Protocollo SAFE. Elettroforesi Verticale su gel di acrilamide a concentrazione crescente di denaturanti condotta in parallelo

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1 Scopo Protocollo SAFE Elettroforesi Verticale su gel di acrilamide a concentrazione crescente di denaturanti condotta in parallelo Separazione di frammenti di DNA in funzione della sequenza Reagenti 1. Buffer TAE 50X Sostanze 1) Acido acetico glaciale: 57.1 ml Il prodotto puro è infiammabile e provoca gravi ustioni. Frasi R10, R35 (che corrispondono rispettivamente a H226, H314 ed H318). Lavorare sotto cappa ed usare guanti adatti. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare il medico. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S23, S26 ed S45. 2) EDTA 0,5M: 100 ml Composto da 18,612 grammi di EDTA ed acqua deionizzata. EDTA Il prodotto puro è irritante per gli occhi. Nocivo per gli organismi acquatici. Può provocare a lungo termine effettivi negativi per l'ambiente acquatico Frasi R36 (H319), R 52 ed R 53 (H412) In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare il medico. Non disperdere nell'ambiente. Frasi S26 e S61 (S61 corrisponde a P ). Preparazione dell EDTA 0,5M: sciogliere l EDTA in 70 ml di acqua deionizzata (correggere il ph ad 8) e portare a volume in pallone tarato. 1

2 La miscela di EDTA 0,5M è irritante per gli occhi. Frasi R36 (H319). In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare il medico. Frasi S26 3) TRIS base: 242 g Irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Frasi R36, R37, R38 (H 319, H335 e H315). In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare il medico. Usare indumenti protettivi adatti. Frasi S26 ed S36. 4) H 2 O deionizzata (sostanza non pericolosa). Preparazione della miscela: Buffer TAE 50X: Per la preparazione del Buffer TAE 50X (lavorando sotto cappa chimica) mettere in un becher TRIS, Acido Acetico, EDTA, agitare fino al completo discioglimento del TRIS. Trasferire la soluzione in un pallone tarato e portare a volume con dh 2 O. Mettere il Buffer in una bottiglia e autoclavare a 120 C per min. Stoccare a temperatura ambiente. La miscela provoca ustioni, è irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Frasi R34, R36, R37 ed R38 (corrispondono rispettivamente a H314, H318, H319, H335 ed H315). Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Frasi S23, S26. La stima della durata totale dell'esposizione alle sostanze pure è circa 30 min. Un batch di buffer è sufficiente per diverse separazioni elettroforetiche. La stima dell'esposizione alla miscela è di circa 5 min per batch. In entrambi i casi l'esposizione può essere annullata utilizzando i DPI opportuni 2X Dye solution Reagenti: 1) Blu di bromofenolo (non pericoloso): 0,05 grammi 2) Xylene cianolo: 0,05 grammi Provoca irritazione cutanea, grave irritazione oculare, può irritare le vie respiratorie. Frasi, R36, R37 ed R38 (corrispondenti a H319, H335ed H315). 2

3 Evitare di respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. In caso di contatto con gli occhi: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Frasi P261, P305 + P352+ P338. 3) Buffer TAE 1X (non pericoloso): 10 ml. Preparazione della miscela: 2X Dye solution: miscelare i reagenti e stoccare a temperatura ambiente. La miscela ottenuta non è pericolosa. La durata dell'esposizione a Xylene cianolo è breve, min. 5 min. durante la preparazione del reagente. L'esposizione può essere annullata utilizzando i DPI appropriati (occhiali, guanti maschera) Dcode Dye Solution Reagenti: 1) Blu di bromo fenolo al 2% (la sostanza non è pericolosa): 0.25 ml 2) Xylene cianolo al 2% (la sostanza non è pericolosa): 0,25 ml 3) Glicerolo (la sostanza non è pericolosa): 7mL. 4) H 2 O deionizzata (sostanza non pericolosa): 2,5mL. Preparazione della miscela: Dcode Dye Solution: miscelare i reagenti e stoccare a temperatura ambiente.. La miscela ottenuta non è pericolosa. 3

