a.a /11/2015 Lezioni 23 e 24 Analisi di linkage

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1 CORSO INTEGRATO di Genetica e Biologia Molecolare GENETICA a.a /11/2015 Lezioni 23 e 24 Analisi di linkage Elisabetta Trabetti

2 LINKAGE Geni in loci vicini sullo stesso cromosoma concatenati (loci sintenici) Tendenza di loci (geni e/o marcatori) vicini su un singolo cromosoma ad essere trasmessi assieme, come una unità, attraverso la meiosi

3 [Genetica - B.A. Pierce. Zanichelli 2005]

4 Gameti parentali e ricombinanti

5 Analisi di Linkage Analisi di associazione o di concatenazione Co-segregazione di alleli a 2 o più siti polimorfici all interno di una famiglia Probabilità dei marcatori di essere associati rispetto alla probabilità di essere indipendenti

6 2 loci polimorfici in chr diversi: 50% probabilità un allele al primo locus segreghi con un allele al secondo locus A 1 A 2 B 1 B 2 A 1 B 1 50% 2 loci sintenici: probabilità di co-segregazione correla con la distanza tra i loci Probabilità che avvenga un evento di ricombinazione tra due loci FREQUENZA o FRAZIONE DI RICOMBINAZIONE: θ

7 Frazione di ricombinazione, θ Probabilità che avvenga un evento di ricombinazione tra due loci θ = n meiosi ricombinanti n soggetti ricombinanti n tot meiosi n tot figli q= 0,5 loci molto lontani o su cromosomi diversi Assort Indipend q = 0 loci molto vicini Associati q = misura della distanza genetica U di misura: centimorgan cm 1 cm= lunghezza genetica in cui 1% di ricombinazione (q =0,01) NB: distanza genetica non è strettamente proporzionale alla distanza fisica (lunghezza in nucleotidi)

8 MISURA DELLA DISTANZA GENETICA q = n. figli ricombinanti/n. tot figli = 1/8 = 0,125 = 12,5% Distanza A-B = 12,5 cm Vero linkage o dovuto al caso?

9 Poniamo q = 0.5 il valore che ci attendiamo per 2 loci indipendenti Lo spostamento del valore da 0.5 è significativo da un punto di vista statistico? Analisi di linkage nell'uomo utilizzano i metodi basati sul calcolo della verosimiglianza o likelihood

10 Analisi di linkage nell'uomo utilizzano i metodi basati sul calcolo della verosimiglianza o likelihood Probabilità di un valore q in relazione al numero di ricombinazioni osservate tra i loci LOD =Z(q) = Probabilità che i loci siano associati a un dato q Probabilità che i loci non siano in linkage (q=0,5) (q =0-0.5) Valore q con LOD score > è la frequenza di ricombinazione più probabile tra i dati osservati nelle famiglie Due loci sono in linkage per un q se LOD score +3 (1000:1) No linkage se LOD score -2 (1:100)

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12 COSTRUZIONE DI MAPPE GENETICHE Frazione di ricombinazione tra i loci: Ordine 3 loci sul chr A e B = 0,06 (6cM) B e C = 0,07 A e C = 0,10 Frazione di ricombinazione tra i loci: A e D = 0,04 D e B = 0, < somma

13 RICOMBINAZIONE MASSIMA: 50%! Ricombinazione semplice Ricombinazione doppia A B C 0.10

14 MAPPA GENETICA DEL CROMOSOMA 22 Distanza genetica e distanza fisica Non c è correlazione costante < ricombinazioni maschio mappa genetica più corta Approssimazione: 1 cm = 1 Mb

15 ANALISI di LINKAGE: applicazioni Mappaggio di geni malattia e di nuovi marcatori Diagnosi indiretta di malattia - Deve essere nota la localizzazione cromosomica del gene

16 SIMBOLI USATI PER LA COSTRUZIONE DEI PEDIGREE Il probando è l individuo attraverso cui si è arrivati allo studio di quel pedigree, viene indicato con una freccia

17 Ogni individuo è identificato in modo non ambiguo da una coppia di numeri (un numero romano per la generazione ed uno arabo per i soggetti all interno della stessa generazione ordine di nascita)

