RELAZIONE INTERMEDIA TECNICO-SCIENTIFICA DELLE ATTIVITA SVOLTE

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1 RELAZIONE INTERMEDIA TECNICO-SCIENTIFICA DELLE ATTIVITA SVOLTE Messa a punto di un protocollo innovativo per la prevenzione della moria degli alveari (NEWPROBEE)!

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3 Introduzione Per la messa a punto di un protocollo innovativo a basso impatto ambientale in grado di prevenire la moria degli alveari causata dall azione di Varroa destructor e patologie connesse (es. virosi, nosemiasi) il progetto prevede che siano raggiunti i seguenti obiettivi: 1) Attività 1: prove in vitro Individuazione delle modalità d impiego del timolo, dell estratto neem azal e dell RNAi per la lotta alla varroa ed alle virosi delle api (biosaggi su varroa ed api); Sviluppo di metodiche analitiche per la determinazione del neem e del timolo nel miele. 2) Attività 2: messa a punto delle apparecchiature Messa a punto della macchina innovativa per l applicazione di polveri acaricide alimentata da energia solare e suo collaudo in apiario; Messa a punto di dispositivi per il conteggio delle api in entrata/uscita dagli alveari per la valutazione di fenomeni di spopolamento degli alveari e loro collaudo in apiario; Messa a punto di sonde per la misurazione della temperatura ed umidità relativa all interno degli alveari e loro collaudo in apiario. 3) Attività 3: prove di campo Valutazione dell efficacia antivirale del prodotto a base di RNAi; Valutazione dei protocolli innovativi per la lotta alla varroa; Monitoraggio e studio di apiari spopolati od a rischio di spopolamento. /

4 1. Attività 1: prove in vitro Tale attività si propone il duplice obiettivo di: a. individuare le modalità d impiego in campo del timolo in cristalli, degli estratti di neem e dell RNAi per la lotta alla varroa ed alle virosi delle api (biosaggi su varroa ed api); b. sviluppare specifiche metodiche analitiche per la determinazione del neem, (dell RNAi?) e del timolo nel miele. Al fine di ottenere indicazioni per le più appropriate modalità di applicazione in apiario sono stati realizzati biosaggi in laboratorio per determinare la DL 50 su varroa ed api per le sostanze naturali antivarroa in esame: estratti di neem (Azadirachta indica), timolo in cristalli ed RNAi. Per la realizzazione delle prove in vitro si è provveduto ad acquistare i suddetti principi attivi da testare, il materiale di consumo necessario per l isolamento di varroe ed api (es. piastre Petri, vaschette sterili, anse, etc.), come pure si è provveduto a prelevare dal campo le varroe e le api da impiegare nei biosaggi. Al fine di verificare le condizioni di temperatura ed umidità relativa ideali per la sopravvivenza di adulti di Varroa destructor ed api in vitro, grazie ad uno studio bibliografico ad hoc (Lindberg et al., 2000; Damiani et al, 2009) è stato possibile verificare: per le varroe valori di temperatura di C ed umidità relativa >60%, mentre per le api adulte valori di temperatura di C ed umidità relativa superiore del 50-70% (tabella 1). STLGTE0SUE0 UL$V$S0METW0S$A0 A0EEX0 #@Y/QZ[ \@Q]F->.CQ]H [XA0S0 /7Z[ 0G$0VUWST #IZ[Y//Z[ \IQ]F->.CQ]H!#$%%&'&(&G;';:-&',:,B'(B<,:;&,B,,)-;<,5-'<;N->&,(%-),1;''(--);5,;)*<&-,%1,&'(& La temperatura di 28±1 C ed una umidità relativa di 65% sono in grado di soddisfare i requisiti necessari per la sopravvivenza in condizioni ideali sia della varroa che delle api adulte. 7

5 In diversi lavori pubblicati in letteratura (es. Damiani et al, 2011) si utilizzano piastre Petri od altri contenitori con, ciascuno, da 5 a 20 esemplari adulti per gruppo (Imdorf et al, 1999). Per ciascun gruppo sperimentale, poi, vengono realizzate delle repliche (es. in caso di 5 esemplari possono essere realizzate 5 repliche) per ottenere dei dati statisticamente significativi. La mortalità acuta per api e varroa viene normalmente misurata a 24 ore, 48 ore e 72 ore. I

