MECCANISMI DI NEURODEGENERAZIONE E STRATEGIE DI DIAGNOSI PRECOCE NEI PARKINSONISMI EREDITARI

Transcript

1 MECCANISMI DI NEURODEGENERAZIONE E STRATEGIE DI DIAGNOSI PRECOCE NEI PARKINSONISMI EREDITARI Responsabile scientifico di progetto BRUNO DALLAPICCOLA IRCCS Ospedale Casa Sollievo della Sofferenza U.O.3 Antonio Pisani Fondazione Santa Lucia RF06.55 Finanziamento 2006 Ministero della Salute Ricerca Finalizzata Art. 12 e 12bis D.Lgs. 502/92

2 Sezione III: Attività per progetti UNITÀ OPERATIVE COINVOLTE U.O. 1 IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza, Sezione Mendel (Roma) Bruno Dallapiccola U.O. 2 IRCCS Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Unità di Genetica Molecolare Umana (Milano) Giorgio Casari U.O. 3 IRCCS Fondazione Santa Lucia, Laboratorio di Neurofisiologia Sperimentale (Roma) Antonio Pisani U.O. 4 IRCCS Istituto Nazionale Neurologico Carlo Besta, Divisione Disturbi del Movimento (Milano) Alberto Albanese U.O. 5 Università Cattolica del Sacro Cuore, Istituto di Neurologia (Roma) Anna Rita Bentivoglio DESCRIZIONE La malattia di Parkinson (MP) è una delle più comuni e disabilitanti patologie neurodegenerative con una prevalenza età correlata che raggiunge il 2% nella settima decade di vita. La malattia è progressiva ed invalidante, ed associa disturbi motori (caratterizzati da rigidità muscolare, bradicinesia, tremore, instabilità posturale e disturbi della deambulazione) a problemi non motori (ipo-anosmia, disturbi vegetativi, seborrea, disturbi del sonno, anomalie della sfera sessuale, ecc.) e problemi psichiatrici (sindrome ansioso-depressiva, allucinazioni). I meccanismi patogenetici alla base della neurodegenerazione non sono ancora noti, e le terapie correntemente disponibili sono meramente sintomatiche, non rallentano in alcun modo la progressione della malattia e spesso danno origine ad effetti secondari che vanno a sommarsi ai segni e sintomi tipici della malattia, complicando notevolmente il quadro clinico e la gestione del paziente. Per tali motivi, la MP rappresenta una delle patologie più disabilitanti e di maggior impatto sociale nei paesi occidentali. Nell ultimo decennio, la ricerca genetica ha fornito un notevole contributo alle conoscenze disponibili, con l identificazione di alcuni geni responsabili di forme mendeliane di MP. Lo studio delle proteine codificate da tali geni e della loro funzione ha portato alla comprensione di alcuni importanti meccanismi cellulari (come la disfunzione mitocondriale, il danno da stress ossidativo e la tossicità delle proteine mal ripiegate) verosimilmente implicati anche nella patogenesi della comune forma idiopatica di MP, aprendo la via allo studio di strategie terapeutiche alternative. Nonostante le forme genetiche di MP rappresentino soltanto il 2-3% dei casi totali di MP (circa il 20% delle forme ad esordio giovanile), il quadro clinico è talora indistinguibile da quello della forma idiopatica e non esistono ad oggi indicatori clinici o strumentali per decidere quali pazienti avviare alle lunghe e costose indagini genetiche. Il presente progetto, che rappresenta lo sforzo coordinato e congiunto di 6 Unità Operative attive da alcuni anni in Italia nella ricerca sulla MP, si propone di contribuire alle conoscenze già disponibili sulla malattia mediante un approccio combinato di ricerca clinica, strumentale, molecolare e funzionale, che permetta da una parte di caratterizzare in maniera dettagliata i pazienti

