LIBRERIA GENOMICA e di cdna PREPARAZIONE DEL Cdna Sintetizzare la 2 elica di DNA

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1 LIBRERIA GENOMICA e di cdna La libreria genomica contiene le informazioni di tutto il genoma. E' usata per studiare la struttura dei geni,per poter isolare le regioni regolatrici e studiare le regioni non codificanti (es. origini di replicazioni,centromeri). La libreria di cdna serve per studiare la sequenza e la funzione delle proteine. Il vantaggio è che il n di ricombinanti che si screenano è molto basso. Questa libreria è più piccola di quella genomica. PREPARAZIONE DEL Cdna Sistema classico: TTTTTTTTTTT 5' AAAAAAAAAA3' Si usa un oligonucleotide che contiene tante T una dopo l'altra che si appaia alla coda poli-a. La trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNA dipendente) copia un'informazione presente sull'mrna leggendo da 5' a 3'. Utilizza uno stampo da copiare,un 3'OH fornito dall'oligodt e fa la prima elica di DNA. La trascrittasi inversa ogni tanto fa un uncino: prosegue la sintesi anche quando finisce il templato cioè polimerizza un po' di più e l'uncino si ripiega su se stesso. Questo uncino fornisce un 3'OH e la seconda elica sfrutta l'uncino come innesco. Non è più usato perchè l'attività della trascrittasi inversa è inefficiente. Si chiede alla trascrittasi inversa di copiare fino in fondo per ottenere tutto il cdna (non lo posso ricostruire e viene persa l'informazione non copiata). Le DNA polimerasi sono distribuitive cioè si attaccano poi si staccano e si riattaccano in un altro punto. Più è lungo il DNA più è probabile che si stacchi. E' necessario che siano processive. Sistema recente: Si prende l'mrna e gli si dà oligonucleotidi a sequenza casuale. Si appaiano a caso e chiediamo alla trascrittasi inversa di retrotrascrivere l'rna. Ho diversi eventi di sintesi in cui difficilmente la trascrittasi inversa arriva fino in fondo. La probabilità di trovare un certo pezzo è molto più alta che non partendo dal fondo. Parto da punti diversi. Lo svantaggio è che gli oligonucleotidi si appaiano in modo casuale a qualsiasi RNA quindi serve prima estrarre l'mrna e purificarlo. Sintetizzare la 2 elica di DNA Serve togliere l'rna e per farlo si usa l'rnasih. Quest'enzima taglia l'rna quando è appaiato al DNA. Le cellule hanno questo enzima affinchè gli ibridi di RNA-DNA vengano controllati. Più tempo la incubiamo più mangia via l'rna. Se si fa un'incubazione parziale si ha che lascia dei pezzettini. Questi funzionano da innesco e possono essere usati per sintetizzare la seconda elica. TTTTTTTT AAAAAAA Per fare un clonaggio si usa un oligodt che ha una sequenza sintetica per un sito di restrizione all'estremità in modo che il cdna abbia un sito di restrizione in più. 5' 3' Xho1 Se ho un cdna fatto così mi interessa avere Xho1 anche al 5' quindi per attaccarlo dall'altra parte si lega un adattatore. Sto usando una libreria di cdna che deve essere espressa e serve che ci sia un promotore. Se si clonano i frammenti di cdna può accadere che entrino al contrario e si ha che il cdna non viene espresso. La sequenza riconosciuta da EcoR1 è GAATTC CTTAAG Sintetizzo due oligodt sintetici: uno con una certa sequenza che termina con una G e l'altro che abbia una sequenza che viene lasciata quando Ecor1 taglia. Li sintetizzo e li faccio appaiare tra di

2 loro e ottengo un emi-sito EcoR1 che può essere attaccato all'estremità del cdna. Questo è un cdna con due siti EcoR1 già tagliati (sono degli emi-siti). Serve fare un clonaggio direzionale in modo che il 5' vada vicino al promotore e Xho1 al 3'. problema: è un insieme di frammenti di cdna che hanno siti di Xho1 nella sequenza codificante quindi se la taglia con Xho1,taglio anche il cdna. Quando sintetizzo il cdna lo devo metilare attraverso la metilasi di coli perchè in questo modo l'enzima di restrizione non può tagliare il DNA di coli. Si ha un cdna emi-metilato in cui la 1 elica è metilata mentre la 2 no perchè si taglia solo l'oligonucleotide sintetico. Scelta del vettore Il vettore di espressione ha: un promotore,un RBS,un MCS in cui inserisco il frammento e un terminatore. I vettori di espressione spesso sono fatti per creare proteine di fusione. His-tag Sequenza di 6 istidine fusa al cdna quando è tradotto. E' utile per fare analisi successive. Il tag si può trovare o monte dell'mcs o a valle dell'mcs ma prima del codone di stop. 1) plasmide: inserto max di 10 kb 2) fago: inserto max di 20 kb 3) cosmide: inserto max di 50 kb 4) BAC: inserto max di 300 kb 5) YAC: inserto fino a 1000 kb Vettori Fago λ: ha delle sequenze cos in cui si trova il singolo genoma di λ. Si ha che il genoma di λ viene replicato e va nel fago; il fago becca la sequenza cos; tira dentro il DNA di λ e quando trova la sequenza successiva taglia e il genoma è pronto per andare via. Nella testa ci stanno dai 48 alle 50 kb non di più quindi si toglie un pezzo di genoma che non serve come ad es. la parte per fare il ciclo litico. Cosmide: non si comporta come un fago perchè non ci sono le placche di lisi ed è un plasmide che sfrutta le sequenze cos di λ. Lo taglio,inserisco l'inserto,faccio degli oligomeri cioè attacco plasmidi testacoda,metto il plasmide nei capsidi di λ e ottengo un fago che ha solo le sequenze cos ma non fa la lisi e si possono ottenere moltissimi cloni ricombinanti. YAC: si comporta come un cromosoma lineare. Ha un telomero e un centromero altrimenti verrebbe perso. ESEMPIO: il lievito non sa sintetizzare il lievito e quindi si usa un ceppo mutato in Ura3 che è in grado di crescere anche se non c'è uracile perchè sa sintetizzarselo. Ura3 e Trp1 sono i marcatori selettivi. Le cellule se metto triptofano crescono. Se piastro le cellule in un terreno senza trp e ura ho che le cellule wt non crescono ma se contengono lo YAC cib TRP1 e URA3 possono crescere. Utilizzo due marcatori selettivi perchè è un pezzo di DNA molto grosso e devono esserci entrambe le braccia infatti abbiamo un marcatore su un braccio e uno sull'altro. Devo cercare le cellule che lo YAC con l'inserto. Il mutante soppressore è la mutazione in un gene x che combinato con uracile sopprime la mutazione e si passa da ura- a ura+. La mutazione non senso è quella mutazione che mette un codone di stop in un punto in cui di solito non c'è e si ottiene una proteina tronca. Questo accade perchè il ribosoma si attacca,traduce ma quando arriva al TAA si ferma e il ribosoma si stacca. Ci sono trna che sopprimo le mutazioni non senso. Può accadere che da un GCA si passi a un ATT che è complementare al codone non senso e il ribosoma attacca un altro amminoacido e continua la traduzione. Questa mutazione del trna è dominante e si vede il fenotipo nel mutante.

3 SUP4: sequenza del trna con la mutazione che sopprime mutazioni non senso di lievito e si trova dentro lo YAC ADE3: marcatore per l'adenina adenina ADE3 ADE2 Se elimino ADE3 ho che le cellule restano bianche. Se elimino ADE2 ho che il precursore passa dentro l'enzima che produce un prodotto che però non viene usato da ADE2 in quanto è stato eliminato. Si accumula pigmento rosso che non è consumato quindi da ADE2 e si hanno cellule rosse. ade2 ADE3 cellule rosse ade2 ade3 cellule bianche ADE2 ADE3 cellule bianche ADE2 ade3 cellule bianche Può accadere che: le cellule wt fanno il precursore ma è consumato da ade2. Se il precursore non viene formato le cellule restano bianche. Se il precursore viene formato ma ade2 non funziona diventano rosse. Le cellule necessitano di uracile,triptofano e adenina per crescere. Hanno una mutazione non senso in ade2 e sono rosse. Se metto lo YAC ho che: la mutazione in trp1 è complementata da trp1,la mutazione in ura3 è complementata da ura3 e la mutazione in ade2 è soppressa dal trna mutato. Queste cellule fino a quando non le trasformo sono rosse. Quando ci butto dentro lo YAC sono bianche. Perchè ho soppresso la mutazione in ade2. 1) le cellule senza YAC muoiono perchè non hanno triptofano e uracile 2) se metto lo YAC ricombinante le cellule sono rosse 3) se metto lo YAC senza ricombinante le cellule sono bianche Mi serve per selezionare le cellule con l'inserto o meno. Vettori fagici: Sono usati per clonare pezzi di DNA grandi. Λ quando infetta può prendere 2 strade: ciclo litico o ciclo lisogeno. A noi interessa amplificare l'inserto quindi si elimina dal genoma di λ la parte che serve per la via lisogena e questa viene sostituita dall'inserto. Questo perchè il capside tira dentro il genoma di λ fino a quando la testa è piena. Ogni fago ha un pezzo di DNA genomico diverso e ha un'alta efficienza di infezione. Si vanno a creare le placche di lisi dalle quali poi posso aspirare il fago. Come fare lo screening: per sapere quanti cloni devo analizzare prima di vedere il gene che mi interessa dipende dalla grandezza del genoma e dalla grandezza dell'inserto nel vettore. E' + facile se guardo i cosmidi perchè contengono un pezzo + grosso. Statisticamente i geni sono clonati più volte. N= ln(1-p)/ln(1-f) N: n di cloni ricombinanti p: probabilità con cui voglio trovare il mio gene f: frazione di genoma contenuta nel mio clone Identificazione del gene 1) screening su sequenza 2) screening su funzione 3) screening su caratteristiche strutturali