4 Soluzione denaturante al 100% all 8% di acrilammide Reagenti: 1) Acrilamide/bis acrilamide 40%: 20mL Può provocare il cancro. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie. Nocivo per inalazione e contatto con la pelle. Tossico per ingestione Può provocare alterazioni genetiche ereditarie per inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per gli occhi e la pelle. Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Possibile rischio di ridotta fertilità. Frasi: R45, R46, R20/21, R25, R46/23/24/25, R36/38, R43, R62 (H302, H315, H317, H319, H330, H334, H340, H350, H361f, H372). Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso. Usare indumenti protettivi adatti. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S53, S26,S36, S37 ed S45 (P260, P201,P280, P284, P301, P310, P305, P351, P338). 2) Formammide: 40 ml Può danneggiare i bambini non ancora nati. R61 (H360D) Evitare l'esposizione - procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S53 ed S45 (P201, P308 + P313). 3) Buffer TAE 50X: 2mL La miscela provoca ustioni, è irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Frasi R34, R36, R37 ed R38 (corrispondono rispettivamente a H314, H318, H319, H335 ed H315). Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Frasi S23, S26. 4) Urea (sostanza non pericolosa): 42 g. 5) H 2 O deionizzata (sostanza non pericolosa) Preparazione della miscela: soluzione denaturante al 100% all 8% di acrilammide: Scioglere 42 g grammi di urea in acrilamide, formammide e buffer TAE e portare a volume con acqua deionizzata in pallone tarato. Degasare e filtrare con filtri da 0,45µm. Conservare in bottiglia scura a 4 C. 4

5 La miscela può provocare il cancro. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie. Tossico per ingestione. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie per inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per gli occhi e la pelle. Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Possibile rischio di ridotta fertilità. Può danneggiare i bambini non ancora nati. Frasi: R45, R46, R25, R46/23/24/25, R36/38, R62, R43, R61 (H302, H315, H317, H319, H330, H334, H340, H350, H361f, H372, H360D). Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso. Usare indumenti protettivi adatti. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S53, S26, S36, S37 ed S45 (P260, P201,P280, P284, P301, P310, P305, P351, P338). L'esposizione all'acrilammide e alla formammide deve essere ridotta al minimo: a. lavorando sotto cappa apsirante b. usando i DPI (maschera, guanti, camice, occhiali) c. usando dispositivi di pipettaggio In condizioni normali l'esposizione durante la preparazione dei reagenti è di 5 min per batch. Soluzione denaturante allo 0% all 8% di acrilammide Reagenti: 1) Acrilamide/bis acrilamide 40%: 20mL Può provocare il cancro. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie. Nocivo per inalazione e contatto con la pelle. Tossico per ingestione. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie per inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per gli occhi e la pelle. Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Possibile rischio di ridotta fertilità. Frasi: R45, R46, R20/21, R25, R46/23/24/25, R36/38, R43, R62 (H302, H315, H317, H319, H330, H334, H340, H350, H361f, H372). Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso. Usare indumenti protettivi adatti. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o di malessere consultare 5

6 immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S53, S26,S36, S37 ed S45 (P260, P201,P280, P284, P301, P310, P305, P351, P338). 2) Buffer TAE 50X: 2mL La miscela provoca ustioni, è irritante per gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Frasi R34, R36, R37 ed R38 (corrispondono rispettivamente a H314, H318, H319, H335 ed H315). Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Frasi S23, S26. 3) H 2 O deionizzata (sostanza non pericolosa): 78 ml. Preparazione della miscela Soluzione denaturante allo 0% all 8% di acrilammide: Versare in una beuta acrilamide, TAE ed acqua deionizzata. Degasare e filtrare con filtri da 0,45µm. Conservare in bottiglia scura a 4 C. La miscela può provocare il cancro. Può provocare alterazioni genetiche ereditarie. Tossico per ingestione Può provocare alterazioni genetiche ereditarie per inalazione, a contatto con la pelle e per ingestione. Irritante per gli occhi e la pelle. Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Possibile rischio di ridotta fertilità. Frasi: R45, R46, R25, R46/23/24/25, R36/38, R62, R43, R61 (H302, H315, H317, H319, H330, H334, H340, H350, H361f, H372). Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso, Usare indumenti protettivi adatti. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Frasi S53, S26,S36, S37 ed S45 (P260, P201,P280, P284, P301, P310, P305, P351, P338). L'esposizione all'acrilammide e alla formammide deve essere ridotta al minimo: a. lavorando sotto cappa apsirante b. usando i DPI (maschera, guanti, camice, occhiali) c. usando dispositivi di pipettaggio In condizioni normali l'esposizione durante la preparazione dei reagenti è di 5 min per batch. 6