18 Meiosi informative e non AD Locus marcatore A Alleli 1 e 2 Meiosi informative = individuare i gameti ricombinanti e non

19 Analisi di segregazione degli alleli locus marcatore rispetto al fenotipo AD Loci associati sono trasmessi assieme Determinazione della fase Associazione degli alleli al locus marcatore con il locus malattia

20 2 loci Locus marcatore (1 o 2) Locus malattia (- o +) LINKAGE - ricombinazione P M Segregazione di alleli al locus marcatore e al locus malattia F1 F2 F

21 2 loci Locus marcatore (1 o 2) Locus malattia (- o +) LINKAGE - ricombinazione P M F1 F2 F

22 Determinazione della fase Associazione degli alleli al locus marcatore con il locus malattia Ipotesi: allele 2 associato malattia 50% ricombinazione Assortimento indipendente: gene malattia NON è in linkage con il marcatore

23 REQUISITI Famiglie (numerose) Affetti Marcatori genetici altamente polimorfi uniformemente distribuiti facile individuazione e basso costo (A) Distinguere i due cromosomi omologhi dei genitori marcatore linked (B) Determinare la fase = cromosoma con allele patologico (C) Quale cromosoma e stato trasmesso al probando

24 ANALISI di LINKAGE: applicazioni Mappaggio di geni malattia e di nuovi marcatori Diagnosi indiretta di malattia - Deve essere nota la localizzazione cromosomica del gene

25 Informatività diagnostica di un marcatore nella analisi di linkage - AR 1/1 -/+ 2/2 -/+ Famiglia non informativa 1/2 -/- 1/2 -/+ 1/2 -/+ 1/1 -/- Famiglia pienamente informativa 1/2 -/+ 1/2 -/+ 1/2 -/- Famiglia parzialmente informativa

26 Diagnosi prenatale CF mediante analisi di Linkage MetH: extragenico, ~1Mb 1-2 -/ / /- 1-2?/? allele 2 p allele 1 m:?? 1-2?/+ portatore (CF carrier) o sano MWM P M CF V C

27 Diagnosi prenatale CF Xv-2c: extragenico, ~200 kb allele 1 p? allele 1 m Figlio affetto: 1*p e 2*m oppure 1*m e 2*p MWM P M CF V C Feto: oppure 1*p e 1 m 1*m e 1p in entrambi i casi è PORTATORE

28 Diagnosi prenatale CF 1*-2 1-1* 1*-1* 1*-2 sano o portatore 1-2* 1*-2 1*-2* 1-1* portatore MetH: sano o carrier Xv-2c: carrier Feto: carrier m causa CF

29 Fattori che determinano l accuratezza diagnostica nella analisi di linkage Vicinanza del marcatore al gene frequenza di ricombinazione FC: KM19 <<0.01, MetH e J3.11 =0.01 DMD marcatori intragenici: 0.05 Errori da non paternità biologica Errori di laboratorio Nuove mutazioni Eterogeneità genetica

30 Analisi di linkage e studio degli aplotipi AD Locus malattia DISTALE rispetto al primo marcatore Il gamete con la combinazione trasmesso assieme all allele malattia da I-1 a II-1 = aplotipo associato alla malattia controllo in generaz III Aplotipo = serie di alleli in loci associati su un cromosoma (pat o mat)

31 LINKAGE disequilibrium Specifica combinazione di alleli in fase a due o piu loci linked che si verifica più spesso di quanto accadrebbe per puro caso Associazione a livello di popolazione tra un particolare allele marcatore e una malattia In una popolazione molte persone non imparentate hanno ereditato un cromosoma con una patologia da un antenato comune

32 LINKAGE LINKAGE DISEQUILIBRIUM M 1 M 3 M 1 M 3 Locus A alleli 1 e 2 M 1 M 1 M 3 M 3 M 2 M 3 M 2 M 2 M 2 M 3 M 3 M 3

33 Locus A Locus B 25% 25% 25% 25% 40% 10% 10% 40% 50% 0% 0% 50% Linkage equilibrium Linkage disequilibrium parziale Linkage disequilibrium completo

