Gli interferenti endocrini nelle acque

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1 Gli interferenti endocrini nelle acque I metodi di rilevazione e le ricerche per l abbattimento dei nuovi inquinanti: dalle sostanze stupefacenti ai derivati dalla cosmesi. Atti convegno - 24 settembre 2010 Castello Estense - Ferrara

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3 Sommario Introduzione Franco Sami Direttore settori ciclo idrico e distribuzione gas Hera S.p.A. Le ricerche sugli interferenti endocrini Massimo Ottaviani Direttore Reparto igiene delle acque interne Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria - Istituto Superiore di Sanità Laura Achene Reparto igiene delle acque interne Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria - Istituto Superiore di Sanità La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera Ettore Zuccato Responsabile laboratorio tossicologia della nutrizione Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri - Milano Interferenti endocrini migranti dalle bottiglie in PET Daniela Reali Professore ordinario Dipartimento patologia sperimentale Università di Pisa I monitoraggi effettuati nel territorio di Hera Luciano Agostini Responsabile Laboratori Hera S.p.A. Claudio Anzalone Responsabile Ricerca e Sviluppo Hera S.p.A. Le prospettive di ricerca nel territorio e nell ecosistema Po Ivano Graldi Direttore ATO 6 Ferrara Luigi Viganò Primo Ricercatore Istituto di Ricerca sulle Acque (IRSA CNR) Aspetti ecotossicologici e tossicologici degli interferenti endocrini Annamaria Colacci Responsabile cancerogenesi ambientale e valutazione del rischio ARPA Emilia Romagna Conclusioni Maurizio Chiarini Amministratore Delegato Hera S.p.A

4 Introduzione Il 24 settembre del 2010, nella bella cornice della Sala Imbarcadero del Castello Estense di Ferrara, si è svolto un confronto serio, approfondito e sereno su un tema difficile. Il merito va ai relatori, a tutti i partecipanti e al Gruppo Hera che ha organizzato il convegno. Affrontare l argomento degli interferenti endocrini una particolare classe dei cosiddetti contaminanti emergenti nelle acque risulta infatti difficile per la complessità scientifica dell argomento, per la necessità di un approccio multidisciplinare, per le risorse professionali ed economiche necessarie ad approfondire la conoscenza di questa tematica. Ma è difficile anche perché la serenità necessaria a portare avanti questa complessa attività tecnico-scientifica rischia di essere contaminata e qui il termine sembra proprio essere quello giusto da polemiche e strumentalizzazioni che facilmente sorgono nel nostro Paese quando si prova ad indagare su argomenti collegati alla qualità dell ambiente e alla salute di tutti noi. Emergono facili scetticismi, verità precostituite, volontà di sfuggire ai confronti sui dati e sui fatti, ricerca del sensazionalismo. Purtroppo siamo chiamati qualche volta a dare risposta a diversi interventi, amplificati in alcuni casi da poco opportuni passaggi mediatici, che in maniera piuttosto superficiale destano allarmismi riguardo alla qualità dell acqua erogata dalle reti d acquedotto in varie parti d Italia. Alcuni di questi interventi hanno ad oggetto proprio qualcuno dei cosiddetti contaminanti emergenti di cui si è discusso a Ferrara. 2

5 Il termine contaminanti emergenti sta ad indicare proprio una conoscenza non compiuta e la necessità, quindi, di approfondimento e di confronto, cose che devono essere fatte con competenza scientifica, ma anche con onestà intellettuale. Credo che il convegno di Ferrara sia stato innanzitutto una testimonianza della costante attenzione del Gruppo Hera verso i temi della qualità dei prodotti e dei servizi che eroga ai propri clienti e una testimonianza di attenzione alla qualità ambientale e alla sicurezza. Ciò richiede necessariamente il costante aggiornamento scientifico dei propri tecnici ed operatori e la capacità di introdurre innovazione tecnologica nei processi gestiti. Non è del resto scontato che un gestore di servizi pubblici impegni professionalità e risorse su questi temi che rimangono comunque temi di ricerca e di innovazione tecnologica e che richiedono ancora molti sforzi per tradursi in prassi operative correnti. Potrebbe apparire sufficiente distribuire acqua avente i requisiti di qualità fissati dalla legge cosa peraltro puntualmente garantita dal Gruppo Hera senza alcuna deroga, e lasciare alle Autorità competenti il compito di fare gli approfondimenti scientifici necessari a far evolvere la normativa di settore. Per gli amministratori e i lavoratori del Gruppo è, invece, naturale impegnarsi in attività come quella di cui si è parlato a Ferrara, perché è frutto di un impostazione culturale proiettata verso il futuro, impostazione voluta e attesa dai soci e dai cittadini dei nostri territori. Franco Sami Direttore settori ciclo idrico e distribuzione gas Hera S.p.A. 3

6 Le ricerche sugli interferenti endocrini Massimo Ottaviani e Laura Achene Reparto igiene delle acque interne Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria - Istituto Superiore di Sanità Introduzione Gli interferenti endocrini (Endocrine Disrupters o EDs) sono un gruppo di sostanze chimiche, sia naturali che sintetiche, presenti nell ambiente, sospettate di alterare la funzione del sistema endocrino e, conseguentemente, di causare effetti avversi sugli organismi. In occasione del European Workshop on the Impact of Endocrine Disrupters on Human Health and Wildlife, che si è tenuto a Weybridge, in Inghilterra nel 1996, è stata concordata dalla comunità scientifica internazionale, questa definizione: Una sostanza che altera il sistema endocrino è una sostanza o una miscela esogena che agisce sulle funzioni del sistema endocrino, provocando di conseguenza effetti negativi per la salute di un organismo intatto, della sua progenie o delle (sotto)popolazioni. La Environmental Protection Agency degli Stati Uniti (USEPA) ha adottato la seguente definizione: Gli Endocrine Disrupters (EDs) sono composti chimici che interferiscono con le funzioni del sistema endocrino. Il National Research Council (NRC, USA 1999 ) ha proposto la definizione di Composti ormonalmente attivi (hormonally active agents) definiti come agenti che dimostrano attività ormono-simile. Le sostanze che possono, o potrebbero, alterare il sistema endocrino sono raggruppabili in sostanze di origine naturale, quali gli ormoni naturali, che comprendono gli estrogeni, il progesterone e il testosterone, naturalmente prodotti nell organismo umano o animale, ed i fitoestrogeni, sostanze contenute in alcune piante (ad esempio la soia), che, se ingerite, esercitano un attività analoga a quella degli estrogeni. Inoltre, possono comprendere sostanze sintetizzate dall uomo, quali gli ormoni di sintesi, utilizzati come contraccettivi orali, le sostanze impiegate nella terapia sostitutiva degli ormoni e alcuni additivi per mangimi, concepiti espressamente per interferire sul sistema endocrino, modulandone la funzionalità; composti utilizzati per usi industriali (ad esempio alcuni detergenti industriali), agricoli (alcuni antiparassitari) e per alcuni prodotti di consumo (ad esempio additivi per sostanze plastiche), e derivati dai processi industriali, come le diossine. Per quanto riguarda il meccanismo di azione, queste sostanze sembrano interferire sul funzionamento del sistema endocrino agendo almeno a tre livelli: simulando l azione di un ormone naturale, inducendo così reazioni chimiche analoghe a quelle normalmente prodotte ma al tempo sbagliato o in grado eccessivo (effetto agonistico); bloccando i recettori delle cellule che riconoscono e si legano agli ormoni (recettori ormonali), impedendo, così, la normale azione solitamente esercitata dagli ormoni naturali (effetto antagonistico); interferendo sulla sintesi, sul trasporto, sul metabolismo e sull escrezione degli ormoni naturali. 4

