Metodi spettroscopici per le Biotecnologie

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1 AA Metodi spettroscopici per le Biotecnologie Spettroscopia UV-VIS 2 Dott. Alfonso Zoleo

2 Principali aminoacidi cromoforici Phe Tyr Trp Max Assorb. Asorb. Molare (M -1 cm -1 ) Fenilalanina nm 197 Tirosina nm 1420 Triptofano nm 5600

3 Determinazione quantitativa di proteine mediante assorbanza Si sfruttano le proprietà spetttrali di amminoacidi poco affetti dalla conformazione del backbone Si può determinare il coefficiente di estinzione molare di una proteina misurando l assorbimento a 280 nm. Infatti, il backbone assorbe a λ < 240 nm, mentre a 280 nm assorbono essenzialmente solo triptofano e tirosina Concentrazione <2.5 mg/ml per evitare aggregazioni. Possiamo, quindi, calcolare il coefficiente di es3nzione molare per una proteina unfolded contenente un certo numero di 3rosine e/o triptofani usando la formula (a ph=7) ε prot (280nm) = n. di Tyr *ε tyr (280nm) + n. di Trp * ε trp (280nm)= =n. di Tyr *1280 M -1 cm -1 + n. di Trp *5690 M -1 cm -1 Dal valore del coefficiente di es3nzione molare per la proteina possiamo calcolare la sua concentrazione dalla sua assorbanza tramite la legge di Lambert - Beer A = ε prot b C prot C prot =A/(bε prot )

4 Esempio: l albumina di siero bovino (BSA) ha un PM di g/mol e con3ene 21 3rosine e 3 triptofani. Una sua soluzione ha un assorbanza di 0,5 (cuvewa 1 cm) a 280 nm. Si calcoli la concentrazione in mg/l di questa soluzione ε BSA (280nm) =21*1280 M -1 cm *5690 M -1 cm -1 = M -1 cm -1 C (M) = A/(ε BSA b)=0,5/(43950*1)=1,1377x10-5 M C (g/l) = C(M)*PM= 1,1377x10-5 M x g/mol=0,789 g/l =789 mg/l

5 Effetto del solvente L interazione con le molecole di solvente causa un allargamento delle righe, rispetto a quanto si osserverebbe se le molecole del cromoforo fossero in fase gassosa. L allargamento può condurre a coalescenza, cioè a perdita della struttura vibrazionale della banda => un unica banda di assorbimento A A ν ν Questo spiega perché le subbande vibroniche talora si osservano e talora no

6 Effetto del solvente Fattori che determinano l allargamento delle righe vibroniche nei solventi: - Intorno delle molecole differente da molecola a molecola: Ogni molecola è circondata da molecole di solvente, ma la configurazione ideale del solvente attorno alla molecola, cioè quello che corrisponde all interazione soluto-solvente più favorevole, è disturbato dall agitazione termica: in un certo istante, la configurazione ideale è solo la più probabile (distribuzione di Boltzmann) Vuoto Solvente E S ideale non ideale Ci sono molte configurazioni non ideali, e quindi molti stati S 0 -solvente ad energia più alta Vuoto Solvente S 0 S 0-solvente

7 Effetto del solvente Fattori che determinano l allargamento delle righe vibroniche nei solventi: La transizione elettronica è molto più veloce (10-15 s) del riarrangiamento delle molecole del solvente: la molecola nello stato eccitato S 1 viene a trovarsi in una configurazione di molecole di solvente con cui potrebbe interagire più favorevolemente o meno favorevolmente rispetto allo stato fondamentale. Ad ogni modo, la separazione dei livelli di interazione S 1 -solvente è diversa che in S 0 -solvente S 1 S 1-solvente Questo conduce ad un allargamento inomogeneo della riga della transizione vibronica, dovuto ai differenti microambienti di ogni molecola di soluto (cromoforo) E E Maggiore è l interazione soluto-solvente, maggiore è l allargamento! S 0 S 0-solvente vuoto solvente