6 !!#$%&'()#(*#+(%,)#'(#-../01234#%.5%2%)#5&#06(5#/.33(7.,2# In fase di realizzazione. In letteratura sono riportati dati di tossicità orale e dermale delle api verso i costituenti principali del neem, responsabili della sua attività biologica, essendo le api uno degli indicatori biologici verso cui si testano tutte le stanze attive ed i prodotti formulati impiegati in agricoltura per difendere le colture dagli attacchi dei parassiti animali e fungini. Infatti, nel Draft Assesment Report Azadirachtin del 19 Novembre 2007 (915 pagine) sono riportati i seguenti dati: La somministrazione di neem azal (con un contenuto in principio attivo in azadirachtin A pari a 11,8%) ha causato la morte delle api alle seguenti concentrazioni: Dose letale 50 orale (a 48 ore dall applicazione applicazione) > 8.1 µg azadirachtin-a/ape; Dose letale 50 per contatto (a 48 ore dall applicazione) > 11.8 µg

7 !#8##$%&'()#(*#+(%,)#'(#%(/)3)#%.5%2%)#5&#92,,)2#'.5%,&:%),! Materiali e metodi Le varroe oggetto del test sono state prelevate da telai provenienti da alveari infestati e sono state trasferite in piastre Petri dal diametro di 9 cm con l ausilio di pennelli e anse da laboratorio. In ogni piastra Petri sono sono state inserite 10 varroe. Le varroe sono state posizionate sulla base della piastra Petri ed il contenitore è stato chiuso con una rete in cotone sterile a maglie strette per impedire l allontanamento delle varroe. Il trattamento a base di cristalli di timolo è stato posizionato in una seconda base di piastra Petri: i due contenitori sono stati quindi sovrapposti e sigillati con nastro adesivo in questo modo le varroe si trovano nella piastra Petri superiore, separati dalla piastra inferiore dalla rete in cotone, e quindi non direttamente a contatto con il principio attivo ma comunque esposte ai vapori di timo. Il prodotto a base di timolo essendo formulato in cristalli molto simili al comune zucchero da tavola (saccarosio) e, per ottenere le concentrazioni di prodotto desiderate, sono state realizzate diluizioni opportune di timolo in saccarosio. Nella piastra Petri inferiore del gruppo trattato si è quindi provveduto ad inserire il timolo mescolato con saccarosio per un peso complessivo di 2 g. Nel gruppo di controllo sono stati invece posizionati semplicemente 2 g di saccarosio. Le piastre Petri sono state incubate alla temperatura di 27 C. La mortalità delle varroe è stata verificata 18 ore dopo il trattamento attraverso l osservazione delle varroe con ausilio di uno stereomicroscopio a ingrandimenti. Le varroe che non si muovevano spontaneamente sono state sollecitate con uno specillo. Le varroe che non mostravano alcuna reazione anche dopo sollecitazione meccanica sono state considerate morte. C

8 Le dosi applicate nei diversi biosaggi sono riportate nelle tabelle dei risultati di ogni prova sperimentale. Biosaggio del 25 luglio 2011 Risultati I risultati ottenuti sono espressi nella tabella sottostante: Gruppo di trattamento Dose Varroe morte a 18 ore Mortalità (%) a 18 ore Mortalità (%) corretta 1 * a 18 ore CONTROLLO TIMOLO 20 0,05 mg ,1 mg ,2 mg ,5 mg mg Considerazioni Il timolo applicato alla dose di 1 mg ha causato la mortalità del 88% delle varroe! *Correzione della Mortalità rilevata con la formula di Abbott. % Mortalità corretta=[(% Mort. Osservata - % Mort. Controllo)/(100-M. controllo)] *100 K

9 Biosaggio del 9 agosto 2011 Risultati I risultati ottenuti sono espressi nella tabella sottostante: Trattati Dose Varroe morte a 18 ore Varroe % morte a 18 ore CONTROLLO TIMOLO 20 0,05 mg ,1 mg ,2 mg ,5 mg mg 7 35 Considerazioni L elevata mortalità nel controllo non permette di stabilire l efficacia del prodotto nei confronti delle varroe. Biosaggio del 6 settembre 2011 Risultati I risultati ottenuti sono espressi nella tabella sottostante: P