7 Fino ad oggi, in base alle osservazioni raccolte sull uomo e negli animali, l attenzione è stata rivolta soprattutto allo studio di quelle sostanze che possono avere effetti sugli ormoni che regolano lo sviluppo e la riproduzione, vale a dire gli ormoni steroidei (estrogeni ed androgeni) prodotti nelle gonadi. Gli ormoni steroidei agiscono, insieme ad altri ormoni, sulla riproduzione, sul comportamento sessuale, sulla differenziazione, sullo sviluppo e sulla maturazione fetale. Recentemente si è osservato che gli EDs possono agire anche sulla funzionalità tiroidea, soprattutto per quanto riguarda il suo ruolo nei processi dello sviluppo. Altri effetti sul sistema immunitario e sul sistema nervoso trovano qualche riscontro, ma non è ancora chiaro il meccanismo da cui essi derivino. Modalità di esposizione agli EDs L esposizione dell uomo agli interferenti endocrini avviene attraverso diverse vie. La fonte principale è rappresentata dagli alimenti. Solo in piccola parte contribuirebbero il consumo di acqua potabile, la respirazione e il contatto. Le stime compiute, soprattutto dell esposizione ad EDs con effetto estrogeno, hanno messo in risalto che le situazioni ipotizzabili (di esposizione da inquinamento ambientale) corrispondono a frazioni minime delle dosi a cui vengono somministrati gli anticoncezionali, antiabortivi, chemioterapici. Inoltre, salvo il caso di una somministrazione terapeutica di ormoni, il maggior apporto di EDs con effetto estrogeno proviene da estrogeni naturalmente presenti negli alimenti. La dose di esposizione assume notevole importanza; livelli elevati di un ormone possono esercitare un azione inibitrice, mentre livelli molto bassi possono avere un effetto stimolante. La dose non è, tuttavia, l unico fattore da prendere in considerazione. Occorre non trascurare molti altri aspetti come l assorbimento, il metabolismo, l escrezione, il bioaccumulo, e possibili interazioni di miscele di ED simultaneamente ingeriti. Anche il momento dell esposizione riveste una grande importanza poichè esistono periodi più critici rispetto ad altri, come quello precedente e corrispondente alla nascita o l inizio della pubertà, con conseguenti effetti reversibili (sulla maturazione) o irreversibili (sulla differenziazione). 5

8 Presenza degli interferenti endocrini nelle acque destinate al consumo umano Nel corso dell ultima decade, considerevoli quantità di risorse scientifiche ed economiche sono state impiegate per chiarire i potenziali rischi per la salute umana derivanti dagli EDs, presenti negli alimenti e nell acqua destinata al consumo umano. Per quanto riguarda l acqua, l Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), la Comunità Europea (CE) e l Environmental Protection Agency degli Stati Uniti (USEPA) hanno proposto importanti iniziative e vasti programmi di ricerca. Negli USA il problema degli EDs è stato affrontato fin dal 1996, quando nella legge Safe Drinking Water Act /SDWA) erano previste azioni per accertare gli effetti sul sistema endocrino delle sostanze chimiche e degli antiparassitari. All USEPA era affidato anche il compito di mettere a punto un programma volto ad accertare se gli effetti sull uomo degli EDs fossero paragonabili a quelli degli ormoni naturali (USEPA 2005). Dal canto suo la Commissione Europea, nell anno 2000, ha commissionato uno studio a due enti di ricerca tedeschi: il Fraunhofer IME (Institute for molecular biology and applied ecology) e l ESWE (Institute for water research and water technology), allo scopo di fare il punto sulle conoscenze in merito alla presenza degli EDs nelle acque da destinare e destinate al consumo umano e sulle possibili conseguenze dell esposizione della popolazione europea a queste sostanze. Lo studio si è concluso nel 2003 con la stesura di un rapporto finale comprendente numerosi dati bibliografici, dati forniti dalle Autorità dei Paesi Membri, e dei relativi acquedotti, raccolti mediante un apposito questionario e gli esiti di un monitoraggio in quattro acquedotti campione. I risultati della ricerca possono essere così sintetizzati: presenza di pesticidi con possibile attività di ED in acque profonde e superficiali usate per il consumo umano anche a concentrazioni superiori a 0,1 µg/l. I più frequenti pesticidi in acque naturali e in quelle destinate al consumo umano sono risultati: atrazina, simazina, diuron, isoproturon e lindano; presenza di tribultilstagno (composto organostannico) in acque superficiali; presenza di bisfenolo A ed alchilfenoli nelle acque superficiali ed in acque distribuite da acquedotti a livelli di alcuni ng/l, mentre gli alchilfenoli (octil- e nonilfenolo) erano presenti solo nelle acque superficiali; presenza di estrogeni naturali e sintetici in tracce nelle acque superficiali. Attività e normative nazionali e internazionali relative agli Interferenti Endocrini La Commissione Europea ha finanziato numerosi progetti, a partire dal Quarto Programma Quadro di Ricerca e sviluppo tecnologico ( ), per proseguire nel Quinto ( ) diversificando i temi di ricerca (organi e tessuti diversi dal sistema riproduttivo, sviluppo di sensori per il rilevamento degli ED e nuovi metodi di analisi in vivo (animali transgenici) ed in vitro, sugli effetti protettivi dei fitoestrogeni per il cancro e l osteoporosi, con particolare attenzione per l esposizione a basse dosi per lunghi periodi e per esposizioni multiple). E stato anche realizzato un sito WEB (http://europa.eu.int/comm/research/endocrine/index_en.html) dedicato alle ricerche sugli ED ove sono indicati tutti i siti dedicati a questo tema. Nel 2001 sono state gettate le basi per un progetto comune, il CREDO, che ha iniziato la 6 Le ricerche sugli interferenti endocrini

9 sua attività nel Questo progetto interessa 63 laboratori in Europa ed è coordinato dal progetto EDEN, uno dei quattro progetti di ricerca fondamentali del CREDO (gli altri sono COMPRENDO, EURISKED, FIRE). I quattro progetti di base coprono, sinteticamente, i seguenti temi: EDEN (ricerca di nuovi parametri, esposizione, effetti di basse dosi e di miscele nell uomo, nella fauna acquatica ed animali da laboratorio); EURISKED (valutazione del rischio complessivo di alcuni EDs); COMPRENDO (ricerca comparativa sugli EDs, approccio filogenetico e principi comuni di composti con effetti Androgeni/Antiandrogeni; FIRE (valutazione del rischio da ritardanti della fiamma bromurati, sospettati di essere interferenti endocrini per l uomo e animali selvatici). Nel VI programma quadro di ricerca e sviluppo tecnologico ( ), il tema degli EDs è specificatamente incluso nella Priorità 5 (Qualità e sicurezza degli alimenti) e nella Priorità 6 (Sviluppo sostenibile, Cambiamenti globali ed ecosistemi). Nel febbraio 2004 in questo contesto è stato lanciata una vasta Rete di Eccellenza (CASCADE) per la ricerca, la valutazione del rischio, l educazione e l informazione riguardante i composti con attività di interferente endocrino nella catena alimentare. Le azioni a lungo termine comprendono una rivisitazione e un adattamento della legislazione esistente relativa ai test per l identificazione degli EDs, la valutazione e le modalità d impiego dei prodotti chimici della CE. Per quanto riguarda la normativa, il 1 giugno 2007 è entrato in vigore il REACH - Rettifica del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio del 18 dicembre 2006, con l obiettivo di razionalizzare e migliorare il precedente quadro legislativo in materia di sostanze chimiche dell Unione europea. Il REACH istituisce, inoltre, l Agenzia europea per le sostanze chimiche (ECHA) che svolge un ruolo centrale di coordinamento e di attuazione nell intero processo. Fra le sostanze che richiedono elevata attenzione (PBT: persistenti, bioaccumulanti e tossiche) sono comprese quelle aventi caratteristiche di ED. La Direttiva 2000/60/CE del 23 ottobre 2000, che istituisce un quadro per l azione comunitaria in materia di acque, nell allegato VII, punto 4, riporta: Sostanze e preparati, o i relativi prodotti di decomposizione, di cui è dimostrata la cancerogenicità o mutagenicità e che possono avere ripercussioni sulle funzioni steroidea, tiroidea, riproduttiva o su altre funzioni endocrine connesse nell ambiente acquatico o attraverso di esso. Gli Stati membri dovevano far pervenire entro la fine del 2009 i dati di esposizione umana agli EDs attraverso l ambiente idrico per istituire un programma per i bacini idrici da rendere operativo nel La Direttiva 76/464/CEE (inquinamento provocato da certe sostanze pericolose scaricate nell ambiente idrico, è stata abrogata, con decorrenza dal 22 dicembre 2013, dall articolo 22 7