4 Se conosco qualcosa sulla sequenza del gene serve avere informazioni sulla sequenza che sto cercando o su una sequenza omologa e lo posso fare o x ibridazione o x PCR. Può accadere che qualcuno abbia già clonato il cdna del gene o posso avere il cdna e andare a cercare le sequenze regolative. Come marcare il DNA: posso denaturare il DNA scaldandolo;incubo il DNA con una miscela di oligonucleotidi con sequenza casuale e che si appaiano in modo casuale;abbasso la temperatura. Ho DNA polimerasi,nucleotidi non marcati e 1 nucleotide marcato con P32. Si deve usare datp e si marca il P in α cioè P-P-P*-adenina. La DNA pol usa gli oligonucleotidi come inneschi e il DNA come stampo e ho che le sequenza sintetizzate sono tutte radioattive perchè c'è il datp radioattivo e ottengo una sonda marcata. Questo è un random priming in cui si hanno molti atomi radioattivi e un'alta attività specifica. Se ho a disposizione invece un oligonucleotide sintetico e a singola elica lo incubo in presenza di polinucleotide chinasi e P32 γ. L'enzima stacca il P dall'atp e lo attacca all'oligonucleotide. Si piastrano le cellule e si ottengono delle colonie,si fa replica plating su un filtro di nitrocellulosa. Stacco il filtro e ho alcune cellule sul filtro. Il filtro lo appoggio su una nuova piastra e liso le cellule mettendo il filtro a contatto con una soluzione tampone contenente SDS. Ottengo DNA e proteine al posto della colonia. Nella soluzione tampone metto anche soda che aiuta la lisi e denatura il DNA. Ibridazione: si deve saturare il filtro con DNA specifico cioè si butta sul filtro un eccesso di DNA. Il DNA deve essere denaturato perchè in questo modo si attacca meglio alla nitrocellulosa. DNA e sonda stanno attaccati fino a quando non si alza la temperatura. Si lava via l'eccesso di DNA. Si incuba con una sonda omologa marcata e denaturata e si appia alla sequenza complementare,si lava via l'eccesso di sonda che non si è attaccato e si alza la stringenza per lavare via la sonda che si è appaiata per pochi nucleotidi. Si usa la lastra radiografica per vedere le colonia. Si può incubare con una sonda eterologa che deriva da un gene che ha la stessa funzione ma in un altro organismo quindi ha una specificità più bassa e devo usare condizioni di stringenza più bassa per consentire un'ibridazione meno forte. Si può incubare con una sonda degenerata. Posso ottenere una parte della sequenza della proteina e usarla per cercare il gene. Usando il codice genetico al contrario e trovando la sequenza del DNA deducendola dagli amminoacidi. Si deve usare come sonda tutte le combinazioni possibili che danno la mia sequenza. Si fa una sonda degenerata che è l'insieme di sequenze nucleotidiche diverse e sono le diverse combinazioni dei codoni. Si deve scegliere la regione di minor degenerazione per la fare la sonda. Si avrà che una delle sonde avrà la sequenza complementare al gene cercato. Non si deve però abbassare troppo la stringenza. PCR degenerata: A volte si possono utilizzare primer degenerati, costituiti da miscele di molecole simili ma non identiche (differenti per alcuni nucleotidi all'interno della sequenza). Primer degenerati risultano utili, ad esempio, quando si devono amplificare gli stessi geni provenienti da organismi diversi (che hanno sequenze simili ma non identiche), oppure quando la sequenza del gene è stata ricavata dalla sequenza della proteina corrispondente, tenendo conto della degenerazione del codice genetico. Es. voglio cercare l'omologo umano di 2 sequenze di pompe e cereviasiae e disegno un oligonucleotide degenerato. So che le due proteine di lievito contengono 2 regioni molto conservate e da questo posso immaginare che la stessa proteina nell'uomo sia conservata nella funzione. Disegno due oligonucleotidi degenerati e so che c'è un dominio ATPasico. Si cerca di trovare cloni che

5 contengano tutte e due le sequenze. Si prende la libreria di cdna e si fa la PCR con due oligonucleotidi che serve che non siano troppo distanti tra loro. Spero che questi due oligonucleotidi si appaino al cdna ma ce n'è uno a cui si appaiano tutti e due. Ottengo un prodotto di PCR in cui c'è un pezzo di DNA che contiene le due sequenze più quello che c'è in mezzo. Ho amplificato un pezzo del gene di interesse,lo marco e lo uso come sonda. Si è riusciti a costruire una macchina in cui c'era un gradiente di temperatura e si fanno correre su gel. Se conosco la funzione del gene Quando voglio fare uno screening basato sulla funzione devo usare le librerie di espressione. Posso utilizzare: 1) complementazione di mutanti 2) soppressione: interazioni genetiche 3) letalità sintetica: interazioni genetiche 4) Synthetic dosage lethality : interazioni genetiche 5) two hybrid Complementazione: ho un mutante che ha perso una funzione e voglio trovare un gene che codifica per quella funzione. Ad es. ho cellule che su terreno che contiene uracile crescono mentre se non c'è non crescono. La cellula ha perso la funzione di crescere su uracile e ha una mutazione su un gene che consente la crescita in assenza di uracile. Per clonare questo gene trasformo le cellule con una libreria di espressione con un clone. La cellule che tira dentro cdna con il gene mutato è capace di crescere anche se non c'è uracile. Avrò tanti morti e un vivo che contiene il gene selvatico che ho mutato. Ad es. ho un mutante che a 25 fa colonia mentre a 37 è morto. Per clonare il gene mutante trasformo con una libreria di espressione con un clone che a 37 vive. Vivono solo quelle cellule che contengono un cdna che codifica per questa caratteristica. Screening genetici: la funzione del gene posso studiarla analizzando il fenotipo del mutante. Gli screening genetici possono essere fatti per tutti i geni che hanno una certa funzione. Può essere fatto per tanti mutanti ed è reso possibile dai sistemi ad high troughtput. Ad es. se la cellula muore a 37 è perchè ha una mutazione in un certo gene. Trasformo la libreria e tolgo un plasmide che ha una certa sequenza. Dopo che ho tolto il gene devo verificare che sia veramente la copia selvatica del gene di interesse. Le mutazioni possono essere complementate o soppresse. Reversione significa che quando trasformo la libreria spinge ad avere una mutazione magari inversa. Prima A poi T e poi ridiventa A. Crescono a 37 ma non perchè contengono il cdna. Se la mutazione è la delezione del gene non può revertire facilmente mentre le mutazioni puntiformi possono revertire. Oppure può accadere che sia veramente la copia selvatica del gene mutato e ho effettivamente la complementazione. Potrebbe essere una soppressione: questa mutazione in presenza di questo gene si ha un fenotipo soppresso. E' un altro gene che sopprime la mutazione. Soppressione: il ceppo di partenza è vivo a 25 e morto a 37. Quando metto la library ho che il clone isolato è vivo a 37. Tolgo il plasmide: se è vivo a 37 il plasmide non fa niente e la mutazione è revertita,se muore c'è ancora la mutazione sulla cellula. Uso un sistema per far perdere il plasmide. Nel caso del lievito posso usare un plasmide che porta come marcatore selettivo ura3. Le cellule senza plasmide muoiono se non c'è uracile mentre sono vive se hanno il plasmide. Voglio fargli perdere il plasmide. Uso ura3 perchè è un marcatore selezionabile: conferisce a cellule ura3- la capacità di vivere senza uracile ma è anche contro-selezionabile perchè posso usarlo per ammazzare le cellule che non hanno il marcatore e lasciare vivere le cellule che hanno il marcatore. Può selezionare a favore o contro: a favore perchè vivono solo le cellule con il plasmide se non c'è uracile oppure posso mettere le cellule su un altro terreno in modo che vivere solo le cellule che hanno perso il plasmide

6 vivono. Questo altro terreno contiene FOA che è un analogo dell'uracile. Il FOA entra nelle cellule e se le cellule sono capaci di sintetizzare uracile ammazza le cellule mentre se le cellule non sono capaci di sintetizzare uracile non usano FOA e vivono. Quindi le cellule sono vive su ura a 37 e posso prenderle e trasferirle in un terreno che contiene FOA. Se la cellula ha il plasmide,esso viene replicato quando la cellule si divide. Se il plasmide non ha centromero, la cellula segrega il genoma e anche il plasmide. I plasmidi si distribuiscono a caso e si ha che con una certa frequenza il plasmide viene perso spontaneamente. Se io piastro su terreno con FOA solo le cellule che hanno perso spontaneamente il plasmide possono crescere perchè sono diventate ura- mentre quelle che hanno il plasmide muoiono perchè FOA le uccide. Se si prende la colonia e la si mette a 37 : se è viva la mutazione è revertente; se è morta significa che era mantenuta in vita dal plasmide. Bisogna mettere sia uracile che FOA nel terreno. Resta da considerare la soppressione. Può accadere che la cellula contenga la mutazione ma non esprima il fenotipo mutante perchè ha dentro un gene soppressore. E' un gene che è capace di sopprimere il fenotipo di una mutazione. Voglio sapere se il cdna contiene la sequenza wt o il gene soppressore. Dovrei confrontare la sequenza del cdna con quella della mutazione e se ho che sono uguali ho beccato il gene per complementazione mentre se sono diverse ho un gene soppressore. La cellula può farlo perchè se ho una certa sequenza sul genoma e ho una sequenza sul plasmide posso chiedere alla cellula di ricombinare. Se le due sequenze sono uguali si ha che la ricombinazione omologa funziona mentre se le due sequenze sono diverse la ricombinazione omologa non funziona. Ho un plasmide con una certa sequenza che spero sia il mio YFG e ho sul cromosoma un gene x con una certa mutazione. Se le due ORF sono uguali ho clonato il gene per complementazione ma se le due ORF sono diverse ho un soppressore visto che complementa il fenotipo. Posso quindi confrontare le due sequenze e vedere se sono uguali o diverse. Es. gene X che porta la mutazione gene clonato YFG plasmide con marcatore selettivo Un plasmide quando lo trasformo in una cellula può essere integrato con una certa frequenza soprattutto se contiene regioni di omologia. Per facilitare l'integrazione,renderla più efficiente e dirigerla posso tagliare il plasmide. Se lo taglio con un sito di restrizione,prima di trasformarlo,ho che sto dicendo alla cellula di fare crossing over esattamente in quella posizione perchè le due estremità del plasmide verranno usate dai meccanismi di ricombinazione omologa dalla come inizio per l'invasione della ricombinazione omologa. Per fare la ricombinazione devo avere un'estremità a singola elica che va a cercarsi la regione di omologia e si appaia. Sto creando le estremità i sistemi di ricombinazione useranno cioè dico alla cellula di andare a cercare partendo da queste estremità. Con una linearizzazione dirigo la ricombinazione omologa. Facciamo l'esempio che YFG sia lo stesso gene che porta la mutazione. Quando il gene si integra ho che: il cromosoma integra il plasmide e poi si riprende con la sequenza rappresentata sul cromosoma. Se in * la mutazione è recessiva si ha che la cellula dopo l'integrazione è una cellula wt perchè porta la copia mutante ma ha anche la selvatica. Se questo è un gene che complementa si ha che il plasmide si integra di fianco alla copia cromosomica e ho una cellula selvatica. Questa cellula ha ancora la mutazione sul cromosoma e se la prendo e la incrocio con un'altra cellula di lievito selvatica. Il lievito esiste sia alla stato aploide (1 copia di cromosomi) che diploide (2 copie di cromosomi) Si può mantenerlo allo stato aploide e farlo crescere e ottenere una popolazione oppure si possono incrociare due cellule di lievito e ottenere un diploide e mantenere questo diploide. Il tipo sessuale di lievito può essere MATa e MATα e solo questi due possono incrociarsi e secernere a-factor. Se nella stessa beuta ci sono cellule che producono ferormone di tipo a e cellule che producono ferormone di tipo α si ha che decidono di incrociarsi. In G1 una cellula aploide ha una copia di cromosomi mentre in G2 ne ha due. Se devo incrociare due cellule aploidi e per caso unisco una cellula G2 di tipo α e una cellula G1 di tipo a otterrei un triploide. Non succede mai perchè quando