34 Origine del LD Mutazioni ricombinazioni La determinazione del LD richiede lo studio di nuclei familiari stabilire gli aplotipi

35 Possibilità di determinare elevato LD in soggetti non familiari (popolazioni isolate pochi antenati pochi aplotipi originali) AD: locus a 0.1 cm locus marcatore A Malati (Mm) Controlli (mm) Individui con allele A 1 Totale individui analizzati Allele A 1 >>> frequente negli affetti Mut responsabile AD è avvenuta sul chr A 1 LD responsabile delle differenze osservate

36 Grande numero di SNP vicini ha evidenziato che il genoma umano è costituito da una serie di blocchi di LD Frequenze aplotipi nei blocchi diverse rispetto all equilibrio Utili per la determinazione dei geni responsabili di malattie complesse

37 Progetto HapMap studio collaborativo internazionale obiettivo: individuazione degli aplotipi comuni del genoma umano per utilizzo in studi di linkage e GWAS (mappaggio geni malattia) - popolazioni con antenati Europei, Asiatici e Africani - ciascun aplotipo contrassegnato da tagging SNP tag SNP si può definire con buona approssimazione i genotipi di 10 7 SNP comuni CEU: Utah residents with Northern and Western European ancestry from the CEPH collection, CHB: Han Chinese in Beijing, China, JPT: Japanese in Tokyo, Japan, YRI: Yoruba in Ibadan, Nigeria ASW: African ancestry in Southwest USA CHD: Chinese in Metropolitan Denver, Colorado GIH: Gujarati Indians in Houston, Texas LWK: Luhya in Webuye, Kenya MEX: Mexican ancestry in Los Angeles, California MKK: Maasai in Kinyawa, Kenya TSI: Toscans in Italy

38 HapMap: Ciscun aplotipo può essere identificato in maniera univoca tramite una delle SNP che lo compone (tag-snp) Costruzione aplotipi (a) Single nucleotide polymorphisms(snps) are identified in DNA samples from multiple individuals. (b) Adjacent SNPs that are inherited together are compiled into "haplotypes." (c) "Tag" SNPs within haplotypes are identified that uniquely identify those haplotypes. By genotyping the three tag SNPs shown in this figure, researchers can identify which of the four haplotypes shown here are present in each individual.

39 Identificazione di aplotipi Utili in studi di associazione Confronto aplotipi di casi con aplotipi di controlli Aplotipo più frequente in casi Gene causale interno o vicino aplotipo

40 Linkage disequilibrium e FC

41 Esercizi

42 (1) Dato il genotipo AaBb: quali sono i geni e quali gli alleli? Disegnate schematicamente questo genotipo con i geni concatenati in repulsione, posizionando gli alleli sui cromosomi omologhi. (2) Disegnate schematicamente un genotipo quadruplo eterozigote con i geni A e C concatenati e i geni B e D indipendenti, posizionando gli alleli sui cromosomi omologhi. (3) Disegnare schematicamente due loci indipendenti. Potrebbero essere posizionati sullo stesso cromosoma?

43 (4) Quali gameti produce prevalentemente un triplo eterozigote AaBbCc considerando i 3 casi: gli alleli A e B concatenati in repulsione e anche B e C gli alleli A e B concatenati in cis e C in repulsione gli alleli A e B concatenati in cis e il locus C non concatenato

44 (5) Dato il seguente incrocio AaBbDD x AABbdd in cui tutti i geni segregano indipendentemente a) Quanti gameti geneticamente differenti sarà possibile ottenere da ciascun genitore? b) Quale sarà la proporzione di individui eterozigoti a tutti i loci nella prole?

45 (6) Quali fenotipi produce il seguente incrocio e con quali frequenze AaBbCc X AABBCc (A, B, C, alleli dominanti) Cambiano le frequenze se il primo individuo è omozigote per l allele recessivo al primo locus?

46 (8) Dal genotipo AaBb vengono prodotti i seguenti gameti: AB = 28 gameti Ab = 472 gameti ab = 469 gameti ab = 31 gameti I loci A e B sono associati o indipendenti? E possibile determinare la distanza genetica tra i due loci?