3 Meccanismi di neurodegenerazione e strategie di diagnosi precoce nei parkinsonismi ereditari portatori di mutazioni genetiche e di identificare indicatori diagnostici e di follow-up, dall altra di studiare il processo neurodegenerativo utilizzando modelli cellulari ed animali di MP causata da mutazioni del gene PINK1. Lo studio si focalizzerà inoltre sulla identificazione di endofenotipi, cioè segni subclinici di disfunzione dopaminergica in individui clinicamente asintomatici, ma che presentano un rischio più elevato di sviluppare la malattia rispetto alla popolazione di controllo (in particolare saranno studiati soggetti sani portatori di una singola mutazione eterozigote in uno dei tre geni recessivi). I risultati di questo progetto consentiranno una migliore gestione clinica dei pazienti, una ottimizzazione delle risorse diagnostiche disponibili (metodiche strumentali, test genetici) e l identificazione di possibili target molecolari per innovative strategie neuroprotettive. de Lau L.M., Breteler M.M.B. (2006) Lancet Neurol 5: Farrer M.J. (2006) Nat Rev Genet 7: McInerney-Leo A., Hadley D.W., Gwinn-Hardy K., Hardy J. (2005) Mov Disord 20: OBIETTIVI Obiettivo principale del progetto è la comprensione di alcuni aspetti clinici e patogenetici della MP, una patologia neurodegenerativa ad elevata prevalenza e gravata da alto grado di disabilità. La MP può esordire in tutte le età ed è causata da una progressiva degenerazione dei neuroni aminergici della sostanza nera e di altre regioni del sistema nervoso centrale. Dato che la malattia si manifesta clinicamente quando oltre l 80% dei neuroni è andato incontro a degenerazione, la comprensione dei meccanismi patogenetici, la definizione di indicatori diagnostici precoci o preclinici e l identificazione di individui a maggior rischio di malattia (come ad esempio i portatori di alcuni fattori genetici di suscettibilità) rappresentano tappe fondamentali per lo sviluppo di approcci neuroprotettivi che possano essere utilizzati precocemente nella storia naturale della malattia. Questo progetto si propone appunto di rispondere ai predetti quesiti mediante un approccio combinato di ricerca clinica e di base, attraverso la collaborazione di numerose U.O. da anni impegnate con successo nello studio delle basi biologiche e genetiche della MP. L obiettivo principale del progetto si può dettagliare nei seguenti obiettivi secondari: 1) caratterizzazione dei meccanismi patogenetici di neurodegenerazione in modelli cellulari e modelli murini transgenici di parkinsonismi genetici (in particolare parkinsonismo da mutazioni del gene PINK1); 2) identificazione di nuovi bersagli molecolari per innovative strategie terapeutiche di neuroprotezione; 3) caratterizzazione fenotipica e correlazioni genotipo-fenotipo nei parkinsonismi ereditari;

4 Sezione III: Attività per progetti 4) verifica del valore diagnostico o prognostico di specifici esami clinici e strumentali; 5) identificazione di endofenotipi e di test strumentali che dimostrino segni precoci o subclinici di malattia in soggetti sani ma a maggior rischio di sviluppare MP rispetto alla popolazione di controllo. TRASFERIBILITÀ DEI RISULTATI E DEI PRODOTTI I risultati dello studio consentiranno di identificare criteri clinici e strumentali predittivi di alcune forme genetiche di MP, per poter selezionare a priori quali pazienti indirizzare ai test genetici. Questo permetterà di ottimizzare le risorse, offrendo ai pazienti con sospetta forma genetica di MP una adeguata consulenza genetica per sé e per i propri familiari, ed indicazioni prognostiche e terapeutiche mirate. La messa a punto di ulteriori test genetici consentirà l attivazione di un servizio di diagnostica molecolare per le forme genetiche più comuni di MP presso l Istituto CSS-Mendel di Roma. Lo studio degli endofenotipi permetterà di identificare individui clinicamente non affetti che mostrano segni di disfunzione dopaminergica subclinica, e quindi a maggior rischio di sviluppare MP. Tale popolazione a rischio potrà essere seguita prospetticamente nel tempo per identificare eventuali segni precoci di malattia e mettere in atto le strategie terapeutiche più opportune. Infine, gli studi su modelli cellulari ed animali di MP permetteranno di comprendere alcuni meccanismi chiave legati al processo neurodegenerativo, aprendo la via alla ricerca di nuovi approcci terapeutici da adottare precocemente nel corso della malattia, e di strategie neuroprotettive. OUTPUT 1) La attivazione di un servizio di diagnostica molecolare per le più comuni forme genetiche di MP (analisi mutazionale dei geni Parkina e PINK1, analisi di riarrangiamenti esonici nei geni causativi di MP, analisi della mutazione G2019S nel gene LRRK2) presso il laboratorio di diagnostica molecolare dell Istituto CSS-Mendel di Roma (al momento non vi è un laboratorio del centro Italia che effettui tali indagini diagnostiche e che possa contestualmente fornire una adeguata consulenza genetica dei pazienti). 2) La messa a punto di un protocollo diagnostico clinico e strumentale per lo studio dei pazienti con forme genetiche di MP e la valutazione di possibili endofenotipi. 3) L organizzazione di un convegno nazionale a fine progetto, in cui verranno anche presentati i risultati ottenuti, con la partecipazione di esperti nazionali ed internazionali. 4) La presentazione dei risultati come poster o comunicazione orale a convegni nazionali ed internazionali. 5) La pubblicazione dei risultati su riviste scientifiche con fattore di impatto