7 una cellula di tipo a sente l'α-factor conclude il ciclo cellulare e si ferma in G1. Stessa cosa per α che finisce il ciclo e si blocca in G1 e quindi ho solo cellule in G1 che si incrociano. Quando le cellule stanno per incrociarsi me ne accorgo perchè hanno una forma smooth e allungata. Si mettono lì,si annusano e poi si fondono e fanno uno zigote che diventerà poi una cellula diploide. Il diploide sarà MATa MATα. Posso anche farlo tornare allo stato aploide mettendole in carenza di azoto e vanno in meiosi dopo circa 6h. Producono 4 spore aploidi molto resistenti che vivono in assenza di azoto. Posso incrociare MATa con MATα e ottengo un diploide che avrà 2 copie di cromosomi 5 ad esempio. Tolgo l'azoto dal terreno,faccio fare la meiosi e si ha che i due cromosomi omologhi si separano e vanno uno da una parte e l'altro dall'altra. Ho 2 spore che entrano nella prima copia di cromosoma 5 e 2 nell'altra. Queste spore a 37 saranno tutte vive perchè 2 non hanno nemmeno la mutazione mentre le altre 2 hanno il gene selvatico che complementa e quindi sono vive. Se clono il soppressore: ho il gene sul cromosoma con la mutazione,ho il plasmide con il marcatore e che porta un gene soppressore. Taglio il plasmide e produco due estremità lineari che sono usate dai meccanismi di ricombinazione per invadere le sequenze omologhe. Dico alla cellula di fare il crossing over sulla sequenza omologa. Il meccanismo di ricombinazione la porta a cercare sul genoma il punto in cui si può integrare. Questa cellula ha un fenotipo selvatico perchè il gene soppressore sopprime la mutazione. Ho una cellula che contiene il gene che sopprime in qualche punto del genoma. Se incrocio con una cellula wt ottengo un diploide che ha due copie del cromosoma 5 e avrà da qualche parte integrato il gene soppressore. Se la library è di lievito ho da qualche parte anche il gene YFG che proviene dalla cellula parentale. Non si è infilato nel mio gene di interesse. Il gene soppressore e quello della mutazione non sono uniti e ho che quando fanno meiosi segregano a caso se non sono strettamente concatenati. Questo significa che non c'è nessun motivo per cui debbano andare nella stessa spora,lo faranno ma a caso. Se vanno in spore diverse avrò una spora che ha una mutazione nel gene soppressore ma non in YFG perchè questo è andato con l'altra copia del cromosoma 5. Qualcuna delle spore torna ad essere mutante perchè facendo fare meiosi separo il costrutto che sopprimeva dall'altro. Per sapere se ho isolato il gene soppressore o il gene di interesse è di incrociarlo con il selvatico e fargli fare la meiosi. Tutto questo funziona se la mutazione è recessiva. Significa che quando metto la cellula in presenza della mutazione recessiva osservo il mutato. Se la mutazione è dominante significa che quando metto il gene mutato in presenza della copia selvatica vedo il mutante. Se voglio clonare il gene devo preparare una libreria di cdna dal mutante. Devo prendere la cellula mutante e fare la libreria in modo che uno di questi cloni contenga il gene mutante. Ho un clone con la sequenza mutante che è dominante. Se questa sequenza la trasformo in un ceppo wt ottengo una copia wt sul cromosoma e una copia mutante che deriva dal plasmide. Ottengo un mutante e ho clonato per complementazione ma è più difficile perchè devo fare una libreria apposta. Se lo screening viene fatto con una libreria genomica devo vedere quale dei pezzi tagliati complementa la mutazione. Letalità sintetica: due mutanti sono letali sintetici se abbiamo ad es. il gene a mutato che dà un certo fenotipo e vediamo crescita a 37. Il ceppo wt cresce bene,il ceppo che porta la mutazione cresce meno bene,il gene che porta la mutazione nel gene b cresce ma non benissimo. Se faccio un ceppo che porta la mutazione nel gene a e b ho che il ceppo è morto. Queste due mutazioni diventano letali quando sono messe insieme. Questo è uno dei sistemi + potenti per cercare di capire in quale processo cellulare un gene sta lavorando e serve per identificare geni che lavorano in processi cellulari simili. Es. abbiamo un DNA rotto e ci sono sistemi per riparare il danno. Possono esserci due strade che porta alla riparazione: se elimino la strada a la cellula non sta benissimo ma vive e se elimino la via b non sta benissimo ma se le elimino tutte e 2 la cellula è morta. I geni a e b sono letali sintetici. Es. il danno al DNA viene riparato da un complesso a-b. Se elimino a ho che il complesso è ancora stabile e sa assemblarsi e ho che la cellula sta abbastanza bene. Se elimino b idem. Se li elimino

8 entrambi ho che il complesso non riesce a stare insieme e la cellula muore. La letalità sintetica si ha quando ci sono due pathway alternativi per fare la stessa cosa o quando ci sono due geni che codificano per proteine che fanno parte dello stesso complesso. Se ho in mano un gene che non so cosa faccia nella cellula posso andare a cercare i geni letali sintetici e magari scopro un letale sintetico di cui si conosce la funzione. Screening per la letalità sintetica: Es. ho un gene che non so cosa fa e voglio cercare geni che sono letali sintetici. Ho un mutante alk2 e l'idea è quella di cercare un mutante in un gene x che quando è combinato con alk2 mi dia un fenotipo sintetico. Ho una mutazione alk2 e la cellula è ura3- e ho anche le mutazioni ade2 e ade3. ADE3 selvatico processa il precursore e lo fa diventare rosso,se ADE2 funziona le cellule sono bianche. Se mancano tutti e due le cellule sono bianche perchè il rosso nemmeno lo fanno. Il ceppo di partenza è bianco. Perché il sistema funzioni ho che il ceppo deve essere trasformato con un plasmide che porta ALK2 selvatico,ura3 marcatore selettivo per selezionare le cellule trasformate e ADE3 selvatico. Le cellule sono rosse perchè ADE3 è presente ma ADE2 resta sul cromosoma. ALK2 non è espressa perchè c'è solo il gene selvatico e sono rosse perchè c'è solo ADE3. L'idea è di trovare un mutante in un gene x in modo che sia letale sintetico con alk2. Se il mutante è letale sintetico ho che la cellula è morto. Come lo trovo se è morto? Il trucco è che se questa cellula che contiene ALK2 selvatico è viva perchè la mutazione è complementata dal plasmide. Con una certa frequenza la cellula perde il plasmide e muore. Non deve assolutamente perdere il plasmide. Se il plasmide contiene ade3 quando esso è dentro le cellule sono rosse mentre quando non c'è sono bianche perchè non hanno ADE3. Le distinguo dal colore. Il ceppo è rosso perchè c'è dentro ADE3. Se prendo questa cellula e la piastro vedo che avrò alcune colonie sono rosse mentre altre sono bianche. Piastro e ho colonie + rosse,+ bianche e alcune a spicchio. La parte delle colonie rosse sono quelle con il plasmide,le bianche hanno perso il plasmide. Ho che il ceppo di partenza fa settori. Voglio trovare una mutazione di un altro gene che impedisca la perdita del plasmide e sia quindi letale sintetico su alk2. Le colonie saranno tutte rosse. La frequenza di mutazione spontanea c'è ma è molto bassa quindi devo mettere un agente mutageno come EMS che aumenta la probabilità di ottenere mutazioni in altri geni (aggiungendo gruppi metilici alle basi azotate). Quando queste cellule lo vedono subiscono mutazioni magari nel gene x. Ho quindi una collezione di mutanti e devo cercare quali le cellule che hanno una mutazione del gene x che è letale sintetico in alk2. Piastro le cellule e gli faccio fare colonia e ho che la maggior parte fanno settori perchè non hanno a che fare con alk2. Le altre danno colonie rosse che è indice possibilmente della letalità sintetica con alk2. Ci sono alcune colonie a settori che non hanno la mutazione. Se la mutazione riguarda il gene Z si ha una colonia a settori perchè può ancora perdere il plasmide e comunque alk2 non è letale. Se la mutazione è in un gene x che è letale sintetico con alk2 si vedono colonie rosse. Le cellule sono rosse quando c'è il plasmide mentre quando lo perdono diventerebbero bianche perchè perdono alk2 ma abbiamo che sono morte. Si cercano solo le colonie totalmente rosse. Quindi esiste un gene x che quando è mutato è letale sintetico con alk2. Il gene x non lo posso clonare in base alla sequenza ma in base alla funzione. Lo clono per complementazione. Le cellule sono rosse e se trasferisco una banca di cdna che contiene il gene x wt quando questo entra ho che le cellule cambiano fenotipo e fanno di nuovo i settori. Questo è vero se la mutazione è recessiva perchè se invece è dominante anche se metto il wt restano rosse. Devo quindi controllare che la mutazione sia recessiva: il diploide fa i settori perchè questo ceppo ha due plasmidi uno per il gene alk2 e uno per il gene x. Fenotipicamente le mutazioni sono coperte dal gene selvatico e si vede il fenotipo del wt. Si ottengono reti di interazioni tra alk2 e altri geni. In realtà c'è un gene alk1 che svolge una funzione quasi identica perciò sfalsa i risultati. Ho una cellula con alk2 e voglio trovare una mutazione per cui alk2- e x- la cellula muore. Come seleziono se muore? Inserisco un plasmide con alk2 funzionante e vedo che le cellule con questo plasmide sono fenotipo per alk2 normale e sono rosse perchè hanno come marcatore ade2. Quindi mutagenizzo la cellula con il plasmide e ho che se nasce una mutazione x- letale sintetica con alk2- la cellula è viva a patto che abbia il plasmide perchè o è rossa o è morta. Sicuramente non può