7 Ammonio persolfato al 10% Reagenti: 1) Acqua deionizzata (non pericolosa): 1mL 2) Ammonio persolfato: 0,1g Provoca grave irritazione oculare. Provoca irritazione cutanea. Può aggravare un incendio; comburente. Nocivo se ingerito. Può provocare una reazione allergica cutanea. Può provocare sintomi allergici o asmatici o difficoltà respiratorie se inalato. Può irritare le vie respiratorie. Frasi H319 H315 H272 H302 H317 H334 H335 (R 8 R22 R36/37/38 R42/43) Tenere/conservare lontano da indumenti/materiali combustibili. Evitare di respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. Indossare guanti di protezione. In caso di contatto con gli occhi: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. In caso di sintomi respiratori: contattare un centro antiveleni o un medico. P220 P261 P280 P305 + P351 + P338 P342 + P311 (S22, S24, S26, S37). Preparazione della miscela ammonio persolfato al 10%: sciogliere l ammonio persolfato in acqua e stoccare in congelatore per una settimana. La miscela Può provocare una reazione allergica cutanea. Può provocare sintomi allergici o asmatici o difficoltà respiratorie se inalato. Frasi H317 H334 (R42/43). Evitare di respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. Indossare guanti di protezione. Frasi P261 P280 (S22, S24, S37). Temed Liquido e vapori facilmente infiammabili. Nocivo se ingerito. Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. Nocivo se inalato. Frasi: H225-H302-H314-H332. Tenere lontano da fonti di calore/scintille/fiamme libere /superfici riscaldate - Non fumare. Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/proteggere il viso. in caso di contatto con gli occhi: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Contattare immediatamente un centro antiveleni o un medico. Frasi: P210-P280-P305 + P351 + P338-P310. Per la colorazione del gel SYBR Safe Provoca una debole irritazione cutanea. Provoca irritazioni oculari. Può irritare le vie respiratorie. Liquido combustibile. Frasi: H316, H320, H335, H227. 7

8 In caso di malessere, contattare un centro antiveleni o un medico. In caso di inalazione:trasportare l'infortunato all aria aperta e mantenerlo a riposo in posizione che favorisca la respirazione. Evitare di respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. In caso di contatto con gli occhi: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. Se l'irritazione degli occhi persiste, consultare un medico. In caso di irritazione della pelle: consultare un medico. Lavare accuratamente le mani dopo l'uso. Frasi: P312, P304+P340, P261, P305 + P351+ P338, P337 + P313, P332 + P313, P264. Precauzioni durante la preparazione del gel I tubi devono essere privi di materiali prima dell introduzione delle soluzioni di acrilamide al fine di evitare che quest ultima schizzi. Assicurarsi che i tubi siano liberi da qualsiasi materiale spingendo acqua con la siringa. Rimuovere eventuali residui di acqua. L'acrilamide è una sostanza molto pericolosa. Usare cautela: indossare guanti e occhiali di protezione in ogni momento. Evitare il contatto con la pelle. Informazioni generali sulla sicurezza Leggere il manuale prima di utilizzare il sistema DCode. Per assistenza tecnica, contattare l'ufficio Bio-Rad locale o negli Stati Uniti, contattare l'assistenza Tecnica al numero BIORAD ( ). L Alimentazione al sistema DCode è fornita da un alimentatore esterno. Questo alimentatore deve essere fornito di messa a terra isolata. Tutti gli alimentatori Bio-Rad soddisfano questo importante requisito di sicurezza. Indipendentemente da quale alimentazione elettrica si utilizzi, i parametri di funzionamento massimi previsti per il sistema sono: Limite massimo di tensione di 500 V Limite Potenza massima 50 watt La corrente alternata per il controllo della temperatura del sistema, e per l elettroforesi, è fornita dall alimentatore esterno attraverso l'unità posta sul coperchio, che fornisce un blocco di sicurezza. La corrente è interrotta quando il coperchio è rimosso. Non tentare di aggirare questo blocco di sicurezza. Scollegare sempre il cavo di alimentazione dell'unità e il cavo dell alimentatore esterno prima di rimuovere il coperchio, o quando si lavora con la cella. Precauzioni durante il set-up Non usare vicino a materiali infiammabili. Controllare sempre il sistema Dcode prima dell'uso che non vi siano componenti danneggiati. Posizionare sempre il sistema DCode a livello del banco. Posizionare sempre il coperchio sul serbatoio contenente il tampone con corrente alternata e alimentazione disconnessa. Collegare sempre correttamente il sistema. 8

