DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA

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1 CLM Biotecnologie per l Alimentazione CLM in Biotecnologie Sanitarie Corso di Chimica e certificazione degli alimenti DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA

2 VIRUS ENTERICI virus escreti tramite le feci ed in grado di infettare principalmente i tessuti del tratto respiratorio e gastrointestinale dell uomo e dei mammiferi Picornaviridae Poliovirus Enterovirus Coxsackievirus Echovirus Epatite A

3 TRASMISSIONE DI VIRUS ENTERICI ATTRAVERSO L ACQUA Materiale fecale Suolo H2O2 di scarico Rifiuti solidi Mare Fiumi e laghi Falda acquifera Irrigazione Molluschi Acque balneari Acqua potabile Goccioline Aerosol Infezione umana

4 10 10 /g FECI Liquami DILUIZIONE Liquami trattati Acqua superficiale e acqua marina Falde /m 3 Aerosol

5 FATTORI INATTIVANTI I VIRUS NELL ACQUA AMBIENTALE CHIMICI Ioni (ph e sali) Ossidanti Alchilanti Denaturanti Fattori disidratanti Materiale organico FISICI Temperatura Pressione atmosferica idrostatica osmotica (sali) Radiazioni U.V. ionizzanti Adsorbimento elettrostatico van der Waals Filtrazione BIOLOGICI Immunologici Resistenza Biomolecolare Mancanza di recettori Enzimi (Nucleasi) Inibitori Metabolici Competizione Attività virucida Tipo di virus Presenza di envelope

6 CARATTERISTICHE DEI VIRUS COME AGENTI DI RISCHIO AMBIENTALE 1 2 Presentano una bassa dose infettante Possono causate infezioni asintomatiche Possono indurre un immunità di breve durata Presentano un elevata variabilità genetica Sono escreti in numero elevato Presentano molteplici vie di trasmissione Sono molto resistenti all ambiente ed ai trattamenti

7 ANALISI DEL RISCHIO E MONITORAGGIO VIROLOGICO AMBIENTALE Identificare le vie di diffusione virale Individuare sorgenti di contaminazione sconosciute Stimare l'esposizione e la dose infettiva Eseguire una sorveglianza epidemiologica della circolazione virale Condurre studi di epidemiologia molecolare e di filogenesi Verificare l'efficacia delle misure di controllo Mostrare l'importanza delle procedure di igiene (Istruzione)

8 PROBLEMI NELL INDIVIDUAZIONE DI VIRUS NELLE MATRICI AMBIENTALI 1 Ridotte dimensioni dei virus 2 Elevata variabilità 3 Elevata diluizione 4 Aggregazione 5 Presenza di sostanze che possono interferire con le procedure analitiche 6 Limiti delle tecniche adottate 7 Assenza di indicatori affidabili

9 VIROLOGIA CLINICA Alte concentrazioni Virus specifici dell ospite Generalmente è presente un solo tipo di virus La composizione del campione di solito è costante VIROLOGIA AMBIENTALE Basse concentrazioni Presenza di virus umani e animali Frequente copresenza di diversi tipi di virus Estrema variabilità nella composizione del campione

10 Rilevamento di Virus nell ambiente Campionamento Preparazione del campione Colture cellulari Biologia Molecolare Microscopia elettronica Test Immunologici PROBLEMI Selezione dei virus da utilizzare come marker per la valutazione del rischio Standardizzazione delle tecniche di campionamento e preparazione dei campioni Identificazione di virus isolati in coltura Significato dell individuazione di acidi nucleici virali Valutazione di potenziali indicatori

11 RILEVAMENTO DEGLI ENTEROVIRUS IN CAMPIONI DI ACQUA Volumi medi dei campioni per la ricerca di enterovirus: ml per le acque di scarico litri per le acque di superficie 10 metri cubi per le acque potabili Per l'acqua potabile, considerati i grandi volumi, il tempo di analisi è dell'ordine di alcune settimane.