9 essere bianca. Il plasmide è privo di centromero e la cellula lo perde con una certa frequenza perchè alla duplicazione il plasmide duplica e può finire tutto o nella madre o nella figlia. Le colonie possono essere un po' bianche e un po' rosse quindi settorate. Finchè la mutazione è solo alk2- anche le colonie bianche vivono però se la cellula viene mutata e si ha alk2- e x- se non contiene il plasmide quindi è bianca e muore sicuramente. Riconosco perciò i ceppi alk2- x- perchè le colonie sono tutte rosse. Queste cellule vengono coltivate su un terreno contenente uracile altrimenti morirebbero lo stesso. X- da solo permette la sopravvivenza della cellula altrimenti morirebbero sia le colonie bianche che quelle rosse. La mutagenesi la posso fare con EMS e dipende dalla quantità che metto e tratto per avere in media una mutazione ulteriore a cellula. Trovo x con una banca di cdna fatta nelle colonie rosse se x è recessiva. Test di recessività o dominanza: incrocio x- alk2- ade3 ura3 con alk2- ade2 ade3 ura3 ottengo un diploide x-x+e se la mutazione è recessiva il diploide è settorato altrimenti è rosso. Se è recessiva inserisco del cdna nel ceppo alk2- x- e le colonie con x+ saranno le uniche con i settori. Estraggo il DNA dalle cellule settorate e trasformo un coli con questo DNA e ho che il DNA genomico viene degradato e restano solo i plasmidi. Trovo le cellule con il plasmide con X,faccio la PCR e sequenzio. Sinthetic dosage lethality Se ho un mutante a- e aumento l'espressione di b e il meno a- cresce meglio ho la soppressione. Se ho un mutante a- e inserisco una mutazione b- e il mutante a-b- muore ho la letalità sintetica. Se ho un mutante a- e aumento l'espressione di b e il mutante a-b> muore ho la sinthetic dosage lethality. Es. a ripara il DNA e b danneggi il DNA ma esiste un pathway c che ripara 1 un po' però se c'è b ma non c'è a muore. Doppio ibrido Avendo un gene a che codifica per A esistono Bs che interagiscono fisicamente con A? Il doppio ibrido è un sistema genetico che funziona in cellule vive ma non è un metodo biochimico. Si basa sulla struttura modulare dei fattori trascrizionali che legano il promotore e attivano la trascrizione. Es. il DNA binding domain e l'activation domain sono legati da un linker. In questo esperimento si è rimosso il linker e al DNA binding è stato legata la proteina 1 mentre all'activation la proteina 2. Se le proteine 1 e 2 interagiscono tra loro i due domini si collegano e quindi si ha che l'attivatore trascrizionale funziona e il gene viene trascritto. Più forte è l'interazione,più il gene viene espresso. Questo è anche un test quantitativo. Lo screening è effettuato di solito in lievito,a volte in batteri e in mammiferi. Viene usato lacz come gene reporter. Si usa come substrato Xgal (blu) che si usa in piastra oppure ONPG (giallo). Xgal dà anche sfumature di azzurro perciò è un test complesso da condurre da solo perciò si inserisce un secondo reporter che se non è espresso direttamente le cellule muoiono. Si usa leu2 per la sintesi della leucina. Solo le cellule che trascrivono leu2 possono crescere. Nella cellula devono quindi esserci due plasmidi: DBD-proteinaA e cdna-ad. Se la proteina e il cdna interagiscono si ha che il reporter viene espresso. Di solito si usa come DBD LexA batterico. Nei plasmidi si mette MCS,LexA,TRP1,oriC di cereviasiae e un promotore di lievito. Di solito si usa il promotore costitutivo ADH1. Il secondo plasmide contiene il cdna,ura3,ori,ad,promotore. In questo plasmide si usa in promotore inducibile GAL1 perchè il cdna potrebbe essere tossico. Di solito si usa un costrutto che contiene un plasmide fatto da LexA batterica DBD e B42 di lievito che è l'ad. Voglio ottenere proteine di fusione. I plasmidi hanno un sito di restrizione quindi possono inserire in frame qualunque sequenza ligandola ai reporter. Amplifico per PCR il gene dal genoma mettendo codine in un sito ecor1 in modo che quando esso viene tagliato le codine si possano rilegare e vadano così in frame. Questo è il cosiddetto plasmide esca cioè è quello che uso per andare a pescare l'interazione e ha come marker ad esempio il triptofano. Quando viene espresso questo plasmide dal promotore ADH1 viene fatta la proteina di fusione YFP-lexA. Quando

10 viene trascritto questo costrutto è sintetizzata la proteina di fusione costituita da B42 fusa in frame con i cdna che abbiamo trovato. Si sta facendo uno screening nella libreria. E' meglio metterci un promotore inducibile perchè qualche cdna può essere tossico. Il ceppo di lievito che si utilizza è EGY48 che avrà sul cromosoma il gene leu2 controllato da un promotore artificiale che viene attivato solo quando lexa-b42 è posizionato. C'è un LexAO che è un operatore (a cui si lega il regolatore). Quando LexA è legato e si porta dietro B42 si ha attivazione di leu2. L'attivazione si ha solo quando c'è interazione tra le due proteine. C'è un altro gene reporter in un altro punto perchè il sistema leu2 è molto comodo per fare una prima selezione. LacZ invece è comodo dopo per valutare quanto è forte l'interazione. Se c'è un'interazione debole si ha che lacz è trascritto poco. Un altro motivo è che quando si fanno screening si trovano sempre falsi positivi. Più sistemi diversi si usano e meno falsi positivi ci sono. Quando faccio lo screening posso avere che crescono su mellow e sono positive per la mutazione ma quando metto lexa diventano blu. Sono cresciuti su mellow ma non perchè c'è interazione. Se l'interazione esiste devono essere leu+ e blu. E' utile per eliminare i falsi positivi avere due reporter. Un altro caso di falso positivo è il sistema di leu2. Si può avere ad esempio un ceppo con un gene leu2 inattivato e in un altro locus avere una copia leu2 wt. Se l'interazione è negativa ho che il gene cromosomico è inattivo,l'altro non lo possono trascrivere. Si ha che le cellule sono leu-. C'è però una probabilità bassa che la mutazione leu2 possa revertire e far diventare le cellule leu+. Ho colonie che crescono su mellow anche se non c'è interazione ma semplicemente perchè ho revertito. Se passo su Xgal vedo però che non diventano blu. Questo accade quando uso sistemi di screening molto forti. Eventi come la reversione danno un vantaggio selettivo molto forte e le cellule vive diventano un numero importante. Oppure può forse accadere che le cellule che hanno revertito la mutazione producono leucina,muoiono e rilasciano leucina sufficiente per la sopravvivenza delle altre. Leu2 e lacz sono già dentro al ceppo di lievito. Ci sono proteine che anche senza l'activation domain se ha regioni acide o ricche in prolina sono ugualmente in grado di indurre la trascrizione. Si trasforma il plasmide esca se buttargli dentro il plasmide preda AD. Se il ceppo non cresce significa che non sa fare la trascrizione mentre se cresce in assenza di attivatore trascrizionale continua a crescere. Non sono in grado di distinguere le interazioni negative dalle positive. Trasformo l'esca per vedere se da sola attiva o meno la trascrizione. Se attiva da sola posso prendere YFG e farlo a pezzetti. Clono il gene su pezzi diversi sperando di trovare qualche pezzo che non attivi la trascrizione spontaneamente. Perdo delle interazioni perchè ho pezzi di proteina. Trovo dei positivi e poi posso fare il 2 esperimento di trasformazione. Ho il ceppo con il plasmide esca e gli butto dentro la libreria preda e li metto su mellow. Vedo che crescono delle colonie che sono dei possibili positivi,li trasferisco su una piastra fresca di mellow poi su Xgal. I positivi su entrambi sono gli effettivi positivi e su questi lavoro. Ho colonie positive in cui c'è un plasmide trp1 che contiene l'esca e LexA e c'è un plasmide preda con B42 e un cdna diverso da colonia a colonia che si trova all'interno. C'è una certa proteina che interagisce con YFP e una proteina b che interagisce anche lei con YFP. B42b ha un attivatore trascrizionale che è B42 e poi una proteina b. Se questa proteina b per qualunque motivo riesce a legarsi a monte del gene leu2 visto che c'è attaccato l'attivatore trascrizionale B42 attiva la trascrizione del gene reporter anche senza l'esca. La colonia sopravvive anche se l'interazione non c'è. Mi dà un risultato positivo allo screening su leu2 e lacz ma è un falso positivo perchè non dipende dall'interazione. Può essere che la proteina abbia un'attività molto forte per il DNA. Faccio un controllo lisando e purificando le cellule. So che l'esca da sola non basta per attivare la trascrizione. Devo essere sicuro che la trascrizione del reporter non dipenda esclusivamente dalla fusione della proteina con il dominio di interazione al DNA. Successivamente tolgo il plasmide e lo trasformo in un ceppo vergine di lievito senza l'esca. Ho che B42 è espresso ma non ho più l'esca. Mi aspetto che questa cellula non trascriva più il gene reporter perchè non c'è l'esca e quindi non c'è interazione. Se resta leu- la positività del ceppo dipendeva dalla presenza contemporanea dei due plasmidi. Se il ceppo diventa leu+ ho che la preda da sola attiva la trascrizione e non posso sapere se c'è interazione o meno. Controllo n 2: sequenzio il plasmide e vado a leggere la sequenza del clone. Ho trovato un gene a che interagisce con una proteina di mio interesse. Il sistema del doppio ibrido rileva anche interazioni transienti. I problemi che pone il doppio ibrido sono che non è detto

11 che questa situazione sia ricreabile quando creo proteine di fusione. La fusione di per sé può modificare le proprietà della proteina. Se il dominio di interazione è reverso perchè può essere che sia colpa della proteina di fusione che non mi fa funzionare l'interazione. Es. YFP ha un dominio di interazione all'interno e normalmente non interagisce con a perchè il sito di interazione è nascosto. La proteina nativa viene sottoposta a una forma di regolazione tale che il sito viene esposto e si ha che l'interazione è possibile. Quando però faccio il two hybrid non vedo interazione ma potrebbe essere rilevata con altri sistemi. In questi casi è utile usare pezzi di proteina ma non posso saperlo a priori. Problemi dei fasi positivi: proteina YFP e proteina a hanno un'affinità bassa nella cellula e si ha che non si toccano mai. Ricordiamo che usiamo ADH1 per esprimere YFP e gal1 per esprimere la proteina a. Queste due proteine fisicamente non interagiscono mai ma se alzo la concentrazione della proteina ho interazione. YFP e a devono poter raggiungere il reporter per poter attivare la trascrizione. Questo reporter si trova nel nucleo e ho che le due proteine devono finire nel nucleo altrimenti il two hybrid non può funzionare. I plasmidi esca e preda hanno anche un sito di localizzazione nucleare che costringe queste proteine ad andare nel nucleo. Trovo un positivo e questa interazione avviene e ho che il reporter viene trascritto. Può accadere che YFP sia una proteina del nucleo e va bene ma a può essere una proteina del mitocondrio. Se mando a nel nucleo interagisce con YFP ma normalmente non si incontrerebbero mai. Costringo i due partner a finire nello stesso compartimento cellulare. Es. ho un plasmide esca e uno preda e posso mettere l'esca in presenza di diversi plasmidi preda che contengono diverse parti della proteina. Interazione proteina-proteina Posso identificare i domini di interazione proteina-proteina. Per conoscere il tipo di interazione posso rompere l'interazione se essa ha un significato fisiologico. Uso il reverse two hybrid che serve per identificare i mutanti che perdono l'interazione che sto studiando. Lo scopo è di trovare mutanti che non sono capaci di interagire e chiedermi così cosa succede se la cellula esprime questo mutante. Ho un plasmide che contiene YFP,DBD,AD. So che quando YFG e la proteina a interagiscono ho espressione del reporter. Voglio trovare una mutazione in una delle due proteine che faccia perdere l'interazione. Devo usare un reporter contro-selezionabile cioè selezionare per quelli che non lo esprimono. Quando aggiungo FOA ho che esso entra nella via metabolica dell'uracile e se la cellula ha ura3 attivo prende il FOA,lo trasforma in un composto letale e la cellula muore. Se la cellula è ura- il FOA entra nella cellula ma essa continua a vivere. Questa tecnica usa come reporter ura3. Prendo il ceppo e se lo piastro su terreno che contiene FOA il ceppo è morto. Ura3 è espresso e il ceppo è morto. Se ci sono mutanti in cui l'interazione tra le due proteine è persa,ura3 non è espressa e le cellule fanno colonie. Posso prendere il plasmide preda e sottoporlo a mutagenesi,lo piastro su FOA e ottengo colonie che hanno perso l'interazione perchè hanno accumulato delle mutazioni nel gene a che fanno saltare le interazioni. Sequenzio il gene mutato e verificare se ci sono mutazioni che hanno fatto perdere l'interazione. Se uso un ceppo di lievito selvatico posso vedere ad es. se assume un fenotipo particolare o smettere di crescere. Posso quindi valutare se l'interazione ha un significato fisiologico o meno. il two hybrid non basta per dire che le proteine interagiscono. E' una forte indicazione ma devo confermarlo in qualche altro modo. Devo fare una dimostrazione biochimica perchè il two hybrid è un sistema genetico!! One hybrid Ho isolato il promotore di un gene che mi interessa e voglio sapere quali sono le proteine che si legano a questo promotore. Voglio sapere verosimilmente quali sono i fattori trascrizionali che controllano il gene che mi interessa. Oppure posso avere uno dei geni di replicazione e mi chiedo quali proteine vanno ad attaccarsi alle origini di replicazione e troverò le proteine che servono per