10 della direttiva 2000/60/CE (ad eccezione dell articolo 6 che è abrogato a decorrere dal 22 dicembre 2000). Per quanto riguarda la Direttiva 98/83/EC per le acque destinate al consumo umano, essa non prevede valori di parametro per la categoria degli EDs in generale; alcuni composti o gruppi di composti per i quali è stata riconosciuta attività di interferenti endocrini, come gli antiparassitari sono regolamentati in base a direttive della CE. Si sta lavorando invece sul problema del rilascio di EDs da materiali a contatto con l acqua (contenitori, tubazioni, etc). A tutt oggi non esiste una normativa nazionale italiana, in tema di acque, specifica per gli interferenti endocrini. A questo proposito si ricorda che la Direttiva 98/83/CE, recepita in Italia dal D.L. 31/2001, cita nelle premesse gli interferenti endocrini, considerando che, pur non esistendo attualmente sufficienti certezze su cui basarsi, per fissare valori parametrici a livello comunitario per i prodotti chimici nocivi per il sistema endocrino, è sempre più forte la preoccupazione per il potenziale impatto sugli essere umani e sulla fauna e flora selvatiche. Nel 2007 è stata avviata la revisione della Direttiva 98/83/CE. Dai lavori della Commissione emerge che gli EDs saranno controllati mediante l approccio dei Water Safety Plans, che hanno come scopo la tutela della salute, basata sul monitoraggio di queste sostanze lungo tutta la filiera produttiva, dalla captazione alla distribuzione e sulla valutazione del rischio. A marzo 2010 si è svolta a Parma la Quinta Conferenza Ministeriale Ambiente e Salute, in cui si sono riuniti i ministri e i rappresentanti dei 53 Stati membri della regione europea dell Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Per la prima volta si è parlato di interferenti endocrini a difesa delle categorie più a rischio, come i bambini e le donne in gravidanza. Il nostro progetto di ricerca Il nostro Reparto di Igiene delle Acque Interne del Dipartimento di Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria dell Istituto Superiore di Sanità è impegnato in un progetto di ricerca che riguarda lo studio degli Interferenti endocrini e le acque destinate al consumo umano, promosso e coordinato dalla Fondazione AMGA Onlus e dal Dipartimento di Scienze della Salute dell Università di Genova. La finalità è quella di approfondire lo stato delle conoscenze sul potenziale impatto degli interferenti endocrini sui sistemi idrici per la produzione e distribuzione di acque da destinare al consumo umano nel contesto nazionale. Lo studio coinvolge altri Istituti di Ricerca (le Università di Pisa e di Genova, la Fondazione Mario Negri) e alcuni acquedotti (Bologna, Firenze, Genova, Torino) con possibilità di integrazione da parte di altre strutture. Il coinvolgimento di tutte le parti interessate alla sicurezza della risorsa idrica consente di organizzare una task force sul particolare problema degli interferenti endocrini. Sulla base dei risultati del Rapporto europeo del 2003 l attenzione iniziale è stata focalizzata su alcune sostanze quali bisfenolo A, alchilfenoli, 17-alfa-etinilestradiolo, 17-beta-estradiolo, estrone e successivamente, in considerazione del crescente interesse nazionale ed internazionale, anche su numerosi 8 Le ricerche sugli interferenti endocrini

11 composti perfluorurati. Questi ultimi, insieme ad altri residui di erbicidi e prodotti farmaceutici, sono stati rilevati di recente anche in Italia in acque superficiali e potrebbero rappresentare un potenziale rischio per le acque da destinare al consumo umano. L attività fino ad ora svolta ha creato una solida base per la rivelazione analitica delle sostanze, la valutazione sull efficacia dei trattamenti e la potenziale esposizione per la salute umana; ha contribuito ad armonizzare criteri e metodi di intervento ed accrescere il livello di conoscenza sul tema in diversi gruppi di interesse. Inoltre ha dimostrato, sebbene i dati siano ancora preliminari, che tracce di EDs possono riscontrarsi in acque da destinare e destinate a consumo umano e che le concentrazioni degli analiti di interesse determinate nelle acque esaminate indicano l assenza di rischio per la salute. Riferimenti bibliografici Decreto Legislativo 2 febbraio 2001, n. 31. Attuazione della direttiva 98/83/CE relativa alla qualità delle acque destinate al consumo umano Gazzetta Ufficiale n. 52, 3 marzo 2001 Direttiva 2000/60/CE del Parlamento Europeo e del Consiglio 23 ottobre Quadro per l azione comunitaria in materia di acque Gazzetta Ufficiale delle Comunità Europee n. L 327/1, 22 dicembre 2000 European Workshop on the Impact of EndocrineDisrupters on Human Health and Wildlife Weybridge (2-4/12/1996) Wenzel A., Müller J. and Ternes T. Study on endocrine disruptors in drinking water Final Report Fraunhofer IME and ESWE,

12 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera Ettore Zuccato Dipartimento Ambiente e Salute Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri - Milano Contaminanti emergenti nelle acque Negli ultimi anni si è stabilita tra Hera e Istituto Mario Negri una fattiva collaborazione in merito ad alcuni settori relativi alla salvaguardia ambientale e alla sicurezza del consumatore. In particolare, la collaborazione ha riguardato lo studio e l approfondimento di alcuni inquinanti emergenti che, prodotti dall uomo e riversati nell ambiente tramite le acque di scarico, potrebbero arrivare a contaminare le acque superficiali e di falda, col rischio di inquinare anche quelle potabili. Gli inquinanti maggiormente approfonditi nell ambito degli studi comuni sono stati i farmaci terapeutici e le sostanze stupefacenti presenti nelle acque reflue e superficiali. Recentemente è iniziata una nuova collaborazione su un ulteriore argomento: i composti perfluorurati nelle acque superficiali e potabili. Da dove vengono i farmaci? L inquinamento da farmaci è un problema ambientale emergente. La letteratura scientifica indica che essi possono essere considerati inquinanti ubiquitari, che contaminano l ambiente attraverso una miriade di canali diffusi. I pazienti (farmaci per uso umano) e gli animali, (farmaci veterinari), sono considerati la principale fonte d inquinamento. Lo smaltimento improprio contribuisce all inquinamento ambientale, così come gli scarichi dell industria e gli smaltimenti illegali. Fonti principali: Trattamenti terapeutici nell uomo e nell animale 10

13 Farmaci: vie di ingresso nell ambiente Il paziente è la fonte principale d inquinamento riguardo ai farmaci ad uso umano. Una volta somministrati, essi non sono metabolizzati e possono essere escreti, come tali o in forma di metaboliti attivi, con urine o feci. Nelle acque fognarie raggiungono i grandi depuratori urbani, che sono costruiti per degradare sostanze chimiche molto semplici, non i farmaci. La loro diffusione in acqua avviene, quindi, senza ostacoli. I principi attivi non vengono rimossi totalmente dai depuratori e si riversano in fiumi e laghi, fino al mare, contribuendo ad un in inquinamento diffuso dell ambiente. FARMACI Somministrati ai pazienti Residui dei farmaci escreti con urine o feci Smaltimento improprio Inquinamento industriale IMPIANTO DI TRATTAMENTO ACQUE FOGNARIE Inquinamento industriale Acque depurate contengono ancora farmaci Fanghi contengono farmaci Inquinamento fiumi e laghi Inquinamento falde acquifere 11