10 Gruppo di trattamento Dose Varroe morte a 18 ore Mortalità (%) a 18 ore CONTROLLO TIMOLO 20 0,1 mg ,2 mg ,5 mg mg mg mg Considerazioni L elevata mortalità nel controllo non permette di stabilire l efficacia del prodotto verso le varroe. Conclusioni sulle attività di biosaggio in laboratorio. 1. Biosaggi effettuati con derivati di Azadirachta indica Trattamenti acaricidi realizzati in vitro con derivati del NeemAzal nei confronti di Varroa jacobsoni sono riportati in letteratura dimostrando una valida attività acaricida (Melathopoulos et al, 2000a; Whittington et al. 2000b; Melathopoulos et al, 2000b). Nella presente sperimentazione si è voluto testare l efficacia acaricida della polvere tecnica di NeemAzal (neem azal) oltre a sperimentare un nuovo metodo di applicazione dei principi attivi.!q

11 Infatti il prodotto è stato miscelato con cera d ape al fine di annullare o, per lo meno, ridurre gli effetti negativi riportati in letteratura verso gli adulti, la covata di api e riportati sulla vitalità delle regine. Si è quindi ipotizzato che il neem mescolato alla cera possa svolgere un azione di disturbo od acaricida sulle femmine d acaro presenti nelle cellette dell alveare. I risultati ottenuti nella presente sperimentazione hanno confermato l effetto acaricida del NeemAzal ma non hanno permesso di calcolare una esatta dose letale 50 (DL 50 ) per la variabilità dei dati di laboratorio ottenuti. Tale variabilità è spiegabile sia con l elevata eterogeneità delle varroe utilizzate (in quanto prelevate da infestazioni naturali), sia con la complessità delle condizioni di laboratorio da ricreare per mantenere vitali gli acari per tutta la durata della sperimentazione. La prova sperimentale proseguirà con l applicazione in campo della cera d ape trattata con NeemAzal per verificare l efficacia del trattamento in condizioni reali, per un periodo prolungato di osservazione della infestazione da varroa. La prova prevederà, inoltre, l osservazione dei possibili effetti sulla covata, sulle regine e sulle variazioni numeriche delle api adulte. 2. Biosaggi effettuati con timolo In diverse pubblicazioni scientifiche i trattamenti a base di timolo sono risultati idonei nel ridurre le infestazioni da varroa, riportando livelli di efficacia acaricida compresi tra 54 e 98% (Gal et al, 1992; Higes, 1996). Simili livelli di efficacia si sono ripetuti anche usando metodi di applicazione diversi (Imdorf et al. 1999). Le varroe in riproduzione nelle celle della covata opercolata non subiscono danni dal trattamento con timolo: quindi, verificando l efficacia acaricida complessiva nell arco di un anno di applicazione, questa risulta inferiore, compresa tra 54 e 85% (Gal et al, 1992). Con test di laboratorio è stata inoltre calcolata la concentrazione letale 50 (CL50) olio!!