5 Meccanismi di neurodegenerazione e strategie di diagnosi precoce nei parkinsonismi ereditari OBIETTIVI INTERMEDI PREVISTI 1) L identificazione di nuovi pazienti portatori di mutazioni nei geni Parkina, PINK1 e della mutazione comune G2019S del gene LRRK2. 2) La creazione di un database integrato genetico-clinico-strumentale per i pazienti affetti da forme genetiche di MP. 3) La messa a punto di un protocollo di studio clinico e strumentale integrato da parte delle due U.O. cliniche (Istituto Neurologico Besta e Università Cattolica) per lo studio dei pazienti portatori di forme genetiche di MP e per la valutazione di potenziali endofenotipi in soggetti sani portatori di singole mutazioni in eterozigosi in uno dei tre geni recessivi. 4) La raccolta ed analisi molecolare dei geni recessivi in un ampia casistica di individui sani ultrasessantenni per valutare la prevalenza delle singole mutazioni in eterozigosi ed indirizzare i soggetti positivi disponibili a partecipare allo studio al protocollo clinico-strumentale per lo studio degli endofenotipi. Si allega il programma dettagliato dell Unità Operativa 3 che fa capo alla Fondazione Santa Lucia

6 Sezione III: Attività per progetti U.O. 3 Laboratorio di Neurofisiologia Sperimentale Antonio Pisani Contributo specifico fornito al progetto Il contributo specifico di questa U.O. al presente progetto si inserisce nell ambito della caratterizzazione del ruolo fisiologico del gene PINK1 sulla funzione neuronale e sull attività sinaptica. In particolare, questa U.O. si propone di investigare se l attività sinaptica e la plasticità sinaptica di neuroni della sostanza nera e dello striato siano alterate in topi knockout per il gene PINK1. Verrà inoltre determinato se i neuroni nigrali o quelli striatali mostrino una aumentata sensibilità ad alterazioni del metabolismo mitocondriale. Obiettivo 1: Per valutare eventuali alterazioni nella trasmissione sinaptica e nella plasticità sinaptica nel sistema corticostriatale di topi knockout, saranno effettuate registrazioni intracellulari convenzionali e nella modalità whole-cell-patch-clamp da fettine corticostriatali o di mesencefalo (da neuroni striatali o neuroni dopaminergici di sostanza nera, rispettivamente). Saranno analizzate le proprietà intrinseche e sinaptiche e le eventuali alterazioni della plasticità sinaptica, come long-term potentiation (LTP) e long-term depression (LTD). Infine, per comparare l efficacia della trasmissione dopaminergica in neuroni di animali di controllo o PINK1 knockout, saranno caratterizzate le risposte isolate farmacologicamente. Obiettivo 2: Evidenze sperimentali suggeriscono un ruolo protettivo di PINK1 nel danno da alterazioni del metabolismo mitocondriale. La sensibilità di neuroni striatali e dopaminergici nigrali sarà testata esponendo le cellule ad una soluzione priva di ossigeno e glucosio, o a concentrazioni note di rotenone, una tossina mitocondriale selettiva per il complesso I; questo permetterà di valutare la possibile vulnerabilità individuale di specifici gruppi neuronali (nigrali vs. striatali), nell ipotesi che i neuroni dopaminergici sottoposti ad un insulto energetico siano più sensibili rispetto ai controlli, e che tali risposte siano mediate da una abnorme attivazione di canali ionici per il potassio. L originalità del presente progetto consiste nel mirare alla caratterizzazione funzionale dei neuroni della sostanza nera e dello striato, unita alle precedenti esperienze della UO di analisi di altri modelli sperimentali di parkinsonismo che mostravano caratteristiche analoghe a quelle oggetto del presente progetto. Metodologia Preparazione del tessuto nigrale e corticostriatale I topi PINK1 knock-out verranno forniti da collaboratori alla Harvard Med School. Fette di tessuto striatale e di sostanza nera saranno tagliate con un vibratomo da blocchi di tessuto cerebrale come da protocollo validato. Dopo la sezione in fette di micrometri, una fetta sarà trasferita alla camera di registrazione, dove verrà immersa in un flusso continuo di soluzione di Krebs (2-3 ml/min) gas