8 Effetto del solvente Fattori che determinano l allargamento delle righe vibroniche nei solventi: - Collisioni molecolari:ogni molecola di soluto collide con altre molecole: in fase condensata questi urti sono frequenti e conducono ad un allargamento omogeneo dovuto al principio di indeterminazione di Heisemberg: S 1 δe δe! τ Le collisioni limitano il tempo di vita dello stato elettronicamente e vibrazionalmente eccitato, causando allargamento In fase gas, gli spettri sono caratterizzati da righe strette, perché non ci sono gli effetti di allargamento di riga omogeneo e inomogeneo dovuti al solvente (in gas le collisioni sono poco frequenti). Quindi, per avere maggiore risoluzione dobbiamo usare la fase gas! S 0 vuoto solvente

9 Effetto del solvente La stabilizzazione da parte del solvente dello stato S 0 e dello stato S 1 è differente: il solvente può avere un effetto destabilizzante per lo stato S 1, come in A o stabilizzante, come in B A B S 1-solvente S 1 S 1 S 1-solvente E E E E S 0 S 0-solvente S 0 S 0-solvente vuoto solvente vuoto solvente Come conseguenza, lo spettro di assorbimento può presentare la banda spostata a lunghezze d onda minori (A) o maggiori (B)

10 Effetto del solvente Si osserva che le transizioni π π* si spostano verso lunghezze d onda maggiori passando da solventi apolari (meno interagenti) a polari (più interagenti). Le transizioni n π* fanno l opposto: vanno verso lunghezze d onda minori Passando da cicloesano (apolare) a etanolo (polare), nel benzofenone la transizione π π* si sposta a lunghezze d onda maggiori, mentre n π* si sposta a lunghezze d onda minori Questo comportamento è una conseguenza della forma degli orbitali molecolari interessati dalla transizione!

11 Effetto del ph Il ph può avere un effetto rilevante sull assorbimento di gruppi specifici OH O + H 2 O + H 3 O + λ max = 270 nm ε max = 1450 M -1 cm -1 λ max = 287 nm ε max = 2600 M -1 cm -1 Nell anione, aumenta la delocalizzazione degli elettroni π per effetto della carica negativa: questo risulta in una minore separazione HOMO-LUMO NH 2 NH H 2 O + OH - λ max = 280 nm ε max = 1430 M -1 cm -1 λ max = 254 nm ε max = 169 M -1 cm -1 Nel catione, la delocalizzazione degli elettroni π diminuisce: questo risulta in una maggiore separazione HOMO-LUMO

12 Effetto del ph Punti isosbestici La dipendenza dal ph degli spettri di assorbimento delle specie protiche rende complicato applicare la relazione di Lambert-Beer. La tirosina è un aminoacido che ha un forte assorbimento nei peptidi. Insieme al triptofano è l aminoacido che più determina gli assorbimenti nei peptidi H H - OOC OH - OOC O - + H + NH 3 NH 3 Punti isosbestici

13 Effetto del ph Punti isosbestici Il punto isosbestico rappresenta il punto dove due specie in equilibrio hanno la stessa assorbività molare. Al punto isosbestico si può misurare l assorbanza totale delle specie in equilibrio A=ε 1 bc 1 +ε 2 bc 2 =ε b (C 1 +C 2 ) 1 2 Al punto isosbestico ε 1 =ε 2 =ε Si consideri un peptide contenente tre tirosine e nessun triptofano: si ottiene lo spettro in figura. Qual è la concentrazione del peptide? Quale il ph? ε(274 nm, isosbestico) ca cm -1

14 Spettri UV-VIS di molecole biologiche INTERAZIONI TRA CROMOFORI Fino a questo momento, abbiamo considerato l influenza del solvente su singoli cromofori. Ma i cromofori possono interagire fra loro, cambiando lo spettro di assorbimento. Le proteine contengono molti gruppi amide. Se più gruppi assorbono la radiazione, i dipoli di transizione che si generano durante l assorbimento nei gruppi amide interagiscono fra loro per interazione coloumbiana (accoppiamento eccitonico) V = ( µ µ - µ µ R - 3 ) R 3 ( R )( R ) L interazione tra i momenti di dipolo di transizione dipende dall orientazione relativa e dalla distanza tra i dipoli.