14 Prioritizzazione dei farmaci come contaminanti ambientali Il riconoscimento di questo nuovo problema ambientale ha dato il via a studi per stabilire quanto sia diffuso, quali siano le sue dimensioni e le possibili implicazioni per l ambiente e la salute. I primi studi hanno seguito una logica casuale. Venivano raccolti campioni di acque e si provava, con vari metodi, a vedere quel che si trovava, cercando di identificare, quasi a caso, alcune molecole nell ambito delle migliaia potenzialmente presenti. Si sono, poi, utilizzati metodi più sistematici, ricercando farmaci pre-selezionati: quelli ritenuti più rilevanti in base a calcoli di probabilità, che combinavano dati sui volumi di vendita o di prescrizione a dati di metabolismo e tempi di persistenza ambientale delle sostanze. Metabolismo nell uomo (% escrezione come composto di origine) Carico di vendita (prescrizioni) Carico ambientale previsto Selezione di molecole con più grande carico Destino di persistenza nell ambiente Lista teorica di farmaci in ordine di priorità Lista ricercata di farmaci in ordine prioritario 12 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

15 Prescrizioni e carichi ambientali previsti (2002) I carichi ambientali sono stati ottenuti dalle prescrizioni, correggendo per la percentuale dei farmaci escreti come sostanze parentali. Tramite il calcolo dei carichi ambientali teorici, ottenuti moltiplicando i quantitativi venduti di ciascun farmaco per la sua percentuale di metabolizzazione, è possibile identificare una serie di farmaci prioritari per l ambiente, che generalmente sono sempre rilevati nelle acque di scarico e di fiumi e laghi. In queste acque, i farmaci sono presenti in concentrazioni relativamente basse ma sempre preoccupanti, trattandosi di sostanze attive specificatamente disegnate per suscitare risposte nell uomo e nell animale. Pharmaceutilcals Prescription (ton. active sustance) % Excration as parent compound Predicted envirovmental loads (ton.) Amoxycillin % 125,75 Atenolol % Hydrochlorothiazide % Ranitidine % Clarithromycin % 8.47 Ceftriaxone % 5.93 Furosemide % 5.76 Bezafibrate % 3.80 Ciprofloxacin % 2.96 Enalapril % 1.47 Spiramycin % 1.02 Omeprazole % 0.67 Erythoromycin % 0.39 Ibuprofen %

16 Lista di farmaci prioritari per monitoraggi e studi di eco tossicologia (Castiglioni et al. 2005) Ecco, ad esempio, una lista di farmaci selezionata nel 2005 mediante l approccio fondato sul calcolo dei carichi ambientali teorici, basato sui dati di vendita in Italia. Ai farmaci selezionati in questo modo se ne sono poi aggiunti altri, selezionati in base all attività biologica. Si ottiene, così, una lista di farmaci prioritari per le loro potenzialità di tossicità ambientale. Therapeutic class Human Antibiotics Macrolides Lincosamides Chinolons Penicillins Other antibiotics Sulphamides Vetrinary Antibiotics Macrolides Tetracycline Anticancer Anti - infiammatory Bronchodilators Cardiovascular Urologic CNS Drugs Diuretics Gastrointestinal Lipid regulator Opiates Estrogens Natural estrogens Metabolites Pharmaceutical Clarithomycin, Erythomycin, Lincomycin, Spiramycin Ciprofloxacin, Levofloxacin/Ofloxacin Amoxicillin Vancomycin, Teicoplanin Sulphamethoxazole Oleandomycin, Tilmicosin, Tylosin Oxytetracycline Cyclophosphamide, Methotrexate, Tamofixen Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Diclofenac Salbutamol Atenol, Enalapril Sildenafil Carbamazepine, Diazepam Furosemide, Hydrochlorothiazide Omeprazole, Ranitidine Bezafibrate, Atorvastatine, Gemfibrozil Morphine, Codeine 17 α- Ethinylestradiol 17 β - Estradiol, Estrone Clofibric Acid, Demethyl diazepam 14 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

17 Il percorso delle droghe: dal consumatore al depuratore Come i farmaci, anche le sostanze stupefacenti possono inquinare l ambiente seguendo la stessa via di ingresso. Infatti possono essere esecrete come tali o in forma di metabolitiattivi con urine o feci. Insieme alle acque fognarie raggiungono i depuratori che non possono degradarle completamente. La loro diffusione nell ambiente acquatico avviene, quindi, senza ostacoli. Metabolismo della cocaina nell uomo Un esempio delle sostanze che si ritrovano nell ambiente: la cocaina e i suoi metaboliti. 15

18 Metodi analitici Dopo l identificazione dei farmaci prioritari, sono stati messi a punto metodi analitici per la loro misurazione, utilizzando tecniche specifiche e sensibili come la cromatografia liquida abbinata alla spettrometria di massa in tandem. Si è cercata così conferma della loro presenza e si è misurata la loro concentrazione nelle acque dei depuratori urbani e poi in quelle superficiali. Farmaci: 35 composti + 6 deuterated standards Droghe non lecite: 27 composti + 20 deuterated standards (Castiglioni et al., J Chrom A. 2005; Castiglioni et al., Anal. Chem. 2006; Castiglioni et al., Mass Spectrom Rev. 2008; Zuccato et al., Water Res. 2008) Filtrazione (1.6 and 0.45 μm) Estrazione in fase solida (SPE) Estrazione con solvente in ultrasuoni (USE) Oasis HLB and MCX (60 mg) Lichrolut EN (200 mg) HPLC-MS/MS analisi HPLC Colonna: C8-C18 and HILIC phases Spettrometria di massa: Applied Biosystem-SCIEX API 3000 triple quadrupole turbo ion spray source 16 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

19 Destino ambientale dei farmaci in depuratori (STP) e acque di superficie Carichi di una serie di farmaci prioritari sperimentalmente misurati nelle acque reflue non trattate di alcuni depuratori in Italia (freccia azzurra). Summary of loads and removal rates (RR) in STPs and attenuation rates and residual loads in surface water for the most abundant pharmaceutical Pharmaceutical Load in influent (mg/day/1000/ inh) RR in STP (%) Residual load in effluent (mg /day/1000/ inh) Attenuation in river (%) Residual load in surface water (mg/ day/1000/inh) Occurrence in particulate (+/-) Atenolol Ofloxacin Hidrochlorothiazide Furosemnide Cliprofloxacin Ranitidine Ibuprofen Sulfamethoxazole Bezafibrate Enalapril , Clarithromycin Carbamazepine Erythomycin Spiramicin Salbutamol Lincomycin

20 Confronto tra carichi attesi (calcolati dalle prescrizioni a Milano) e carichi misurati (calcolati dalle concentrazioni, STP di Milano) dei farmaci I carichi misurati in entrata sono generalmente prevedibili con calcoli teorici. Ad esempio, per la città di Milano, ecco i carichi di alcuni farmaci prioritari previsti in base alle prescrizioni ottenute dal database della Regione Lombardia (prima colonna). Le prescrizioni, moltiplicate per la percentuale di escrezione metabolica dei vari farmaci, permettono di calcolare i carichi teorici seconda colonna) che corrispondono ai carichi che sono effettivamente misurati nelle acque reflue non trattate del depuratore di Milano. E, così, possibile prevedere il carico dei farmaci in ingresso ad un depuratore. Gruppi sostanze Prescriptions Milan 2005 Expected loads Measured loads (Milan ) mg/day/ 1000 inhabitans mg/day/ 1000 inhabitans mg/day/ 1000 inhabitans Atenolol Atorvastin ,020 Codeine Gemfibrozil Enalpril Sulfametoxazole , Clarithoromycin La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