12 essenziale di timo contro Varroa destructor (CL50= 4,65!l, dopo 24 ore di esposizione) e contro la stessa ape adulta (CL50= 21,89!l, dopo 24 ore di esposizione), (Damiani ed al. 2009). Un trattamento di campo condotto in Italia con una preparazione commerciale di timolo (Apiguard ) ha causato una mortalità del 98% di Varroa jacobsoni (Colombo e Spreafico, 1999). In un altro lavoro condotto in Turchia sono stati utlizzati due prodotti, Thymovar e BeeVital, a base di timolo applicandoli in due trattamenti in autunno, in apiario, contro Varroa destructor. L efficacia acaricida media riscontrata in tali lavori del Thymovar e del BeeVital era stata rispettivamente del 96,91% e dell 88,66%. Nella prova sperimenentale e non era stata, tra l altro, rilevata mortalità di regine, adulti o covata (Akyol e Yeninar, 2008). I risultati ottenuti durante i biosaggi svolti nel corso dell attuale progetto con timolo in cristalli hanno confermato l efficacia acaricida del timolo anche se non è stato possibile determinare la dose letale 50 (DL 50 ). Infatti, in alcuni biosaggi è stata registrata una elevata mortalità nel gruppo di controllo dovuta presumibilmente alla variabilità delle varroe impiegate nelle prove ed alle condizioni di laboratorio predisposte per mantenere vitali gli acari per la durata complessiva della sperimentazione. La prova sperimentale proseguirà con l applicazione in campo del timolo per verificare in condizioni reali l efficacia del trattamento per un periodo prolungato e per valutare gli effetti sulla covata, sulle api regine e sulle variazioni di numerosità di api adulte nelle famiglie testate.!;##$%&'()#(*#+(%,)#'(#6,)')%%(#2#<25.#'(#%(/)3)#%.5%2%(#5&#06(5#/.33(7.,2# Materiali e metodi Le api adulte, prelevate all ingresso degli alveari, sono state posizionate sulla base della piastra Petri dal diametro di 9 cm. In ogni piastra Petri sono state inserite 10 api; il contenitore è stato chiuso con una rete in cotone sterile a maglie strette. Il trattamento a base di cristalli di timolo è!#

13 stato posizionato in una seconda base di piastra Petri: i due contenitori sono stati quindi sovrapposti e sigillati con nastro adesivo in questo modo le api si trovano nella piastra Petri superiore, separati dalla piastra inferiore dalla rete in cotone, e quindi non direttamente a contatto con il principio attivo ma comunque esposte ai vapori di timo. Il prodotto a base di timolo essendo formulato in cristalli molto simili al comune zucchero da tavola (saccarosio) e, per ottenere le concentrazioni di prodotto desiderate, sono state realizzate diluizioni opportune di timolo in saccarosio. Nella piastra Petri inferiore del gruppo trattato si è quindi provveduto ad inserire il timolo mescolato con saccarosio per un peso complessivo di 2 g. Nel gruppo di controllo sono stati invece posizionati semplicemente 2 g di saccarosio. Le piastre Petri sono state incubate alla temperatura di 27 C. La mortalità delle api è stata verificata a 24 ore e 48 ore dopo il trattamento, con osservazione dei movimenti delle api. Le api che non si muovevano sono state sollecitate con uno specillo. Le api che non mostravano alcuna reazione anche dopo sollecitazione meccanica sono state considerate morte. Le dosi applicate nei diversi biosaggi sono riportate nelle tabelle dei risultati di ogni prova sperimentale. Biosaggio del 3 agosto 2011 Risultati I risultati ottenuti sono espressi nella tabella sottostante:!/

14 Api morte Api morte (%) Gruppo di trattamento Dose a 24 ore a 48 ore a 24 ore a 48 ore CONTROLLO TIMOLO 10 0,1 mg ,2 mg ,5 mg mg mg Considerazioni Nel presente biosaggio è stato riscontrata la completa sopravvivenza delle api al trattamento con dosaggi di timolo inferiori od uguali a 2 mg.!7

15 !=##$%&'()#(*#+(%,)#'(#>-0(#6.,#(3#:)*%,)33)#'.3#+(,&5#(5,2.3(2*)#'.332#62,23(5(# La somministrazione per via orale di 1 µg/ape di Remebee congiuntamente a 10 µg/ µl di IAPV annulla l effetto patogeno del virus e mantiene la mortalità delle api nel gruppo trattato simile a quella del gruppo di controllo non trattato (Maori ed al, 2009). In uno studio di tossicità acuta verso le api sul prodotto Remebee, condotto secondo le Buone Pratiche di Laboratorio, è stata verificata l innocuità della somministrazione sulle le api della dose di 20!g/ape. Tale dosaggio corrisponde, in realtà ad una dose 20 volte maggiore di quella terapeutica consigliata (20X) (Comunicazione personale). Lo studio è stato condotto su 210 individui per gruppo. Le mortalità ottenute dopo 4 e 7 giorni di applicazione sono state: per la dose massima applicata (20X) rispettivamente del 6,2 e 7,6%; tale risultato non è significativamente differente dalla mortalità ottenuta nel gruppo di controllo non trattato (9,0% sia a 4 che a 7 giorni dopo la l applicazione). Lo studio riportato costituisce parte del dossier di registrazione del prodotto.!i