9 Precauzioni durante la corsa Non far funzionare la pompa in assenza di tampone. Aggiungere sempre buffer fino alla linea "Fill" durante il pre-raffreddamento e / o il preriscaldamento del buffer. Tenere sempre il buffer sotto il livello "max" durante l'elettroforesi. Non toccare alcuna superficie bagnata se non sono scollegate tutte le fonti elettriche. Non mettere nulla sulla superficie superiore del modulo di sistema DCode. Precauzioni dopo la corsa Spegnere gli interruttori di alimentazione e scollegare tutti i cavi. Lasciare che il tubo di riscaldamento si raffreddi (circa 1 minuto) prima di rimuoverlo dal serbatoio. Il tubo di ceramica può essere molto caldo dopo lo spegnimento quindi non toccarlo subito dopo aver spento l'alimentazione. Non raffreddare il tubo di ceramica caldo in liquidi freddi. Conservare sempre il modulo di controllo elettroforesi / temperatura sul supporto in alluminio. Sicurezza Questo strumento è per il solo uso di laboratorio. Questo prodotto è conforme alla "classe A" standard per le emissioni elettromagnetiche delle apparecchiature di laboratorio. E 'possibile che le emissioni di questo prodotto possano interferire con alcuni apparecchi sensibili, come quelli elettrodomestici, quando è posizionato nelle vicinanze o nello stesso circuito. L'utente deve essere consapevole di questo potenziale ed adottare le misure appropriate per evitare interferenze. 9

10 Etichette delle miscele per la DGGE in parallelo Miscela: TAE 50X Frasi di rischio: R34, R36, R37 ed R38 (H314, H319, H335 ed H315). Consigli di prudenza: S23, S26. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Miscela: 2X Dye solution NON PERICOLOSO Miscela: Dcode Dye Solution NON PERICOLOSO Ammonio Persolfato al 10% Indicazioni di pericolo: H317 H334 (R42/43). Consigli di prudenza: P261 P280 (S22, S24, S37). Evitare di respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. Indossare guanti di protezione. 10

11 Soluzione denaturante al 100% all 8% di acrilammide Frasi di rischio: R45, R46, R25, R46/23/24/25, R36/38, R62, R43, R61 (H302, H315, H317, H319, H330, H334, H340, H350, H361f, H372, H360D). Consigli di prudenza: S53, S26,S36, S37 ed S45 (P260, P201,P280, P284, P301, P310, P305, P351, P338). Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso. Usare indumenti protettivi adatti. In caso di contatto con gli occhi lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). Soluzione denaturante allo 0% all 8% di acrilammide Frasi di rischio: R45, R46, R25, R46/23/24/25, R36/38, R62, R43 (H302, H315, H317, H319, H330, H334, H340, H350, H361f, H372). Consigli di prudenza: S53, S26,S36, S37 ed S45 (P260, P201,P280, P284, P301, P310, P305, P351, P338). Evitare l'esposizione e procurarsi speciali istruzioni prima dell'uso. Usare indumenti protettivi adatti. In caso di contatto con gli occhi lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Usare guanti adatti. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). 11

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