21 Rimozione dei farmaci in STP Conventional WWTPs: pre-treatment, primary settling and secondary treatment facilities (activated sludge) La percentuale di rimozione dipende anche dall efficienza dell impianto. Nel grafico: la percentuale di rimozione complessiva dei farmaci in vari impianti sul territorio italiano. La rimozione può essere molto differente nei diversi impianti e possono verificarsi importanti variazioni stagionali: in estate le rimozioni sono generalmente superiori perché in parte legate alle temperature ambientali. 39% 31% 64% 57% 16% 0% 8% 69% 4% Naples Cuneo Latina Cagliari Varese Lago Varese Olona S. Antonino (VA) Milan Lugano Rimozione dei farmaci in impianti di trattamento Amoxycillin Ciprofloxacin Removal rate: 30-60% Enalapril Ibuprofen Ofloxacin Atenol Bezafibrate Clofibric acid Furosemide Diazepam Removal rate: 10-30% Carbamazepine Clarithromycin Erythromycin Estrone Lincomycin Spiramycin Removal rate: 0% Hydrochlorothiazide Ranitidine Removal rate: variable Sulphamethoxazole 19

22 Rimozione dei farmaci in impianti di trattamento Nosedo Percentuali recentemente misurate nell impianto di Milano che, essendo di recente costruzione, ha un efficienza di rimozione elevata. Anche in questo caso, però, la rimozione dei farmaci è spesso incompleta. Milano WWTP trattamento biologico + disinfezione (acido peracetico) Portata: m3/d Popolazione residente: Rimozione % Atenolol Atorvastatine Bezafibrate Enalapril Estrone Gemfibrozil Ibuprofen Ketoprofen Methotrexate Naproxen Rimozione 30-80% Ciprofloxacin Clarythromycin Dehydroerythromycin Diclofenac Furosemide Lincomycin Ranitidine Salbutamol Sulphamethoxazole Rimozione < 30% Hydrochlorothiazide Ofloxacin Vancomycin Nessuna Rimozione Carbamazepine Cyclophosphamide Diazepam Demethyl-diazepam Erythromycin 20 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

23 Percentuali medie di rimozione dei farmaci in alcuni depuratori in Italia Confronto tra la percentuale di rimozione complessiva dei farmaci misurata in vari impianti italiani con quella del depuratore di Milano. 100% 80% % rimozione farmaci 60% 40% 20% 0% Naples Latina Cagliari Cuneo Varese Lago Varese Olona (inverno) Varese Olona (estate) Milano Nosedo 21

24 Farmaci nelle acque in ingresso al depuratore di Milano Farmaci Antimicrobici Ingresso (g/giorno) Uscita (g/giorno) Rimozione (%) Amoxicilina 117 <LOQ 100 Vancomicina Ciprofloxacina 36 <LOQ 100 Sulfametossazolo Levofloxacina Lincomicina Ossitetraciclina 19 <LOQ 100 Chemioterapici Metoressato 6.1 <LOQ 100 Tamofixen <LOQ <LOQ - Cardiovascolari Atenololo Enalapril Ipolipemizzanti Gemfibrozil Bezafibrato Atovastatina Diuretici Furosemide Idroclorotiazide Antinfiammatori Ibuprofen 304 <LOQ 100 Gastrointestinali Omeprazolo <LOQ <LOQ - Ranitidina Broncodilatatori Salbutamolo Urologici Sildenafil <LOQ <LOQ - Carichi totali La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

25 Percentuali medie di rimozione dei farmaci nel depuratore di Milano Nosedo Dettagli dei carichi d ingresso e in uscita e della percentuale di rimozione dei vari farmaci, misurati nell impianto di Milano. Ossitetraciclina Metotrexate Ibuprofen Ciprofloxacina Amoxicillina Enalapril Gemfibrozil Bezafibrato Atorvastatina Atenololo Lincomicina Furosemide Ranitidina Salbutamolo Vancomicina Idroclorotiazide Diazepam Sulfamethoxazole Oleandromicina Carichi Totali Rimozione FARMACI % rimozione 23

26 Rimozione dei farmaci in impianti di trattamento Disinfezione con acido peracetico E opinione diffusa che l efficienza finale di rimozione dei farmaci potrebbe aumentare con l uso di trattamenti terziari in coda all impianto. In questo caso si può notare che la disinfezione con acido paracetico nell impianto di Milano può contribuire alla rimozione di alcuni farmaci ma, considerato il carico totale dei farmaci, ha un effetto complessivo molto ridotto (0,3%). Pharmaceuticals Removal biological treatment (%) Removal after disinfection (%) Cyclophosphamide 0 8 Clarythromycin Lincomycin Vancomycin The disinfection with peracetic acid improves the removal rates for few compounds Total removal 74% with an increase after disinfection of 0.3% 24 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

27 Rimozione degli antibiotici- Trattamento UV Stessa cosa vale per il trattamento UV, di cui si vede un esempio relativo all impianto di Varese. Antibiotics Penicilins Influent Concentration (ng/l) Effluent pre UV (% removal a ) Effluent post UV (% removal b ) Concentration (ng/kg) Sludge Amoxicilina 18 nd (100) nd nd Quinolones Ciprofloxacina (71) 148 (0) 2090 L.floxacin/ofloxacin (49) 191 (19) 3408 Macrolideslincosamides Clarithoromicyn (63) 145 (0) 156 Erythromycin (0) 72 (0) 185 Erythromycin H 2 O na na na na Lincomycin (37) 7.2 (0) na Spriramycin (25) 375 (17) 658 Sulphamides Sulfamethoxazole (81) 101 (0) nd Glycopeptides Vancomycin (0) 29 (28) nd Veterinay antibiotics Oleandomycin (0) 3.1 (0) nd Oxytetracycline nd nd nd nd Tilmicosin nd nd nd nd Tylosin nd nd nd nd Behaviour and fate of anitibiotics in the Varese STP na=not assessed; nd=not detectable (concentrations <LOQ) a = difference between the influent and the effluent pre -UV b = difference between the effluent pre -UV and post - UV 25

28 Effetto di UV, H2O2, e ozono sul carico totale di farmaci (effluente impianto di Napoli) Le evidenze sul campo contrastano parzialmente con i dati sperimentali. Almeno alle condizioni di laboratorio i trattamenti con UV, H2 e O2 e soprattutto con ozono sono in grado di rimuovere efficacemente un carico di farmaci contenuto in acque reflue. La discrepanza suggerisce che l uso dei trattamenti terziari sia una strada da percorrere. Molto, però, deve essere ancora fatto per identificare le migliori condizioni per ottenere in impianto il grado di rimozione ottenibile in condizioni di laboratorio Concentrazioni (ng/l) 14000, , ,0 8000,0 6000,0 4000,0 2000,0 0,0 Uscita UV 3 min UV +H202 UV +H202 Ozono 5min Ozono 15 min min min Ozono 20 min Trattamenti effettuati 26 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

29 Concentrazioni di farmaci in acque reflue trattate (uscite di nove STPs in Italia mediane) Concentrazioni di farmaci presenti nelle acque scaricate nell ambiente. ng/l 700 Ozono 15 min Ofloxacin Furosemide Atenolol Hydrochlorothiazide Carbamazepine Ranitidine Ciprofloxacin Sulphamethoxazole Ibuprofen Spiramycin Bezafibrate Erythromycin Lincomycin Clarithromycin Salbutamol Amoxycillin Cyclophosphamide Omeprazole Methotrexate Ethinylestradiol Enalapril Diazepam 27

30 Farmaci: stabilità in acqua I farmaci, secondo le loro caratteristiche chimico-fisiche, vengono più o meno rapidamente degradati o possono persistere a lungo, accumulandosi. Farmaci come eritromicina, ciclofosfamide, naproxene, sulfametossazzolo, sulfasalazina, hanno una vita media nell ambiente superiore ad un anno. Altri, come l acido clorofibrico, principale metabolita del clorofibrato e un tempo usato come ipolipemizzante, ha una persistenza ambientale media di circa 21 anni. Pharmaceuticals Stability in water Comments Amoxicilin t90 <2 d low stability Atenol stable for 40 d (5-25 C) t h ph 7.4 (UV ray) moderate stability Bezafibrate 83% degraded in 6 d in STP low stability Carbamazepine t d prolonged stability Ceftriaxone t h (ph 6, 20 C) low stability Ciprofloxacin Stability > 40 d in closed bottle test t min (xenon lamp 200W/m2) t d in STP moderate stability Clarithromycin t h ph 2, 37 C t min ph 1.39 Excessively acidic conditions Excessively acidic conditions (no data available) Enalapril Stable 56 d (25 C) Stable 91 d (4 C) prolonged stability Erythromycin t 50 1 y 11.5 d (20 C) prolonged stability t 50 3 s ph 1.39 Furosemide Stable 90 d ph 5.2 Stable 96% 240 d ph 5.2 prolonged stability Ibuprofen t 50 < 1 d 90% degraded in 6 d STP low stability Ofloxacin t d moderate stability Omeprazole 70% 1-2 d ph % 14 d ph % > 100 d ph 11 low stability 73% 6d ph 7.0 Ranitidine Stable 160 h ph 6.18, 65 prolonged stability Sulphometaxazole t d low stability 28 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