12 controllare l'inizio della trascrizione. Nel sistema one hybrid c'è uno solo ibrido,un reporter,cdna+ad. Quale cdna si lega alla sequenza che mi interessa? Se ne trovo qualcuna ho che si porta dietro l'ad che attiva a sua volta lacz. La cellula esprime quindi lacz. Non viene usata l'esca. Altri screening per l'interazione proteina-proteina 1) con anticorpi specifici 2) con proteine specifiche: visto 3) IVEC Anticorpi specifici: Discutiamo come faccio a clonare quando ho in mano un anticorpo. In alcuni casi ho un paziente che produce l'anticorpo e posso isolarla dal paziente. In altri casi ho la proteina e posso isolare il gene corrispondente. Posso sequenziare la proteina e dà qui andare a trovare il gene oppure posso prendere questa proteina dal topo. Gli anticorpi li prelevo dal sangue. Devo prima purificare l'anticorpo perchè non voglio usare un siero che contenga anticorpi contro diverse proteine ma solo quello che mi interessa. Prendo la proteina che ho messo nel topo,attacco la resina sulla colonna e ho che gli anticorpi specifici si attaccano alla resina. Faccio passare il siero e ho che resta attaccato solo l'anticorpo di interesse. Lavo la colonna,stacco l'anticorpo dall'antigene usando una soluzione con ph tra Lo recupero e lo tampono riportandolo a ph neutro. Come trovo il gene che mi interessa? Si usa un fago λ gt11 che consente di esprimere gli inserti che hanno il fago. Λ ha un sistema di infezione molto efficiente e non devo nemmeno lisare le colonie come invece faccio in coli. Λ gt11 ha una sequenza lacz clonata a valle del sito di restrizione e metto l'inserto che si va ad infilare in frame o meno con lacz. Quando l'inserto entra ho che inattiva lacz e i fagi producono una βgal inattiva. Può accadere che: il gene entra e scassa βgal oppure va in frame e produce la proteina di fusione. Altra cosa importante è il gene di coli 857 che è temperatura sensibile: a 32 la proteina è attiva e la cellula fa il ciclo lisogenico. Si mettono le cellule su IPTG che induce l'espressione di lacz. Metto sulla piastra un filtro di carta,sollevo e ho che faccio una replica delle colonie sulla carta. Il filtro lo bagno con IPTG. Quando lo vedono diventano blu se l'inserto è andato in frame. Sposto le cellule a 39 e lisano. Ho sul filtro delle proteine anziché delle colonie. Posso fare western e ho che l'anticorpo riconosce solo la posizione in cui è presente la proteina.* Significa che quella colonia ha il fago con il gene che codifica per la proteina di interesse. E' importante perchè se infetto con il fago ricombinante le cellule ho che da una cellula ottengo molte cellule ricombinanti. Se la cellula fa subito il ciclo litico la cellula è infettata,produce molti fagi ma poi lisa e non produce più nulla. Voglio invece amplificare il fago quindi il 1 passaggio è quello lisogenico. Quando voglio fare lisare le cellule sposto la temperatura a 39 ho che il fago passa dal ciclo lisogenico al ciclo litico e lisa le cellule. Durante il ciclo lisogenico ho però fatto una colonia che ha espresso il genoma del fago e quindi ha espresso anche la mia proteina. Ho una colonia piena di proteina con l'inserto. Voglio esprimere una libreria di inserti con questo fago! Quando accendo la lisi ho che le cellule rilasciano sulla piastra la mia proteina. Il sistema funziona perchè io creo il fago e ho quindi fagi ricombinanti e non. Per distinguerli si usa il sistema del lacz perchè questo sistema è basato sul fatto che vado a prendere solo le colonie che diventano blu cioè solo dove si è formata la proteina di fusione. Se si è formata significa che l'inserto è espresso perchè non ha un promotore. Se l'inserto entra fuori frame ho che interrompe lacz ma non viene espresso. Se entra in frame ho che il promotore quando è acceso trascrive e fa la proteina di fusione. L'inserto è una proteina di fusione con lacz e le cellule sono blu e stanno esprimendo l'inserto. * western blotting: ho delle proteine sul filtro di nitrocellulosa,si satura il filtro di proteine non specifiche usando di solito latte in polvere. Si mette l'anticorpo 1 che riconosce la proteina che mi interessa e si attacca solo dove è presente l'antigene. Si lava il filtro per togliere l'anticorpo in eccesso. Si deve evidenziare questo anticorpo attaccato e si mette l'anticorpo 2 che riconosce l'anticorpo 1. L'anticorpo 2 ha attaccato un sistema di rilevazione infatti è coniugato con la perossidasi. Questo enzima va a trovarsi esattamente dove è la mia proteina di interesse. Devo dare

13 un substrato alla perossidasi che lo processa ed emette fotoni. Il substrato è luminolo e lo trasforma emettendo fotoni. Sulla lastra radiografica vedo dove si trova il gene. IVEC: permette di identificare un gene quando conosco qualche attività della proteina corrispondente. Es. ho un substrato di una proteasi e so che c'è una proteasi nella cellula che taglia questo substrato e voglio clonare il gene che taglia questo substrato. Devo prendere una libreria di espressione e prendere i vari cloni e andare a vedere se c'è ad es. un'attività chinasica che fosforila il mio substrato. IVEC consente di identificare il gene che codifica per una proteina quando conosco qualcosa di questa proteina. E' un approccio sistematico per clonare geni sulla base della proprietà biochimica. Significa in vitro expressing clonign. Prima accadeva di prendere la libreria di cdna,si trasferiva in coli,si induce l'espressione della libreria,si prendono le cellule,si fanno estratti di proteine e si fa un saggio biochimico di ogni estratto. Si mette ogni estratto insieme al substrato che conosco e ci si chiede se c'è una proteina in quell'estratto che sa fosforilare il substrato. Questa cosa si fa per tutti i cloni della libreria di espressione. Ora questo sistema è abbreviato usando un sistema di espressione in vitro. Quando devo esprimere un gene ho il cdna con il promotore e ho che il cdna è riconosciuto dai fattori di trascrizione che reclutano l'rna polimerasi e producono un mrna. Esso è riconosciuto dai ribosomi che lo traducono in una proteina. E' possibile ripetere questo sistema in una provetta senza passare dalla cellula. Per farlo si usa un promotore di T7 che trascrive ad alti livelli. Si trova a valle del cdna e nella provetta metto tutto ciò che alla cellula serve per trascrivere: RNA pol di T,nucleotidi,magnesio,ATP,tampone a ph controllato,sale. Incubo a 37 e ho che dal cdna vengono sintetizzati mrna. Il sistema ha trascritto. Se all'mrna metto ribosomi,amminoacil-trna,magnesio,atp,buffer,sali ho che il sistema dà la proteina. Posso anche mettere aa marcati e ottengo una proteina marcata. Questo sistema non è molto efficiente ed è molto costoso. Si parte da una libreria di cdna non amplificata,si fanno pool di cloni (da ad es pool fatti da 100 cloni). Si ha che ogni clone è abbastanza rappresentato perchè ho ad es. 1 clone ogni 100 anziché 1 ogni E' meglio che l'attività rappresenti l'1% anziché l'un per mille. Faccio solamente 1000 saggi. Ogni provetta è sottoposta a trascrizione e traduzione in vitro. Si fa un saggio biochimico buttando dentro ad es. il substrato della chinasi e si ha che la chinasi sarà in una di queste provette. Almeno una queste provette dovrebbe avere un risultato positivo. Ho però 100 proteine dentro. Si fa un processo di nome deconvoluzione: riprendo la provetta,separo i 100 cdna in 10 provette da 10 cdna l'uno. Troverò una provetta positiva. Risultato: 1000 saggi provetta positiva divisa in 10 provette e ho fatto 10 saggi divisa in altre 10 ho fatto 1020 saggi e ho trovato il clone. E' ovvio che devo avere un saggio facilmente realizzabile. Es. SDS-page: sistema usato per studiare le modificazioni post-traduzionali delle proteine. Vedo una banda che si sposta quindi se la banda sparisce vedo l'attività delle proteasi. Ho una proteasi a e voglio trovare il suo substrato: con l'aggiunta della proteasi ho che la banda che sparisce è probabilmente il substrato perchè la proteasi se l'è mangiata. Es. IVEC: identificare quali sono le proteine importanti per fare la mitosi. Si sa che le cellule normalmente fanno un ciclo cellulare G1-S-G2-M e il passaggio è regolato in modo molto fine da alcune chinasi. Si sa che perchè la mitosi sia fatta serve un'attività chinasica. Qualcuno dei substrati della chinasi deve essere fosforilato per fare avvenire la mitosi. Si vanno a cercare le proteine mitotiche fosforilate dalla chinasi. Ci sono + di 50 proteine fosforilate in modo specifico durante la mitosi e sono riconosciute dall'anticorpo MPM-2. Ne riconosce tante. Si fanno pull da 100 cdna,incubo con l'estratto proteico e ho che qualcosa si fosforila se lo incubo con l'estratto mitotico. Non accade su incubo con l'estratto interfasico. Vedo la fosforilazione in base al cambiamento di mobilità elettroforetica. Sull'SDS page ho che la proteina non fosforilata migra in una certa direzione che dipende dalla sua massa mentre la proteina fosforilata viene rallentata. Forse visto che il gruppo fosfato ha una carica negativa e l'sds maschera le cariche superficiali dando una carica negativa a tutte le proteine ho che se la proteina è + negativa lega meno SDS e quindi si sposta di meno nel gel. La fosforilazione spesso causa lo shift mentre in altri casi non si vede nulla.