16 !C##$+(3&66)#'(#/.%)'(:D.#2*23(%(:D.#6.,#32#'.%.,/(*21()*.#'.3#-../01234#.# '.3#%(/)3)#*.3#/(.3.#! Materiali e metodi Per la valutazione dei diversi sistemi di estrazione e purificazione di neem e timolo da campioni di miele sono state impiegate tecniche quali: estrazione liquido-liquido, purificazione con colonnine SPE, sistemi di ultrafiltrazione. Successivamente sono ottimizzati i parametri strumentali per determinare le concentrazioni di neem e timolo a livello di residuo dal miele. Risultati per la messa a punto di un metodo per il NeemAzal L attività di ricerca in questa prima fase ha riguardato una valutazione dello stato dell arte nella ricerca e determinazione dei residui di azadiractina, principio attivo del NeemAzal nei prodotti alimentari. Dalla ricerca bibliografica è stata evidenziata una carenza di metodi chimici per la determinazione di tale sostanza ed in particolare gli unici metodi disponibili sono dei metodi HPLC con rivelatori convenzionali come UV e DAD, che risultano poco sensibili ed inadatti per la ricerca di azadiractina a livelli di residui. Per tale motivo si è iniziato lo sviluppo e la messa a punto di un metodo LC-MS per la determinazione di residui di azadiractina nel miele. In questa fase preliminare, dopo l acquisizione di standard analitici sono stati iniziati gli studi strutturali sulla molecola di interresse. In particolare attraverso il metodo in infusione, che consiste nell introduzione diretta di soluzioni standard di azadiractina nello spettrometro di massa, sono state individuate le condizioni ottimali di ionizzazione. Lo studio ha previsto le modalità di ionizzazione (positiva o negativa), la scelta di interfacce API ed ESI che meglio si adattano nell analisi dell azadiractina. Successivamente sono stati valutati e modificati i parametri critici (come i potenziali delle lenti, del capillare, la temperatura del capillare, il flusso dei gas) che influenzano la formazione degli ioni molecolari e le relative frammentazioni, attraverso lo studio delle intensità delle diverse specie ioniche (ioni molecolari, clusters, addotti), che si ottengono in funzione dei!@

17 parametri sperimentali. Sono state, perciò, effettuate analisi in infusione sia in assenza che in presenza dei più comuni agenti ionizzanti, quali: Acido formico 0,1%, Acido acetico 1%, Acetato di ammonio 2 mm, Formiato di ammonio 2 mm ed Ammoniaca 0,01%. I risultati ottenuti hanno mostrato che la ionizzazione in modalità negativa è risultata la più efficace nell analisi di questo composto in termini di sensibilità e rapporto segnale rumore. Una volta individuate le modalità di acquisizione, il passo successivo è stato quello della scelta delle colonna cromatografica e l ottimizzazione delle condizioni di separazione. Tra le diverse fasi provate quella che la colonna che più si adatta alle nostre esigenze analitiche è risultata essere una colonna C18 di diametro interno 2.1 mm e lunghezza 150 mm. Sono inoltre iniziati gli studi per la predisposizione della base di sviluppo e validazione del metodo analitico per la purificazione del principio attivo nel miele. Risultati per la messa a punto di un metodo per il timolo In fase di realizzazione!c