31 Farmaci: degradazione ambientale Hydrochlorothiazide (+) Spiramycin (+) Clarithromycin (+) Estrone (+) Erythromycin (+) Bezafibrate (+) Atenolol (+) Ofloxacin (+) Furosemide (+) Salbutamol (+) Enalapril (+) Carbamazepine (+) Ibuprofen (-) Lyncomicin (-) Ranitidine (+) Ciprofloxacin (+) Sulphamethoxazole (-) % attenuation 29

32 Farmaci più abbondanti in acque reflue e di superficie in Italia Un monitoraggio continuo è indispensabile allo studio del problema ambientale alla valutazione del rischio, alla programmazione ed alla verifica dell efficacia di interventi migliorativi. Il monitoraggio va attuato su liste di farmaci preselezionati, stabilite in base a criteri previsionali e poi verificate sperimentalmente, andando a misurare le effettive concentrazioni ambientali. Nella tabella si può vedere come una lista di farmaci prioritari possa essere raffinata sperimentalmente, escludendo dai successivi monitoraggi le sostanze che non siano risultate effettivamente presenti. Pharmaceuticals Waste water River water Atenol *** *** Hydrochlorothiazide *** *** Ibuprofen *** *** Ofloxacin *** *** Carbamazepine *** ** Furosemide *** ** Ciprofloxacin *** * Sulphometaxazole *** * Bezafibrate ** *** Erythromycin ** ** Lincomycin ** ** Spiramycin ** ** Clarithromycin ** * Amoxycilion * * Cyclophosphamide * * Sulbutamol * * Ranitidine x * Enalapril x x Ethinylestriadol x x Omeprazole x x Ceftriaxone x x *< 0.01 µg/l ** µg/l *** µg/l (1 µg = 10-6 g) 30 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

33 Farmaci: che tipo di inquinamento? In sintesi: la contaminazione ambientale dei farmaci rappresenta un tipo di inquinamento non convenzionale e non legato ad attività produttive ma che riconosce l uomo o l animale che assumono farmaci come causa principale della contaminazione. Si tratta comunque di sostanze vendute in quantità elevate, differenti tra loro dal punto di vista chimico-fisico, biologicamente attive e presenti in complesse miscele. Possono, quindi, esecitare effetti tossici sull ambiente e potenzialmente anche sull uomo. Quantitavi elevati - Migliaia di tonnellate/anno Gruppo eterogeneo di sostanze Inquinamento continuo Sostanze biologicamente attive Complesse miscele Potenziali effetti tossici Impatto degli antibiotici nelle acque di superficie Il grafico rappresenta un esempio dei livelli di contaminazione che è possibile raggiungere. In Italia, secondo gli studi, si riversano nell ambiente quantitativi pari a 6,9 14,4 tonnellate di soli antibiotici all anno. E, dunque, un tipo di inquinamento relativamente nuovo ma attualmente esaminato in tutto il mondo, causa i potenziali rischi per l ambiente e per l uomo. 400 Amount of antibiotics discharged in the environment per year Effluents Loads g/1000 inh/year Milan Effluents Loads Removal in STP Varese Lugano Como

34 Caratteristiche chimico-fisiche I composti perfluorurati rappresentano un altro recente argomento di collaborazione tra Hera e l Istituto Mario Negri, soprattutto per lo studio di possibili ricadute sulla salute umana causa la loro presenza in acque superficiali e potabili. Tra i composti perfluorurati spiccano per importanza PFOS (perfluorooctane sulphonate) e PFOA (perfluorooctanoic acid). Sono molecole complesse, molto stabili e potenzialmente bioaccumulabili. Surfattanti florurati Estrema stabilità Elevata tendenza al bioaccumulo Tempi di eliminazione per il PFOS superiori rispetto al PFOA PFOS - PFOA Derivano da un inquinamento classico, in particolare correlate alla produzione del teflon e altri fluorobiopolimeri, del goretex e di una vasta serie di altri prodotti e applicazioni. Produzione ed utilizzo PTFE (Teflon) capostipite di tutti i fluoropolimeri Gore-Tex Ampia varietà di prodotti ed applicazioni: Trattamenti impermeabilizzati di pelle e tessuti Trattamenti di rivestimento di carta e cartone Detergenti (tensioattivi), cere per pavimenti; Pitture e vernici Pesticidi e insetticidi Schiume anti-incendio Pellicole fotografiche Trattamenti di superfici metalliche (per diminuire la tensione superficiale) Agenti di sgorgo per tubature. 32 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

35 PFOS - PFOA L esposizione umana a queste sostanze è legata al consumo di alimenti contaminati, soprattutto di origine marina, all utilizzo di posate prodotte con polimeri contenenti sostanze polifluorurate e al consumo alimentare di acque potabili contaminate. Da qui l importanza della verifica delle acque adatte al consumo umano in merito alla presenza di queste sostanze. Metodica per il rilevamento di PFOS e PFOA L analisi viene effettuata con HPLC-MS-MS, metodi altamente sensibili e specifici, unici in grado di rilevare con sicurezza queste sostanze nelle acque destinate al consumo umano. PFOS e PFOA rappresenta un recente argomento di collaborazione tra Hera ed Istituto Mario Negri, che avrà importanti sviluppi riguardo allo studio della presenza di queste sostanze nelle acque potabili e alla messa a punto di medoti efficaci per la loro rimozione. Determinazione strumentale Strumentazione HPLC: Perkin-Elmer Series 200 (autocampionatore e due pompe analitiche) Spettrometro di massa: Applied Biosystem API 3000, con sorgente ESI 33

36 Metodica per il rilevamento di PFOS e PFOA Ottimizzazione delle condizioni analitiche in spettrometria di massa e spettrometria di massa/massa, mediante infusione continua di una soluzione standard (1 ng/µl). Sostanza Ione precursore (m/z) Ione prodotto I (m/z) ed energia di collisione (ev) Ione prodotto II (m/z) ed energia di collisione (ev) PFOS (56) 99 (48) PFOS - 13 C (56) 99 (48) PFOA (15) 369 (4) PFOS - 13 C (56) 372 (4) 34 La messa a punto delle ricerche: la collaborazione con Hera