14 Ci sono dei controlli: positivo e negativo. Si ha che da questo screening hanno tolto 20 cloni cioè 20 proteine che sono substrati della chinasi mitotica. Devo verificare che gli estratti funzionino cioè che l'estratto mitotico sia vivo. Uso una proteina che si sa essere fosforilata dall'estratto mitotico ma non dall'estratto interfasico. Questo è un controllo positivo. E' stata aggiunta questa proteina purificata e ho che si muove in modo diverso in base a cosa la incubo. Mi dice che il saggio funziona e l'estratto mitotico è attivo. Il controllo negativo è che uso una proteina che sia che non cambia movimento in base agli estratti. Faccio il saggio con i pool e ho che una certa banda cambia cioè mi dà risultato positivo. Si fa la deconvoluzione e si sono identificati i cloni positivi. Oppure si può usare un saggio contenente MPM-2. Vedo se questo anticorpo trova qualcosa nell'estratto mitotico o interfasico. Fa un ulteriore controllo con l'm+cip. Tolgo la fosforilazione per vedere se la banda si sposta o resta dove era prima. C'è infine un controllo definitivo: vedo nella cellula se le proteine sono veramente fosforilate in mitosi. Prendo cellule in interfase,liso e faccio il western. Prendo le cellule in mitosi,liso e faccio il western. Vedo come shiftano. Si cercano proteine note che hanno una sequenza simile. Si fa un analisi trascrizionale per vedere dove i geni vengono espressi. Mi dice se è espresso e come è espresso,dove è espresso e quando/quanto è espresso,con quali altri geni è espresso. Per capire la funzione del gene I metodi che si usano sono: northern blotting,fusioni con la βgal,pcr quantitativa,microarrays. 1) Northern blotting: si guarda l'rna e separo l'rna chiedendomi se in questa cellula il gene che ho è espresso o no. Prendo le cellule,preparo l'rna,separo l'rna con un gel denaturante in modo che l'rna sia totalmente lineare e si separi in base alla dimensione. A me interessano gli mrna. Trasferisco su un filtro,saturo il filtro con DNA di sperma di salmone. Vedo una banda che corrisponde all'mrna del mio gene e so in che cellule è espresso. Se confronto cellule diverse so se questo gene è + o meno espresso. Uso dei pannelli cellulari oppure pannelli di tessuti e vedo dove è espresso il gene. Solo il northern può dirmi quanto è grande il messaggero e che forma di splicing c'è. 2) PCR quantitativa: il DNA è amplificato da reazioni a catena della DNA polimerasi. Dopo ogni turno di amplificazione, il DNA è quantificato. I metodi comuni di quantificazione includono l'uso delle colorazioni fluorescenti che intercalano con il DNA doppio-filamento (ds) e gli oligonucleotidi modificati del DNA (denominati sonde) che sono fluorescenti una volta ibridati con un DNA. Spesso la PCR real-time è combinata con la PCR retro trascrizionale per quantificare i livelli di espressione di specifici RNA: la retro-trascrizione produce del DNA complementare a singolo filamento detto cdna (complementary DNA) mantenendo inalterati i rapporti relativi di concentrazione delle diverse specie degli RNA. In questo modo è possibile, ad esempio, misurare l'espressione relativa di un gene ad un tempo particolare, o in una cellula o in un tipo particolare di tessuto. La combinazione di queste due tecniche è spesso denominata RT-PCR quantitativa. Questa tecnica ermette di valutare la quantità di stampo presente ed è un sistema quantitativo, sensibile, specifico e riproducibile. Serve per valutare il prodotto dell'amplicone monitorando la fluorescenza emessa durante la reazione. L'amplicone è proporzionale allo stampo solo nella fase esponenziale di una PCR normale. In generale si ha che nella PCR vedo se c'è o meno la banda e quanto è grande. Nella PCR real time si ha che il range dinamico è + ampio e sono in grado di vedere quante molecole ci sono (questa tecnica non dà informazioni sullo splicing). Si ha che la molecola è fluorescente solo quando si intercala. Vengono usate sonde fluorescenti multiplex. Se invece viene amplificato tutto si ha una contaminazione aspecifica e si usano primer che si appaiano a tutti e due i geni e posso distinguerli. Controllo negativo: non deve dare prodotto. Nel grafico si devono avere delle curve che salgono: queste indicano il n di molecole stampo durante la reazione. Come intercalante si usa subr green che però non elimina i problemi di aspecificità. Le sonde fluorescenti sono usate per misurare il prodotto accumulato. Serve usare una sonda che posso appaiarsi al prodotto e anche dei primers. Il primer deve avere: delle code che si appaiano tra di loro e che quindi sono complementari;delle estremità marcate (fluorocromo);un quencher che si eccita con la

15 lunghezza d'onda del fluorocromo ed emette un'altra lunghezza d'onda. Il quencher serve quindi a spegnere il segnale del fluorocromo. Si ha che l'appaiamento porta ad avere il quencher da un lato e il fluorocromo dall'altro. Si ha quando quando i primer si appaiano al prodotto quencher e fluorocromo si allontanano. Con la sonda elimino il problema della aspecificità. E' possibile anche inserire due sonde diverse. Le sonde taqman servono per aumentare la specificità della RT-PCR. Il principio della sonda TaqMan si basa sull'attività esonucleasica 5'-3' della Taq polimerasi. Ho che la DNA polimerasi mangia l'oligonucleotide solo se esso è appaiato davanti a lei. Quando i nucleotidi non sono + appaiati leggo la fluorescenza solo quando la polimerasi sta mangiando. 3) Microarrays: è costituito da un insieme di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida come vetro, plastica, o chip di silicio formanti un array (raggruppamento). Tali array sono usati per esaminare il profilo d espressione di un gene o per identificare la presenza di un gene o di una breve sequenza all'interno di una miscela di migliaia di geni. Per studiare gli mrna, essi vengono prima estratti dalle cellule, convertiti in cdna, con l uso di un enzima chiamato trascrittasi inversa e allo stesso momento marcati con una sonda fluorescente. Quando si fa avvenire l'ibridazione fra la sonda presente sulla matrice e il cdna target, quest'ultimo rimarrà legato alla sonda e può essere identificato semplicemente rilevando la posizione dove è rimasto legato. Vedo dove è il segnale fluorescente: metto sul filtro la sonda non marcata e ci vado sopra con l'mrna marcato. Negli spotted microarrays, i probe sono oligonucleotidi, cdna o piccoli frammenti prodotti con la tecnologia PCR corrispondenti a mrna. Questo tipo di microarray sfrutta l ibridazione di DNA con cdna da due campioni comparati (es. paziente e controllo), che sono marcate con due differenti fluorofori. I campioni possono essere miscelati e ibridizzati in un singolo microarray e quindi analizzati, permettendo la visualizzazione dei geni up-regolati e down-regolati contemporaneamente. I microarrays si possono anche utilizzare per piastrare una libreria specifica. Gli svantaggi sono che l'array è limitato a un tessuto e l'array è sbilanciato. Quindi nei cdna microarrays: scelgo i cloni; li amplifico; li spotto su un substrato solido (circa cloni a vetrino); marco il cdna derivato dall'mrna; faccio ibridare la sonda con il cdna. I limiti sono: quantità di sonda richiesta e normalizzazione e riproducibilità del dati. Non è possibile usare una marcatura radioattivi perchè i segnali radioattivi si sovrapporrebbero tra loro. I vantaggi sono: Sono applicabili a qualsiasi sistema Hanno costi molto inferiori Sono più flessibili nella progettazione Si basano su ibridazione tra sequenze lunghe e quindi sono meno suscettibili a problemi di crossibridazione e meno sensibili a polimorfismi DNA chips I chips sono fatti di silicio a cui gli oligonucleotidi sono legati covalentemente. Per ciascuna ORF ci sono 20 oligon con un match e 20 con un dismatch. La sonda completa per un gene è costituita da 20 aree distinte, così ogni gene deve essere identificato in modo molto stringente da ben 20 sonde (identificando così anche varianti di splicing del gene). Inoltre per evitare l'ibridazione aspecifica ogni area è fiancheggiata da un'area di controllo. Mi aspetto che tutti i 20 oligon diano un segnale +: se in uno non c'è ho un'ibridazione aspecifica. Se il segnale è positivo è moloto probabile che il gene sia espresso. I 20 con un mismatch mi indicano quanto è specifico il segnale. Gli oligonucleotidi sono sintetizzati così da sinistra a destra: OH in posizione 1 5'ATC...GGC3' OH in posizione 2 5'TAT...CATC3' OH in posizione 3 5'CGG...GATG3' Gli OH sono protetti da un gruppo fotosensibile e non sono esposti. In posizione 3 ho ad es. che non passa il raggio e l'oh resta chiuso. Incubo con una soluzione di dctp che si attacca in 1 e 2 ma non in 3. I chip sfruttano una proprietà importante del DNA, ossia l'appaiamento tra basi complementari (la T si appaia con la A e la G con la C) nella sua struttura.mi serve una G al 1 e al 3. Mi serve una T al 2 e al 3.I vantaggi sono che vengono sintetizzati sul chip con densità è alte e che sono

