, forced ectopic expression of Pax-3 and Pax-7 in myoblasts had'no influence on their differentiation and ectopic expression of Pax-3 and Pax-7 in mouse fibroblasts could not convert them to a myogenic phenotype. In these cell systems Pax-3 and Pax-7 are not able to regulate myogenic differentiation nor are they able to impose a myogenic fate. In conclusion, our results indicate a new function for PAX3 and PAX7, which might be shared by other PAX proteins, in regulation of apoptosis. During normal embryo development these transcription factors might contribute to cell fate determination by activating cell specific survival programs in response to external signals. A dual function for PAX proteins might be postulated; first, by activating a cell specific genetic program which will determine the function of the cell; and second, by allowing the survival of committed cells by mediating external survival signals, thereby ensuring its correct placement. However, deregulation of their expression might lead to the survival and expansion of a cell population that could ultimately lead to neoplastic transformation.

4 vm RIASSUNTO II cancro e una malattia genetica. La trasformazione neoplastica e spesso il risultato di una serie di mutazioni genetiche che provocano il malfunzionamento dei programmi genetici atti a regolare i processi di crescita, divisione e differenziazione terminale di una cellula. Tra le mutazioni genetiche che sono state associate con svariati tipi di tumori umani vi sono, assieme a mutazioni di singole basi e modifiche del tipo di metilazione, i riordinamenti, le delezioni e le amplificazioni cromosomiche. II tipo di rapporto esistente tra queste anomalie genetiche ed il processo di trasformazione neoplastica o la progressione di un tumore e stato oggetto, negli ultimi anni, di un'intensa ricerca scientifica che ha portato a chiarire alcuni aspetti del complesso processo di transformazione che porta una cellula benigna a sviluppare un tumore. II sottotipo alveolare del tumore pediatrico rhabdomyosarcoma, un tumore derivante da cellule muscolari, e caratterizzato da una specifica traslocazione cromosomale t(2;13)(q35;ql4) che coinvolge due geni che codificano due fattori di trascrizione, PAX3 sul cromosoma 2 e FKHR sul cromosoma 13. D risultato di tale traslocazione e la creazione di un nuovo fattore di trascrizione chimerico con i domini che legano il DNA derivanti da PAX3, mentre il dominio di transattivazione deriva da FKHR. Lo scopo di questo studio era di determinare il ruolo svolto dalla traslocazione t(2;13) nella formazione del tumore rhabdomyosarcoma. Abbiamo scelto un approccio mirante a bloccare la produzione del prodotto della traslocazione in cellule derivate da rhabdomyosarcoma alveolare (arms), basato su oligonucleotidi antisenso (as-odn). Incubando le cellule di arms con as-odn abbiamo osservato una significativa diminuzione della loro sopravvivenza, mentre nessun effetto e stato osservato incubando le cellule con vari ODN di controllo. Inoltre abbiamo analizzato l'espressione di PAX3 e PAX7 in cellule derivate dal sottotipo embrionale di rhabdomyosarcoma (erms) che si differenzia da arms per l'assenza di una traslocazione cromosomica. Abbiamo rilevato un'elevata espressione di PAX3 oppure di PAX7 in due Iinee cellulari analizzate. In analogia con il prodotto della traslocazione, l'incubazione delle cellule erms con as-odn contro il gene PAX sovraespresso provoca una diminuzione della sopravvivenza delle cellule. Un analisi del tipo di morte cellulare indotta dal trattamento con as-odn ha dimostrato che la diminuzione di sopravvivenza delle cellule e dovuto ad un aumento del suicidio cellulare (apoptosi). Inoltre e stato possibile bloccare l'apoptosi indotta dall'incubazione con PAX7 as-odn attraverso l'espressione ectopica di Pax-3. Abbiamo percio concluso che l'espressione sregolata di proteine PAX probabilmente contribuisce alia formazione di rhabdomyosarcoma bloccando il meccanismo apoptotico che normalmente eliminerebbe queste cellule.

5 IX Nel tentativo di elucidare il meccanismo attraverso il quale le proteine PAX proteggono le cellule da apoptosi, abbiamo analizzato l'espressione di due inibitori dell'apoptosi, Bcl-2 e Bcl-XL, precedentemente gia implicati nella formazione di diversi tumori umani. Entrambi i geni sono espressi in cellule muscolari normali e in rhabdomyosarcoma, ma apparentemente non vi e nessuna correlazione tra la loro espressione e l'espressione di Pax-3. Inoltre l'espressione di entrambi i geni, Bc-1-2 e Bcl-XL, rimane invariata in cellule di rhabdomyosarcoma durante 1'apoptosi indotta dal trattamento con as-odn. Sorprendentemente, comunque, Bcl-2 o Bcl-XL sono in grado, se sovraespressi, di bloccare 1'apoptosi indotta nella linea cellulare ermd RD dal trattamento con PAX3 as- ODN. Inibizione dell'apoptosi da parte di proteine PAX sembra percio non essere mediata direttamente ne da Bcl-2 ne da Bcl-XL, ma comunque da una via regolatoria che comprende anche Bcl-2 o Bcl-XL. Infatti, al momento si pensa che sia il rapporto tra gli inibitori e gli induttori di apoptosi piuttosto che il loro livello assoluto a determinare la sorte di una cellula. In un secondo studio abbiamo cercato di definire la funzione di Pax-3 e Pax-7 durante la normale differenziazione miogenica. Una loro funzione durante la determinazione myogenica e nella regolazione del processo di differenziazione sono stati proposti sulla base del modo di espressione durante lo sviluppo embrionale e della completa mancanza di muscoli nelle estremita in topi mutanti in Pax-3. Abbiamo osservato una diminuzione dell'espressione di Pax-3 e Pax-7 durante la differenziazione miogenica, che culmina in un'assenza completa di Pax-3 e Pax-7 in myotubi multinucleati, differenziati terminalmente. Contrariamente a quanto postulato inizialmente l'espressione forzata di Pax-3 a Pax-7 in mioblasti non sembra avere alcun effetto sul loro potenziale di differenziazione, ed una loro espressione forzata in fibroblasti non riesce a convertirli in mioblasti. Ne concludiamo che, nelle linee cellulari analizzate, Pax-3 e Pax-7 non sono in grado di regolare la differenziazione miogenica, ne di imporre un fenotipo miogenico. Concludendo, i nostri risultati definiscono una nuova funzione per PAX3 e PAX7 nella regolazione dell'apoptosi, che forse e condivisa da altre proteine PAX. Durante il sviluppo embrionale queste proteine normale PAX contribuiscono a determinare la sorte di specifiche linee cellulari in risposta a segnali esterni, attivando programmi di sopravvivenza specifici per certi tipi di cellule. Secondo questa ipotesi le proteine PAX ricoprirebbero due ruoli, il primo nel determinare la sorte di una cellula attivando il programma genetico che specifica il tipo di cellula, il secondo nel permettere la soppravivenza di queste cellule solo in risposta a determinati stimoli esterni, assicurandone cosi il corretto posizionamento. In ogni caso, una deregolata espressione risulterebbe nella sopravvivenza di una particolare popolazione di cellule, nella sua espansione, e contribuirebbe alia trasformazione neoplastica.