37 Interferenti endocrini migranti dalle bottiglie in PET Daniela Reali Professore ordinario Dipartimento patologia sperimentale Università di Pisa La ricerca sperimentale applicata allo studio di determinanti ambientali e alimentari di rischio per la salute collettiva, in quanto accertati/ritenuti potenziali deregolatori del sistema endocrino (Endocrine Disruptor Chemicals), è stata finalizzata alla produzione di metodi che consentano di attuare strategie di prevenzione primaria. Per questo, in collaborazione con l Università di Ginevra, è stato sviluppato un test biologico a breve termine in vitro per lo studio della diffusione ambientale e alimentare di xeno biotici, capaci di esprimere azione estrogeno mimetica conseguentemente alla struttura chimica. Il mezzo biologico sviluppato consiste in un microrganismo ingegnerizzato, in grado di esprimere il recettore alfa umano per gli estrogeni. Linea di lievito utilizzata E stata utilizzata la linea di lievito ricombinante RMY326 (His3 Leu2-3, 112 trp1-1 ura3-52/her-trp1-2µ[pg/er(g)], ERE-CYC-LacZ-URA3-2µ[pUCΔSS-ERE], HIS-3CEN/ ARS[pRS423]), auxotrofa per triptofano ed uracile, contenente il recettore α umano per gli estrogeni (herα) inserito nel plasmide pg/er(g), ed un elemento di risposta agli estrogeni (ERE) a monte del gene reporter lacz, che codifica per l enzima β-galattosidasi contenuto nel plasmide PUCΔSS-ERE (Liu et al. 1999). Nel plasmide pg/er(g) è contenuto il gene TRP1 che codifica per un enzima richiesto per la biosintesi del triptofano, mentre nel plasmide PUCΔSS-ERE è contenuto il gene URA3 che codifica per un enzima richiesto per la biosintesi dell uracile. Questi markers permettono la selezione del lievito che li contiene su terreni privi di triptofano e uracile. Mezzi colturali Il mezzo colturale selettivo sintetico viene preparato aggiungendo a 90ml di acqua ultrapura per colture cellulari (SIGMA) 0,67g di yeast nitrogen base, 2% glucosio, 10ml di una soluzione stock 10X di aminoacidi (30mg L-isoleucina, 150mg L-valina, 20mg L-arginina-HCl, 30mg L-lisina-HCl, 20mg L-metionina, 50mg L-fenilalanina, 200mg L-treonina, 30mg L-tirosina in 100ml), 1ml di una soluzione stock 100X di L-istidina-HCl (200mg in 100ml acqua), 1ml di una soluzione stock 100X di L-leucina (1g in 100ml acqua) e una soluzione di adenina emisolfato (200mg in 100ml acqua) con aggiunta di 3g di Agar (OXOID) per i terreni solidi. 35

38 Saggio su lievito (Yeast Estrogen Screen assay) Le cellule di lievito sono conservate in glicerolo al 25% a 80 C. Per l allestimento della coltura, le cellule vengono seminate su piastre di terreno selettivo agarizzato e cresciute per 72h a 30 C. La piastra si conserva a 4 C per 20gg. Per effettuare il test, un pool di colonie viene inoculato in 2ml di terreno di crescita selettivo liquido e incubate a 30 C per 7h in agitazione continua (210rpm). Le colture sono successivamente risospese in terreno di crescita fresco, in modo da ottenere una densità ottica 0.1 (OD600nm). La sospensione di cellule viene dispensata in tubi e incubata a 30 C overnight in presenza di concentrazioni note del controllo positivo (E2), del controllo negativo (solvente) e dei campioni. Attività agonista Per valutare l attività agonista (estrogenica) concentrazioni crescenti dei campioni vengono aggiunte alla coltura di lievito (2μl/2ml) in modo tale che la concentrazione di solvente (MeOH/ DMSO) non ecceda lo 0,1% (v/v). Il solvente è usato come controllo negativo, l ormone naturale 17β-estradiolo (ISS), concentrazione finale 10ppb, come controllo positivo. L induzione della trascrizione dell enzima da parte del complesso recettore-ligando viene misurata mediante spettrofotometro (OD 420 nm). Per ogni campione vengono effettuate tre repliche. Al momento del saggio, le cellule di lievito vengono raccolte mediante centrifugazione e il pellet risospeso in 1ml Z-buffer (60mM Na 2 HPO 4 7H 2 O, 40mM NaH 2 HPO 4 H 2 O, 10mM KCl, 1mM MgSO 4 7H 2 O e 35mM 2-mercaptoetanolo, ph 7.0). Dopo centrifugazione il pellet è risospeso in 150µl Z-buffer. La permeabilizzazione delle cellule è effettuata aggiungendo 50µl di diclorometano e 20µl di 0.1% SDS e agitando per 10s. Per evidenziare la produzione di enzima, 700µl di 2 mg/ml o-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside (ONPG) in Z-buffer vengono aggiunti al mezzo colturale. La coltura è incubata a 30 C per 5min e la reazione bloccata mediante aggiunta di 500µl di 1M Na2CO3. La produzione di enzima β-galattosidasi è misurata mediante assorbanza del campione a 420nm (OD420) (Pinto et al., 2004; Garritano et al., 2006). L attività β-galattosidasica è normalizzata al numero di cellule usate nel saggio ed espressa come Unità Miller utilizzando la seguente formula: Unità Miller = (1000 x OD 420 ) / (t x V x OD 600 ). Dove t rappresenta il tempo di incubazione (min), V il volume della coltura usato nel test (ml). L attività agonista/estrogenica dei campioni viene espressa come Relative Inductive Efficiency (RIE), calcolata come il rapporto tra la massima attività β-galattosidasica indotta da ogni singolo campione e quella indotta dal 17 β-estradiolo (E 2 ) 10 nm x 100. Per una lettura in termini relativamente quantitativi di presenza di composti con attività agonista possiamo esprimere i risultati ottenuti in RIE anche in termini di Estradiolo Equivalenti (EEQs ng/l) utilizzando un modello di corrispondenza (curva dose-risposta 17 β-estradiolo elaborata con Graph Pad Prism 4.0, Graph Pad Inc.) in base al quale sono stati definiti range di attività RIE % e corrispondenti Estradiol Equivalents (EEQs) espressi in ng/l. La sensibilità del saggio è rappresentata dalla minima concentrazione di un composto che ha la capacità di dare una risposta significativamente diversa dal bianco procedurale (tutti i componenti escluso il campione). 36 Interferenti endocrini migranti dalle bottiglie in PET

39 La concentrazione più bassa di 17βestradiolo alla quale si è prodotta una risposta valutabile come positiva (LOD) è stata minore di 1ng/L. L attività antagonista/antiestrogenica esprime la capacità di composti o miscele di essi di antagonizzare il legame del 17 βestradiolo al suo specifico recettore alfa. Se l ormone non si lega al recettore non si attiva il gene reporter che codifica la sintesi dell enzima β-galattosidasi e nel mezzo di coltura non è dosabile l enzima. Per valutare l attività antagonista (antiestrogenica) dei campioni, le cellule di lievito vengono co-trattate overnight in presenza di 17 β-estradiolo (1nM) e di concentrazioni crescenti dei singoli campioni. Viene poi misurata la produzione di β-gal secondo il protocollo. Come controllo positivo è stata utilizzata una coltura cellulare contenente solo 17 β-estradiolo (1nM), come controllo negativo è stata usata una soluzione di tamoxifen a concentrazione finale massima dello 0,2%. La capacità degli estratti di inibire l attività inducibile dall estradiolo, è espressa come inibizione (%) dell attività elicitata dal 17 β-estradiolo 1nM (100%). Per ogni punto sperimentale vengono effettuate tre repliche. Esempio: E 2 1nM = RIE 100 % E 2 + composto = RIE 85 % Questo significa che il composto ha inibito per un 15 % l attività enzimatica inducibile da 1 nm di estradiolo. Usando varie concentrazioni del composto in esame possiamo anche capire se questa attività biologica di tipo antagonista possa essere funzione di una relazione dose-risposta. Come controllo dell attività antiestrogenica è stato usato il 4-hydroxytamoxifen (4-OHT), farmaco antitumorale ad azione antagonista usato in chemioterapia per pazienti affette da tumore della mammella estrogeno dipendente. Il test è stato messo a punto; ne è stata valutata la sensibilità, specificità e la riproducibilità nel tempo. E stata sperimentata l applicabilità su composti puri ed estratti organici da vegetali e da matrici complesse (acque superficiali, acque per uso alimentare imbottigliate, alimenti ittici) ed è in corso di sperimentazione l applicabilità per evidenziare l azione agonista/antagonista indotta da composti migranti da contenitori per alimenti, da reti acquedottistiche e da dispositivi medici (sacche per infusione, tubi per alimentazione enterale, apparati per dialisi, etc.). 37