12 PROCEDURE PER IL RILEVAMENTO DEGLI ENTEROVIRUS IN CAMPIONI DI ACQUA 1. Acqua contaminata 2. Ultrafiltrazione tangenziale 3. Recupero molecole trattenute dalla membrana (RETENTATO) 4. Ultraconcentrazione del retentato 6. Aggiunta PEG (1:4) e centrifugazione 7. Recupero pellet ed estrazione RNA 8. RT- PCR qualitativa 9. RT- PCR quantitativa

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15 PCR QUANTITATIVA La reazione di PCR può anche fornire dei dati quantitativi, questa informazione è importante per valutare la carica virale di un determinato campione In questo caso è necessario disporre di un opportuno standard da utilizzare per la quantificazione del campione Sono stati sviluppati diversi approcci per la quantificazione con sistemi di rilevamento classici su gel, colorimetrici o fluorescenti

16 PCR QUANTITATIVA COMPETITIVA M M E richiesto l uso di un competitore che è amplificato dalla stessa copia di primer del target e che da un amplificato di dimensioni diverse Il competitore, di quantità nota, è aggiunto in quantità scalari mentre il campione è mantenuto fisso Con questo metodo è richiesta una quantità sufficiente di campione per poterlo confrontare con le diluizioni di competitore Per una stima più affidabile può essere necessario ripetere l analisi utilizzando una finestra di diluizione del competitore meno ampia

17 PCR-ELISA QUANTITATIVA Con questo sistema di analisi è necessario effettuare delle diluizioni del campione poichè i sistemi colorimetrici sono efficienti in un limitato intervallo di concentrazioni

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19 Fasi della curva di amplificazione della PCR

20 PCR QUANTITATIVA REAL-TIME I Sfortunatamente i sistemi di quantificazione classici richiedono un certo numero di manipolazioni e incrementano il rischio di contaminazione dovuto alle manipolazioni dei prodotti di amplificazione. Recentemente sono stati proposti dei sistemi di quantificazione basati sull uso di molecole fluorescenti. Questi sistemi permettono di misurare la comparsa dei prodotti di PCR in real-time evitando di ricorrere alle manipolazioni post-pcr (riducendo i rischi di contaminazione ed i tempi di analisi)

21 VANTAGGI DELLA REAL-TIME PCR Consente la quantificazione in un ampio intervallo di concentrazioni (da poche copie a ) Permette una stima più corretta rispetto ai sistemi di quantificazione in end-point Ridotta variabilità intra-saggio ed inter-saggio Sensibilità analitica non inferiore a quella ottenibile con i metodi convenzionali di PCR e nested-pcr Tutte queste caratteristiche rendono la real-time PCR un ottimo strumento per la quantificazione dei microrganismi, che possono presentare un ampia variabilità nella carica microbica

22 SISTEMI DI RILEVAMENTO NELLA PCR QUANTITATIVA REAL-TIME Sono stati sviluppati sistemi fluorescenti di rilevamento dei prodotti di amplificazione di tipo: Specifico (sonde ad idrolisi, sonde ad ibridazione, molecular beacons, sunrise primer e scorpion primer) Aspecifico (molecole fluorescenti leganti il DNA es SyBr Green) In generale i sistemi di tipo specifico sono preferibili nella diagnostica perché consentono un maggiore livello di specificità e danno dei risultati più affidabili in condizioni di basse o alte concentrazioni del DNA ricercato

23 Tecnologia Taq-Man

24 Fasi della curva di amplificazione della PCR

25 Tecnologia Taq-Man Rn+ = Emissione reporter/emissione reference Rn- = Emissione reporter/emissione reference Campione con DNA Campione senza DNA Rn= (Rn+) - ( Rn-) Il ciclo soglia, indicato dalla sigla CT, è il ciclo al quale vi è un incremento statisticamente significativo per Rn. Il ciclo soglia è quindi associato ad una crescita esponenziale dei prodotti di PCR.

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27 OTTIMIZZAZIONE DEL PROTOCOLLO DI ANALISI PROGETTAZIONE DEL SISTEMA PRIMER-SONDA COSTRUZIONE E QUANTIFICAZIONE DELLO STANDARD OTTIMIZZAZIONE DELLA REAZIONE SULLO STANDARD VALUTAZIONE SUI CAMPIONI

28 PLASMIDE UTILIZZATO PER IL CLONAGGIO Primer antisenso M13 EcoRI Prodotto di PCR EcoRI Primer senso M13 +1 pcr II TOPO 3900 pb

29 Tecnologia Taq-Man: parametri di valutazione Efficienza di amplificazione: una reazione può essere considerata efficiente se il coefficiente angolare (slope) della retta di taratura (che è proporzionale all efficienza di amplificazione E=[10 (-1/slope) ]-1) è compreso nell intervallo di valori: -3,1>slope>-3,6 l efficienza del 100% si ottiene con un valore pari a -3,32 Coefficiente di correlazione (R 2 ): questo valore deve essere >0,98

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