18 2. Attività 2: messa a punto delle apparecchiature 8!#E.552#2#6&*%)#'.332#/2::D(*2#(**)+2%(+2#6.,#3F2663(:21()*.#'(#6)3+.,(# 2:2,(:('.#23(/.*%2%2#'2#.*.,G(2#5)32,.#.#5&)#:)332&')#(*#26(2,()#! Materiali e metodi Nell ambito del progetto NEWPROBEE è stato realizzato lo studio di fattibilità e la progettazione di un apparecchio elettrico innovativo, alimentato con energia fotovoltaica, per la veicolazione di acaricidi in polvere a basso impatto ambientale all interno degli alveari. Alla data di inizio delle attività di realizzazione della macchina erogatrice non era ancora disponibile la polvere acaricida in questione: non conoscendone né la granulosità nè la consistenza si è dovuto procedere in base ad ipotesi. Si è ipotizzato quindi che il NEEM avesse una consistenza del tutto simile alla comune farina alimentare. L ipotesi non comporta comunque alcuna conseguenza negativa in quanto, se il NEEM dovesse presentare una granulosità di tipo differente lo si ridurrà con un processo di molatura in farina. Febbraio-2011 Nel mese di Febbraio 2011 si è ufficialmente dato il via allo sviluppo del macchinario soffiatore: a. Scelta progettuale tra erogatore alimentato a scoppio ed erogatore alimentato ad energia fotovoltaica. Si è ragionato sull opportunità di realizzare l apparecchiatura alimentandola con un motore a scoppio. Questa soluzione è stata presto abbandonata in quanto presentava alcuni inconvenienti notevoli, quali: Rumorosità elevata;!k

19 Generazione di forti odori con trasferimento degli stessi ai prodotti dell alveare; Generazione di un flusso d aria eccessivamente violento e conseguentemente molesto per le api; Possibile sviluppo di incendio negli apiari. Si è quindi optato per la soluzione di un erogatore alimentato con fonti rinnovabili che non presentasse le problematiche del motore a scoppio e che fosse più in linea con la filosofia del progetto NEWPROBEE. b. Ricerca di mercato atta all individuazione di prodotti già realizzati e presenti sul mercato. c. Ideazione di un prototipo di soffiatore realizzato con ventole di raffreddamento del tipo utilizzato in informatica (fig.6). Fig. 6 Ventole di raffreddamento d. Ricerca del tipo di ventola disponibile sul mercato atta alle esigenze del progetto. Marzo 2011 a. Realizzazione di un prototipo con ventole. b. Realizzazione di prove tecniche atte alla verifica della bontà della soluzione individuata.!p

20 La soluzione individuata non ha dato però fornito i risultati attesi in quanto le ventole hanno dimostrato di : non riuscire a generare un flusso d aria sufficiente a spargere la polvere; non risulta agevole direzionare il flusso d aria sulla polvere e quindi all interno dell arnia. c. Ideazione di un prototipo di soffiatore mediante mini compressori d aria; d. Ricerca di mercato per individuare la tipologia di apparecchiatura idonea allo scopo. Nel mercato esistono vari tipi di compressori con diverse caratteristiche: Compressori a membrana; Compressori a vite; Compressore a pistone; Compressori a corrente continua; Compressori a corrente alternata. Aprile 2011 E stato individuato come adatto agli scopi del progetto un compressore ricavato da un comune apparecchio domestico per aerosol. L apparecchio scelto presenta le seguenti caratteristiche: Tensione di alimentazione Frequenza di alimentazione Assorbimento corrente Pressione Max 220 V 50 Hz 0,5 A 2 Bar a. Effettuazione di alcune prove per verificare la soluzione individuata. Il compressore scelto si è dimostrato estremamente efficace per gli scopi del progetto. Infatti è stato in grado di sollevare agevolmente la polvere utilizzata per le prove. #Q

21 Inoltre soffiando attraverso un tubo di gomma è risultato estremamente semplice indirizzare l aria a proprio piacimento. b. Effettuazione di alcune prove di soffiaggio attraverso un tubo di gomma riempito di polvere. c. Realizzazione di un vaso di espansione lungo la condotta dell aria. Poiché il compressore utilizzato è del tipo a membrana, il flusso d aria creato non è continuo, ma ad intermittenza. Per ridurre l effetto ad intermittenza è stato necessario inserire uno spezzone di tubo di portata maggiore in modo tale che la fuoriuscita dell aria avvenga con maggiore uniformità. Questo accorgimento è stato necessario per interferire il meno possibile con le api. d. Effettuazione di prove atte a verificare che il flusso d aria fosse sufficiente allo scopo con l inserimento del vaso di espansione. Maggio 2011 a. Studio del modalità di inserimento del flusso d aria all interno dell arnia: 1. Inserimento del tubo del compressore sollevando il coprifavo dell arnia. Soluzione abbandonata perché poco agevole. 2. Inserimento del tubo del compressore tra il coprifavo rovesciato ed il nido. Soluzione abbandonata perché poco pratica, inoltre non si ottiene una distribuzione uniforme del prodotto acaricida all interno dell arnia. 3. Individuazione della soluzione ottima per l erogazione del prodotto acaricida. E stata scelta quale soluzione più adatta per l erogazione della polvere sia quella di sistemare sulla parte superiore del coprifavo (fig.7) un tubo di gomma inserito attraverso un foro realizzato sulle pareti del coprifavo, opportunamente sagomato (fig.8). #!