40 I monitoraggi effettuati nel territorio di Hera Luciano Agostini Responsabile Laboratori Hera S.p.A. Claudio Anzalone Responsabile Ricerca e Sviluppo Hera S.p.A. Il servizio idrico gestito da Hera, le fonti d approvvigionamento, il sistema di controllo, la qualità dell acqua Il Gruppo Hera è uno dei maggiori gestori di Servizio Idrico Integrato (SII) in Italia. Opera in larga parte del territorio dell Emilia Romagna e in alcune aree adiacenti della Toscana e delle Marche. L immagine nella pagina seguente mostra l ubicazione dei principali centri di produzione di acqua potabile con l evidenziazione dei due impianti principali che si approvvigionano da acque superficiali: la centrale di Val di Setta a Sasso Marconi BO (t. Setta e f. Reno, 2400 L/s) e la centrale di Pontelagoscuro a Ferrara (f. Po, 1400 L/s). Di seguito si presentano sinteticamente i principali numeri che caratterizzano il Servizio Idrico Integrato del Gruppo Hera. Si evidenziano nei diversi territori le concentrazioni medie di alcuni parametri di qualità considerati critici (clorito, trialometani-totale, tetracloroetilene+tricloroetil ene, nitrato, nitrito, antiparassitari-totale) che risultano inferiori ai limiti di legge in una misura compresa fra il 76% e l 89% come mostrato nel grafico riportato alla pagina seguente. I numeri del servizio idrico del Gruppo Hera 226 comuni km di reti di acquedotti Mmc acqua immessa in rete 7.87 mc/km/giorno perdite (fisiche ed amministrative) km di reti fognarie 300 Mmc di reflui trattati concentrazione media dei principali parametri di qualità degli scarichi pari al 23% delle concentrazioni massime di legge 38

41 SOT Modena 55 Impianti minori 225 Punti di captazione: 141 Sorgenti 3 Derivazioni da acque superficiali 81 Pozzi Pozzi Stellata Centrale Pontelagoscuro SOT Ferrara 1 Impianto minore 33 Punti di captazione: 0 Sorgenti 2 Derivazioni da acque superficiali 31 Pozzi SOT Ravenna* 2 (0) Impianti minori 4 (0) Punti di captazione: 0 (0) Sorgenti 1 (0) Derivazione da acque superficiali 3 (0) Pozzi Pozzi Marzaglia Pozzi Formigine Pozzi Sassuolo Pozzi Cognento Pozzi Modena Sud Pozzi San Cesario Pozzi San Vitale Pozzi Borgo Panigale Pozzi Tiro a Segno Mare Adriatico Centrale Val di Setta Pozzi Fossolo Pozzi Mirandola Centrale Castel S. Pietro Centrale Bubano Pozzi Imola NIP SOT Forlì-Cesena* 54 (47) Impianti minori 181 Punti di captazione: (134) 133 (120) Sorgenti Pozzi Forlì 9 (1) Derivazioni da acque superficiali 39 (13) Pozzi Diga Suviana Rete Principale Hera Rete Romagna Acque Impianti di potabilizzazione alimentati con acque di falda Impianti di potabilizzazione alimentati con acque di superficie SOT Bologna 58 Impianti minori 254 Punti di captazione: 193 Sorgenti 4 Derivazioni da acque superficiali 57 Pozzi L acquedotto gestito da Hera nel territorio dell Emilia Romagna *Tra parentesi il numero di impianti e punti di captazione gestiti da Hera SOT Imola-Faenza 88 Impianti minori 254 Punti di captazione: 203 Sorgenti 6 Derivazioni da acque superficiali 45 Pozzi Diga di Ridracoli Pozzi Cesena Pozzi Anello Nord Pozzi Raggera Centrale Campana Diga Pozzi Polveriera Conca SOT Rimini* 80 (52) Impianti minori 182 (68) Punti di captazione: 69 (60) Sorgenti 11 (5) Derivazioni da acque superficiali 102 (3) Pozzi Qualità dell acqua rispetto ai limiti di legge (2009): concentrazioni medie rilevate / concentrazioni massime ammissibili (valore ottimale < 100%) Limite di legge: 100% % % % % 11,4% 14,1% 15,7% 14,0% 14,5% 23,7% 15,6% % % SOT Bologna SOT Ferrara SOT Forlì- Cesena SOT Imola- Faenza SOT Modena SOT Ravenna SOT Rimini Rapporto tra le concentrazioni di clorito, trialometani-totale, tetracloroetilene+tricloroetilene, nitrato, nitrito, antiparassitari-totale e i rispettivi valori di parametro ex D.Lgs. 31/01 rilevati in punti rappresentativi di rete. 39

42 Indagini sui contaminanti emergenti: quali CE, le partnership Con il termine contaminanti emergenti (CE) ci si riferisce a una serie di sostanze di origine antropica che si possono rilevare nelle acque naturali, generalmente a concentrazioni molto basse, per le quali è stata accertata (o si sospetta) un azione tossica nei confronti dell ambiente in generale e della salute umana in particolare. I CE appartengono a diverse famiglie fra le quali i farmaci e le sostanze psicoattive, i prodotti per la cura della persona, alcune classi di prodotti chimici per l industria e per l agricoltura (ad es. ritardanti di fiamma, pesticidi). Una categoria trasversale a queste è quella dei cosiddetti interferenti endocrini (endocrine disruptors), sostanze capaci di interferire con il sistema endocrino umano, degli animali da allevamento e della fauna/ittiofauna selvatica. Sintesi delle attività avviate e programmate sui contaminanti energetici Identificazione dei CE di maggiore interesse nei sistemi idrici, con particolare riferimento alle acque naturali destinate alla potabilizzazione Messa a punto di metodiche analitiche per la loro determinazione quantitativa Acquisto di idonea strumentazione di laboratorio Screening della presenza di tali sostanze nei sistemi idrici gestiti dal Gruppo (acque naturali destinate alla potabilizzazione, acque potabili, acque reflue) Valutazione dell efficacia di rimozione degli attuali sistemi di trattamento (potabilizzazione e depurazione) Valutazione di eventuali nuove tecniche di rimozione Possibilità di implementare sistemi di controllo real time 40 I monitoraggi effettuati nel territorio di Hera

43 Le motivazioni e l obiettivo dell impegno di Hera in questa attività di ricerca sono tesi a garantire i migliori standard qualitativi possibili dell acqua erogata oltre quelli che sono i requisiti richiesti dalla normativa di settore. Il mondo dei Contaminanti Emergenti è veramente molto vasto: la lista delle sostanze da considerare potenziali contaminanti delle acque redatta dall EPA nel 2009 include 104 sostanze o gruppi chimici e 12 contaminanti microbiologici; uno studio del 2001 della Commissione europea sulle sostanze che hanno potenziale interferenza con il sistema endocrino enumera 553 sostanze artificiali e 9 ormoni naturali. E evidente, quindi, che occorre concentrare l attenzione su un numero limitato di sostanze per le quali esistono già ricerche di base abbastanza consolidate e siano di potenziale interesse per i corpi idrici che approvvigionano i nostri acquedotti. Per indirizzare queste attività così complesse, Hera ha strutturato rapporti di collaborazione con Enti e Istituti di ricerca. Ciò assicura un supporto tecnico-scientifico di elevata qualità e la partecipazione ai network nazionali e internazionali che si occupano nella maniera più qualificata possibile di questi temi. Le collaborazioni hanno portato a concentrare le ricerche attuali su un insieme di 10 sostanze: 4 polialchilfenoli, 4 estrogeni e 2 acidi perfluorurati (vedi pag.44). In un recente passato sono stati presi in considerazione anche 5 principi attivi di farmaci di largo consumo, appartenenti alla categoria degli antinfiammatori non steroidei, oggi non considerati prioritari. Sostanze candidate: 553 sostanze artificiali ; 9 ormoni naturali Es. Fonte: Unione Europea Es. Drinking Water Contaminant Candidate List 3 (ott 2009): 104 sostanze o gruppi chimici, 12 contaminanti microbiologici Fonte: US EPA Necessità di concentrarsi su sostanze: - con ricerche di base abbastanza consolidate - di potenziale interesse per i nostri corpi idrici 41

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