16 sicuro di quanti oligon siano sintetizzati. Preparazione del campione: si usa arna che è RNA amplificato. Si usano da 0,2 a 2 μg di RNA. Si usano gli oligon+promotore di T7 per fare il cdna. Cioè si retrotrascrive in vitro l'mrna a cdna. L'ibridazione DNA-RNA è + stabile e si può usare questo sistema anche quando si ha poco mrna. Gli arna sono pieni di biotina che interagisce con avidina e in ogni posizione dell'mrna piazza una molecola di fluorocromo verde. Il DNA viene marcato con biotina. Incubo mrna amplificato con il fluorocromo verde o rosso: verde per la cellula sana e rosso per la cellula malata. Il colore indica dove è espresso un particolare gene. Faccio + cicli di trascrizione e posso togliere tutto l'rna che voglio. Ho maggior riproducibilità perchè i chip sono uguali per tutti i laboratori. Ripeto mettendo a sinistra il rosso e a destra il verde e uso questo come controllo perchè il colorante potrebbe influenzare l'esperimento. Risultati: i punteggi indicano l'affidabilità del segnale. Se ho una variazione significativa del 2X dico che quel gene è sovraespresso. Dopo l'analisi si fa un clustering cioè si raggruppano i geni in gruppi simili tra loro dividendoli in base al profilo trascrizionale. Geni appartenenti allo stesso cluster hanno profili trascrizionali simili e quindi potrebbero avere funzioni simili. I vantaggi del DNA chips sono: Consentono di ottenere una maggiore densità Includono sequenze non necessariamente presenti nel cdna Sono altamente riproducibili Contengono controlli mismatch Non richiedono apparecchi dedicati per la produzione degli array Producono dati che sono comparabili tra gruppi diversi Drug discovery Pathway biochimico coinvolto in un processo patologico e si possono cercare molecole che legano/modificano l'attività di tali enzimi. -drug discovery I: possibile quando abbiamo i geni,isolare proteine omologhe e testarle su target simili,mutagenesi sito-specifica -drug discovery II: identificare possibili geni target,vedere i pathway alterati,microarrays sulle molecole Caratterizzazione del gene/ proteina La creazione di mutanti si può fare per: mutagenesi per delezione, RNAi, mutagenesi random in vitro o mutagenesi sito specifica. La mutagenesi di solito si fa per irraggiamento (raggi x o gamma), mutagenesi chimica (EMS),inserzionale cioè tramite trasposoni. Più mutageni do più muoiono e si fa una mutagenesi al 50% di letalità (aumento la frequenza di mutazione di circa per). Mutagenesi per delezione: Cosa succede se manca la funzione codificata dal gene nella cellula? Mutagenesi per delezione significa eliminare completamente o quasi la sequenza codificante dal genoma. In caso di lievito ho in mano la sequenza del gene e so che questo gene è presente nel genoma. Voglio eliminare questo gene dal genoma e devo sostituirlo con una cassetta che contiene un marcatore selettivo. Serve per capire se questo gene è stato deleto o no. Si sfrutta il fatto di avere una ricombinazione omologa efficiente. Se in lievito metto un frammento di DNA lineare che è omologo al gene ho che viene integrato grazie a 2 eventi di ricombinazione omologa (uno da un lato e l'altro dall'altro). Le estremità del DNA lineare sono ricombino-geniche. La formazione della singola elica è + facile se ho estremità libere che vanno a cercare la regione omologa e ho ricombinazione. Questo sistema non funziona quasi mai in mammifero. La cassetta + classica codifica per la resistenza al G418. Le cellule di lievito normalmente muoiono se le metto su una piastra contenente G418. Se contengono quel marcatore selettivo KAN posso far crescere le cellule su G418. Posso sequenziare il gene e identificare le estremità del gene che mi interessano. E' lì che voglio far avvenire la ricombinazione. Disegno 2 primer per PCR che contengano la regione 1 e la regione 2 che sono le regioni di

17 omologia con il gene che voglio distruggere. Devono essere capaci di appaiarsi sul plasmide standard che contiene la cassetta KAN. Ho dei primer ibridi con una parte che si appaia su KAN e una parte che si appaierebbe su YFG. Dall'altra parte ho un primer che si appaia su KAN e una coda che si appaia su YFG. Faccio la PCR e ottengo un prodotto che contiene la cassetta KAN e da un lato contiene la sequenza 1 mentre dall'altro la sequenza 2. Quando trasformo le cellule di lievito ho che la sequenza terminale è molto ricombino-genica e va a trovare il suo omologo,dall'altra parte avviene l'altro evento di ricombinazione di YFG che è dove c'è la sequenza 2. Ottengo un cromosoma che sostituisce YFG con KAN. YFG verrà degradato mentre KAN viene integrato al posto di YFG. Questo è un processo molto efficiente e dipende dalla localizzazione cromosomica del gene (se si trova in una cromatina molto compatta è difficile che ricombini) e dalla lunghezza delle estremità (se sono troppo lunghe l'evento di invasione non è facilitato). La coda omologa può essere lunga al max 40 nucleotidi in lievito per ottenere una ricombinazione molto efficiente. Voglio ora andare a vedere se queste cellule ha un fenotipo. Per vedere quelle che hanno integrato su KAN seleziono con G418 perchè KAN è mantenuto dalla cellula solo se si integra. Devo fare un controllo e utilizzo il Southern blot. Devo guardare il locus della wt e della cellula trasformata e chiedermi se sono uguali o diversi e se questo locus diverso contiene la cassetta KAN. Se prendo il DNA genomico di una cellula wt e lo taglio con un enzima e so dove taglia perchè conosco la sequenza di questo locus ---//-----(//YFG)-----//-- Separo su un gel di agarosio,trasferisco il DNA separato sul filtro di nitrocellulosa e faccio un'ìbridazione con una sonda specifica per queste regioni. Mi aspetto di trovare una banda di 500 pb e una di 1500 bp: ---//-----(KAN)-----//-- non si vede il 2 frammento perchè non c'è + YFG in mezzo e vedo una banda diventata 2kb. Mi dice che tra wt e mutante c'è una differenza. L'evento di trasformazione ha modificato YFG. Se faccio una sonda per YFG non vedrei nessuna banda cioè non so se ha ibridato o meno. Se vedo bianco non è un risultato! Può accadere che sia salto il sito di restrizione. Per vedere se c'è l'estratto KAN prendo una sonda su KAN. L'ibridazione con il KAN mi dice esattamente se KAN c'è o meno. Prendo quindi un enzima di restrizione che taglia in punti precisi di KAN dato che conosco la sequenza di KAN. E' un sistema che mi permette di ricostruire esattamente la banda di restrizione del locus e posso quindi sapere se la banda è di YFG o di KAN. L'altro sistema + rapido è quello di usare la PCR. Prendo un primer: //a----(yf//bg)----//d----- wt --//a----(//ckan)----//d----- Se faccio una PCR con la coppia a e b ho che nel wt mi aspetto un segnale con una dimensione definita da a a b. Se faccio la PCR sul mutante non trovo nulla quindi faccio un controllo con ac. Nel wt non vedo nulla mentre in KAN sì, se faccio la PCR con ad nel wt vedo la banda 1200 kb ad esempio mentre in KAN 800 kb. Usare ad ha senso solo se wt ha una dimensione diversa KAN. Ad ibrida sia sul wt che sul mutante. A volte succede che KAN si integri nel posto sbagliato. Si controlla che tutto vada bene. La mutazione per delezione si fa su un ceppo aploide ed è sempre recessiva (del diploide non vedo la mutazione). Questo esperimento non è possibile farlo per tutti i geni: non posso farlo con i geni essenziali. 1 SISTEMA per studiare i geni essenziali Per studiarli devo fare la delezione nel diploide ----(POL1)---- wt ----(KAN)---- Faccio sporificare e ottengo 2 spore con la sequenza wt e 2 spore con la sequenza mutante. Le spore con la sequenza mutante però muoiono. Per sapere cosa succede alle cellule se perdono POL1 devo trasformare il ceppo con un plasmide che porta POL1 e un marcatore selettivo ura3. Queste cellule avranno una copia di POL1 sul cromosoma,una copia deleta di POL1 e una copia di POL1 sul plasmide associata al marcatore ura3. Faccio sporificare il diploide e ottengo 2 spore con il cromosoma POL1,2 spore con il cromosoma deleto KAN. Questo plasmide è andato a caso un po' di qua e un po' di là. Le possibili combinazioni sono: wt sul cromosoma che se ne va con il plasmide,wt che se ne va senza il plasmide,gene mutato che se ne va con il plasmide,gene mutato che se ne va senza plasmide. Abbiamo queste 4 spore: POL1 sul cromosoma-pol1 + plasmide;

18 POL1-POL1 senza plasmide; KAN sul cromosoma-pol1 con il plasmide; KAN sul cromosoma e nessun plasmide. La 1 spora è viva perchè ha POL1 sul cromosoma,la 2 spora è viva perchè ha POL1 sul cromosoma,la 3 è viva perchè ha POL1 sul plasmide,la 4 è morta. Metto su G418 e vedo che la 3 è l'unica che vive,verifico se ha dentro ura3 e ce l'ha per forza. Questa è la spora che mi interessa. Prendo la cellula e faccio crescere un litro di queste cellule. Gli do FOA e ho che questo facilita la perdita del plasmide e ho che POL1 va via. Quando do il FOA favorisco solo le cellule che hanno il plasmide. Voglio vedere, in mezzo alle cellule che non crescono + perchè non hanno + POL1, come si bloccano. La cellula senza plasmide cresce un po' fino a quando c'è la proteina poi smette di crescere. Nel caso di una proteina richiesta per l'inizio della replicazione mi aspetto che queste cellule si accumulino tutte in G1 (come cellule non gemmate). Ipotizzo quindi che le cellule abbiano problemi nella sintesi del DNA. 2 SISTEMA per studiare i geni essenziali: Uso i mutanti condizionali: mutanti che in condizioni permissive non esprimono la mutazione e in condizioni non permissive esprimono la mutazione. I più noti sono quelli temperatura sensibile. La temperatura permissiva in lievito è 25 mentre la restrittiva è 37. Il problema è che abbiamo in mano un gene. Queste mutazioni rendono + instabile la struttura della proteina: quando alzo la temperatura salta qualche legame e la proteina si unfolda e spesso viene degradata. E' stata sviluppata una tecnologia in lievito. Si crea dei mutanti usando il degrone cioè qualcosa che induce la degradazione. Quello che voglio fare è eliminare la proteina essenziale e vedere cosa succede alle cellule. Si può spegnere l'espressione del gene ed eliminare l'mrna e vedere cosa succede. Sistema un po' lento: se la proteina è stabile si ha che l'esperimento dà risultati sfalsati. Se spengo ad es. pol α ci vogliono 7 generazioni prima che le cellule muoiano. L'altro sistema è di far fuori la proteina ed è quello che fa il mutante Ts. Per fare ciò si usa il degrone. L'obiettivo è avere un costrutto del genere: abbiamo il gene che codifica per pol α e voglio avere una fusione con il degrone. La scatola contiene la sequenza di una molecola di ubiquitina e un pezzo di DHFR che Ts. Queste sequenza quando è tradotta produce un pezzo di DHFR che a 25 è ok mentre a 37 perde il folding. In DHFR ci sono due residui di lisina. Per fare questo costrutto esiste una cassetta che può andare ad essere integrata per ricombinazione omologa. Anziché integrare KAN integro questa cosa. Faccio esprimere il gene a temperatura permissiva e ho una proteina di fusione che si porta DHFR e l'ubiquitina. L'ubiquitina viene usata dalla cellula come una molecola che dà diversi tipi di segnale: si sa che regola la degradazione delle proteine. La degradazione funziona così: c'è un enzima che trova una lisina nella proteina e gli attacca una molecola di ubiquitina. Se questa proteina deve essere degradata si ha che questa molecola di ubiquitina diventa una catena di poliubiquitine. E' una catena + o ramificata. Per degradare una molecola di proteina servono molte molecole di ubiquitina. La cellula deve fare in modo di riciclare le ubiquitine. La cellula ha un sistema che ogni volta che trova una proteina con attaccata un ubiquitina nel modo corretto, ricicla l'ubiquitina staccandola. La cellula recupera l'ubiquitina e se la porta via. La poliubiquitinazione è un segnale degradativo. Può interessare la lisina 48 o 63 e ha un significato degradativo o regolativo. La cellula cerca di riciclare quelle che non sono K63. L'ubiquitina nella cellula è sintetizzata come una molecola con diverse ripetizioni di ubiquitine. Quando trova una ubiquitina fusa ad un'altra proteina la taglia. Si ha che la cellula trascrive una ripetizione di geni dell'ubiquitina e la proteina di fusione prodotta la taglia a pezzettini. Quando vede l'ubiquitina che è parte di una proteina di fusione la stacca. Le proteine di solito iniziano con AUG, però qui si ha che l'ubiquitina è stata staccata e si ha che resta fuori un residuo di arginina. La stabilità di una proteina dipende dal residuo ammino-terminale. L'arginina in N-terminale è la + destabilizzante. La cellula si prepara a degradare la proteina. Lo scopo è fare degradare rapidamente la proteina di interesse. La scatoletta davanti che si mette destabilizza la proteina di interesse. Perché funzioni la poliubiquitinazione ci devono essere delle lisine a cui andare ad attaccare le ubiquitine. Qui le lisine sono nascoste. Quando sposto le cellule a 37 ho che il dominio DHFR perde il folding (è Ts) e le lisine vengono esposte. Arginina e lisine esposte: la cellula degrada la proteina e piazza quindi la poliubiquitina. La proteina viene subito degradata. Il sistema del degrone non può essere usato per tutti i geni e non