15 ϕ a monomero Spettri UV-VIS di molecole biologiche Ψ + Ψ - INTERAZIONI TRA CROMOFORI dimero 2V Consideriamo un dimero formato da due cromofori identici: l interazione dei dipoli di transizione determina la formazione di un sistema a tre livelli. Un livello fondamentale e due livelli eccitati, separati da un energia V di accoppiamento eccitonico. Quindi, in assenza di acc. eccitonico avevamo tante due transizioni degeneri, mentre con acc. ecc. abbiamo due transizioni a diff. energia ϕ 0 Ψ 0

16 Lo spewro eccitonico è diverso a seconda della geometria rela3va dei due monomeri che cos3tuiscono il dimero: se i dipoli di transizione sono allinea3, abbiamo che la coppia di livelli eccita3 è degenere, ma spostata ad energia più alta rispewo al monomero: si osserva un unica riga ad energia più alta (blue- shi[). Se sono testa- coda, la coppia è degenere ma ad energia più bassa (unica riga a en. Più bassa, red shi[). Se sono obliqui, la coppia è non degenere, e si osservano quindi due righe, una ad en. più alta ed una più bassa

17 Spettri UV-VIS di molecole biologiche EFFETTI STRUTTURALI SULL INTERAZIONE FRA CROMOFORI Nell α-elica le due transizioni π π* hanno momenti dipolari di transizione perpendicolari: l uno parallelo all asse dell elica, l altro perpendicolare. Le lunghezze d onda sono piuttosto diverse: 210 nm e 190 nm

18 Spettri UV-VIS di molecole biologiche EFFETTI STRUTTURALI SULL INTERAZIONE FRA CROMOFORI Nel β-sheet le transizioni π 2 π 3 * di gruppi peptidici vicini hanno i momenti dipolari di transizione molto più allineati: le due transizioni sono quasi degeneri e ne risulta una banda unica. Nel random coil tansizioni π 2 π 3 * di gruppi peptidici vicini hanno i momenti dipolari orientati in modo random, e la situazione è intermedia. Questo ha una conseguenza sugli spettri UV-VIS

19 Spettri UV-VIS di molecole biologiche ACIDI NUCLEICI I cromofori sono le basi A, G, C, U. Gli zuccheri ed i gruppi fosfato hanno transizioni ad energia elevata (λ < 150 nm) Le basi azotate hanno struttura planare con sistema π delocalizzato Se l azoto ha tre legami σ, il doppietto elettronico non condiviso è in un orbitale p z e partecipa al sistema π Se l azoto ha due legami σ, il doppietto elettronico non condiviso è in un orbitale sp 2 e è di non legame (tipo n)

20 Spettri UV-VIS di molecole biologiche Acidi nucleici Le basi azotate sono orientate parallelamente le une alle altre negli acidi nucleici Il momento dipolare di transizione è orientato lungo il piano molecolare Come nelle proteine, le transizioni dominanti per intensità sono le transizioni π π* Le singole basi azotate hanno spettri di assorbimento UV-VIS abbastanza simili, caratterizzati da un unica banda con massimo a 270 nm

21 Le singole basi azotate hanno spettri di assorbimento UV-VIS abbastanza simili, caratterizzati da una banda con massimo a 270 nm. Lo spettro dell acido nucleico risulta dalla media pesata dei contributi dei vari nucleotidi componenti. Ne risulta un intensa banda a 270 nm

22 Lo spettro del DNA è dominato da una banda a 260 nm, non strutturata. La caratteristica principale è la diminuzione dell intensità del DNA (mediata sul numero dei nucleotidi) rispetto a quella dei singoli nucleotidi. L effetto è noto come IPOCROMISMO del DNA In seguito a denaturazione, l intensità della banda a 260 nm cresce (doppia elica -> singola elica -> singoli nucleotidi) L ipocromismo deriva dall interazione eccitonica tra le basi azotate: l interazione tra i momenti dipolari di transizione in basi azotate ordinate determina una diminuzione del momento dipolare di transizione globale Se i dipoli di transizioni sono allineati così, si ha effetto ipocromico (DNA strutturato)

23 Se i dipoli di transizione fossero allineati testa-coda, si avrebbe IPERCROMISMO nella struttura ordinata Riscaldando il DNA si ha un brusco aumento dell intensità della banda a 260 nm fra 80 C e 90 C, in corrispondenza della sua denaturazione termica (fusione). La fusione avviene ad una temperatura abbastanza precisa, indicata come T m. Il processo è irreversibile Assorbanza DNA raffreddamento riscaldamento T