7 Meccanismi di neurodegenerazione e strategie di diagnosi precoce nei parkinsonismi ereditari sato con una miscela 95% O2-5% CO2 e mantenuto ad una temperatura costante di C. Registrazioni convenzionali Saranno utilizzati microelettrodi sharp per registrazioni intracellulari, riempiti con 2M KCl (35-60 MOhm), ed un amplificatore Axoclamp-2A per le registrazioni sia in modalità di current-clamp che di voltage-clamp. Nella modalità di voltage-clamp a singolo elettrodo, la frequenza di campionamento sarà di 3 KHz, ed il segnale proveniente dall headstage viene visualizzato su un differente oscilloscopio. La traccia visualizzata su un oscilloscopio verrà memorizzata in un sistema digitale. Per la stimolazione sinaptica saranno utilizzati elettrodi bipolari, localizzati nel corpus callosum o nello striato, vicini all elettrodo di registrazione ( mm). Gli stimoli che saranno utilizzati sono semplici impulsi rettangolari, tipicamente 6-20 V per 100 ms. I potenziali sinaptici saranno misurati mediando le risposte a 4-8 stimoli. Le registrazioni in patch-clamp nella configurazione whole-cell saranno effettuate usando elettrodi rifiniti con la fiamma prima dell uso. Le fette coronali (in microm) saranno incubate in tampone HEPES, gassato con 100% O2 e mantenuto a 33 C. Dopo trenta minuti, una fetta sarà trasferita in una camera di registrazione montata su di un microscopio a luce trasmessa. Le pipette utilizzate per le registrazioni in patch-clamp avranno una resistenza compresa tra 3 ed 8 M *, quando riempite con la soluzione interna. Il ph sarà corretto a 7.3 con KOH; l osmolarità sarà mosmol/l. Dopo aver ottenuto il seal della cellula, questa verrà perfusa con soluzione Krebs a 33 C. Le registrazioni saranno effettuate con un Axopatch 1D. Per l acquisizione e l analisi dei dati verrà utilizzato il software pclamp8. Microfluorimetria Per registrazioni ottiche ed elettriche simultanee la punta del microelettrodo sharp sarà riempita con apposite soluzioni per le misurazioni del livello intracellulare di calcio o di sodio, rispettivamente; il microelettrodo verrà poi riempito con 2 M KCl. Dopo che è stata impalata, la cellula sarà riempita di bisfura2 o SBFI mediante l iniezione di corrente negativa ( na) per alcuni minuti. Per le registrazioni elettrofisiologiche sarà utilizzato un amplificatore Axoclamp-2A (Axon Instruments). Le tracce sono visualizzate su un oscilloscopio e memorizzate in un sistema digitale. La camera di registrazione sarà montata su di un microscopio a luce trasmessa (Zeiss), equipaggiato con un obbiettivo 60X ad immersione in soluzioni acquose (Olympus). La fluorescenza degli indicatori bisfura2 ed SBFI verrà eccitata mediante epi-illuminazione, con luce prodotta da una lampada allo Xenon da 75W e lunghezza d onda filtrata alternativamente a 340 e 380 nm. La luce di emissione sarà filtrata a 500 nm e verrà rilevata da una camera CCD. Le immagini ratiometriche risulteranno dal rapporto tra coppie di immagini acquisite a 340 e 380 nm, sottratte del background. L andamento nel tempo dei valori ratiometrici sarà valutato sulle ROI, regioni d interesse (pixel che mostrano almeno il 20-30% della fluorescenza specifica massima). I dati verranno analizzati con il test del t di Student o con analoghi non parametrici, come il test di Wilcoxon. Le caratteristiche dei potenziali d azione e delle curve corrente-voltaggio in differenti condizioni sperimentali saranno studiate mediante un fast chart recorder ed un sistema digitale (Nicolet System 400)

8