19 tutte le proteine sono degradate così efficientemente. Knock out Si usa questa tecnica quando voglio andare a vedere cosa succede nell'animale. Devo eliminare il gene quando voglio analizzare la funzione del gene ad es. nello sviluppo dell'animale. Se voglio fare un knock out devo eliminare un esone ---E1---E2---E3 Si inattiva ad es. l'esone 2 dal locus genico della cellula e sostituirlo con un marcatore selettivo. Questo è l'unico modo che abbiamo per selezionare le cellule che hanno eliminato l'esone da quelle che non l'hanno eliminato. Si usa un marcatore Tk (timidina chinasi). Si fa un costrutto che contiene l'esone 1,la cassetta per la resistenza all'antibiotico e la regione 3. Negli eucarioti superiori si ha una bassa efficienza di ricombinazione. Le cellule di topo sono sensibili a G418 ma resistenti a Gancyclovir. La sensibilità a Gancyclor è dovuta al fatto che è un analogo della timidina ed entra nelle cellule,se c'è la timidina chinasi questa fosforila il Gancyclovir pensando che sia timidina. Il Gancyclovir fosforilato è diventato un nucleotide trifosfato e può entrare nella biosintesi degli acidi nucleici. E' però un composto tossico e si ha che la cellula muore. Questo costrutto che devo trasfettare nelle cellule di topo porta un gene Tk che fornisce sensibilità a Gancyclovir e la resistenza a G418. Ho un marcatore di selezione e un marcatore di contro-selezione. Se cioè do G418 seleziono le cellule che hanno dentro tutto il costrutto mentre se do timidina chinasi seleziono le cellule che non hanno dentro tutto il costrutto intero o comunque Tk. Questo sistema del Gancyclovir è importante perchè io trasfetto le cellule in topo,il DNA entra nella cellula e va ad integrarsi + o a caso nel genoma. ---E1---E2---E3 se il costrutto si va ad integrare a caso ho una cellula che contiene sia la copia wt del gene che la copia che manca delle due. Le cellule di partenza sono: se dò G418 sono sensibili perchè le cellule di partenza non hanno nessun costrutto. Se le trasfetto e il costrutto si infila a caso nel genoma ho che le cellule diventano resistenti a G418: Tk---E1---NEO---E2. Se si integra nel punto giusto tra E1 ed E3 ho E1---NEO---E2 ho che il pezzo Tk è stato exciso e ha tirato dentro NEO. Queste cellule sono G418 resistenti. Se uso solo la resistenza al G418 riesco sì a distinugere le cellule trasfettate da quelle non trasfettate ma non riesco a distinguere le cellule che hanno fatto ricombinazione omologa da quelle che non l'hanno fatta. Tutte sono G418 resistenti ma se do Gancyclovir ho che le cellule wt sono resistenti perchè non hanno la timidina chinasi mentre le altre sono sensibili perchè hanno dentro la timidina chinasi. Posso selezionare le cellule che mi interessano con G418 e Gancyclovir e seleziono le cellule che hanno fatto ricombinazione omologa. Devo fare controlli con Souther e PCR per verificare che la cassetta si sia infilata nella regione 2. Prendo le cellule staminali embrionali del topo,introduco il costrutto e seleziono le cellule che hanno fatto l'evento di ricombinazione. Queste cellule vengono impiantate in una blastocisti di un topo femmina. Queste blastocisti viene impiantata in una madre surrogata in cui è stata simulata una gravidanza anche se non ha una blastocisti di su. Vengono prodotti dei topi: non sono topi omozigoti. E' una chimera cioè solo alcune cellule hanno la mutazione che abbiamo messo mentre le altre non ce l'hanno. Alcune cellule vanno a finire nella linea germinale e portano la mutazione. Possiamo usare queste cellule germinali x fare un altro incrocio. Si deve verificare che la chimera porti la mutazione nella linea germinale. Se c'è abbiamo alcune cellule con la delezione e altre cellule che non la portano (è una chimera). Facciamo incrociare questo topo con un topo normale e otteniamo alcuni topi eterozigoti (delezione/wt). Vogliamo ottenere gli omozigoti dagli eterozigoti e quindi dobbiamo fare un altro incrocio. Dobbiamo incrociare 2 eterozigoti tra di loro: voglio ottenere l'omozigote che porta la delezione e ottengo il topo knock out. Se il gene è essenziale il topo knock out è morto ma se il gene è importante nello sviluppo ho che il topo muore in utero. Se l'omozigote si ferma posso studiare comunque il fenotipo dell'embrione che non ha terminato lo sviluppo. Topo knock out condizionale: il topo contiene la sequenza codificante intera e si sviluppa normalmente. Posso chiedermi cosa succede se faccio perdere la funzione al gene. Il sistema funziona così:

20 ---E1---E2---E3 E1---//lox/---NEO---E2---//lox//---E3 La modificazione che voglio ottenere è questa: sostituisco l'e2 con l'e2+neo attaccandogli di fianco questi due siti lox. Sono sequenze corte che sono riconosciuti in modo specifico dalla ricombinasi cre. Se NEO è un marcatore,c'è lox e lox ho che la ricombinasi fa avvenire una ricombinazione in maniera sequenza specifica. Il prodotto sarà un cromosoma che ha perso il NEO. ---//-----lox------// voglio un topo in cui l'esone 2 è circondato da siti lox finchè il topo non vede la ricombinasi cre. Questa modifica il genoma del topo. L'utilità di questo sistema è che posso decidere quando far saltare via E2 durante il ciclo di sviluppo del topo e vedere la funzione del gene di interesse. Posso prendere queste cellule e dargli cre solo ad es. nel cervello per vedere l'effetto della mutazione in un organo. Devo fare un altro incrocio per dare cre alle cellule. Il topo deve avere nel suo genoma il gene cre sotto il controllo di un promotore regolabile ON/OFF. Normalmente è tenuto spento ma quando voglio far excidere E2 dò al topo l'induttore del promotore. A me interessa che sia sempre spento e che possa essere acceso. Ho che la ricombinasi cre viene espressa e taglia E2. Questo topo esprime quindi la mutazione (ho fatto la trasfezione). Questo promotore può essere la tetraciclina. In base alla sostanza che do il promotore si accende o si spegne. Oppure posso mettere un promotore specificamente espresso in un determinato organo. Oppure è possibile usare una ricombinasi flip che rovescia nel modo corretto E2. Vedo cosa succede quando il gene non c'è,faccio fare il flipping e vedo cosa succede quando ridò il gene. RNAi Questo sistema si usano nelle cellule in coltura. Il principio è quello di cercare di eliminare l'espressione di un gene. Voglio vedere cosa succede alle cellule se quel gene non è espresso. Anziché andare a togliere la sequenza dal genoma cerco di togliere l'mrna. L'RNAi cancella l'mrna. Il gene trascrive,produce mrna ma è eliminato e la proteina non dovrebbe essere fatta. Non impedisco l'espressione del gene perchè il gene è comunque trascritto. Quanto funziona bene l'rnai dipende da quanto è trascritto il gene o da quanto velocemente è degradata la proteina. A volte accade che con l'rnai si elimina totalmente la proteina oppure viene ridotta. Devo sapere quanto era efficiente l'rnai. Se abbiamo una cellula con YFG e questa cellula accumula RNA a doppia elica che contiene la sequenza YFG,questo RNA a doppio elica causa la repressione dell'espressione di questo gene. YFG viene trascritto in un mrna che va a dare YFP,se butto dentro l'rna ottengo -YFP. E' inibita l'espressione del gene. Il sistema funziona perchè quando la cellula vede l'rna a doppia elica la cellula cerca di degradarlo. Interferisce con l'espressione genica a livello post-trascrizionale. Il trascritto viene fatto,l'rnai deve mangiare questo trascritto ma se questo trascritto gira nella cellula qualche minuto prima di essere mangiato e ce ne è tanto riesce ad iniziare ad essere tradotto. Se è tradotto si ha che un po' di proteina viene fatta se ad es. i codoni sono molto frequenti. Se questa proteina è molto stabile abbiamo che la funzione del gene è svolta nella cellula. Se la trascrizione è invece lenta,si fa poco mrna e l'rnai se lo va a mangiare subito si ha che l'mrna non viene tradotto. Oppure ne è tradotto poco la proteina è instabile e si ha che la cellula muore. Il tutto dipende da come viene trascritto e tradotto il gene,dalla stabilità della proteina e da come faccio l'rnai. In C. elegans ci sono gli sirna e gli shrna. Nello small interference RNA vengono usate corte sequenze di RNA oppure shrnai in cui si usano gli sirna. Si fa in modo che nella cellula entrino o vengano prodotte queste molecole che causano la degradazione dell'rna. Se ho cellule in coltura faccio la trasfezione in cui butto dentro un shrna. C. elegans è un verme e io devo intingerlo nella provetta che contiene RNA interferenti e si ha che l'rna entra nelle cellule ed è trasmesso in tutte le cellule di C. elegans. RNA entra e va ad inibire i miei YFG. Oppure posso anche prendere un plasmide T7 e trasformarlo in coli si ha che la polimerasi di T7 viene trascritto e ottengo tante molecole di sirna. Coli si riempie di queste molecole di sirna,faccio una patina di coli e ci butto sopra i vermi. Questi mangiano coli e mangiano anche gli sirna. Queste molecole raggiungono tutte le cellule e l'espressione del gene viene inibita. Il vantaggio di questo sistema è posso fare degli screening usando le library di sirna. Faccio un ceppo di coli che esprime sirna che inibisce YFG1 o YFG2. Metto il verme e vado a