22 Fig. 7 Coprifavo Fig. 8 Coprifavo provvisto di tubi sagomati per la somministrazione del prodotto acaricida La sagoma imposta al tubo è tale da far coincidere il tubo con gli spazi tra i favi. Una volta sistemato e fissato il tubo si è proceduto a forarlo mediante un ago, distanziando gli stessi di circa 3 cm l uno dall altro. Attraverso i fori praticati la polvere di acaricida sarà immessa uniformemente all interno dell arnia. Il tubo individuato per questa applicazione è del tipo utilizzato per l irrigazione a goccia. Giugno 2011 a. Realizzazione di alcune prove tecniche di erogazione della polvere collegando il compressore al tubo sistemato sul coprifavo. Verifica della corretta fuoriuscita dell aria. ##

23 b. Realizzazione di prove tecniche di erogazione della polvere. Si è proceduto a riempire l espansione (vedi Aprile punto e) di farina ed a verificarne la uniforme fuoriuscita attraverso tutti i fori praticati. c. Prova di erogazione di farina all interno dell arnia. d. Ricerca sul mercato di una ampolla che possa contenere la farina e che offra una maggiore semplicità di utilizzo rispetto all espansione realizzata con il tubo di sezione maggiore. e. Dimensionamento del generatore elettrico fotovoltaico e degli apparati ad esso connessi (fig.9). Fig. 9 Dimensionamento del generatore elettrico fotovoltaico e degli apparati ad esso connessi e. Ricerca di mercato degli apparati presenti con le caratteristiche opportune: a. Modulo fotovoltaico (FV) b. Regolatore di Carica c. Batteria. f. Modulo fotovoltaico di tipo monocristallino con potenza di 175 Wp (vedi DATA SHEET modulo fotovoltaico); #/

24 g. Regolatore di carica Steca PR2020 con grado di protezione IP65 (vedi DATA SHEET regolatore di carica); h. Batteria di tipo Automobilistico a 12V/74Ah/680. #7

25 DATA SHEET Modulo fotovoltaico di tipo monocristallino con potenza di 175 Wp #I

26 DATA SHEET Regolatore di carica Steca PR2020 con grado di protezione IP65

27 #C

28 88#E.552#2#6&*%)#'(#'(56)5(%(+(#6.,#(3#:)*%.GG()#'.33.#26(#(*#.*%,2%2H&5:(%2# '2G3(#23+.2,(#6.,#32#+23&%21()*.#'(#7.*)/.*(#'(#56)6)32/.*%)#'.G3(#23+.2,(#.# 3),)#:)332&')#(*#26(2,()## Materiali e metodi Nell ambito del progetto Messa a punto di un protocollo innovativo per la prevenzione della moria degli alveari l unità operativa Università La Sapienza di Roma ed in particolare il Dipartimento di Ingegneria dell Informazione, Elettronica e Telecomunicazioni (DIET) nella persona di Ing. Marco Balsi, ricercatore nel medesimo dipartimento, ha in carico lo studio di un dispositivo automatizzato atto a monitorare fenomeni di spopolamento delle api. Per conteggiare le api in ingresso ed in uscita sono stati preliminarmente sperimentati sensori montati in corrispondenza di un foro di uscita dall arnia e collegati a sistemi di acquisizione da laboratorio (multimetro, interfacce per PC, ecc.): una fotocellula basata su un semplice circuito con un fototransistor e un LED, un sensore capacitivo realizzato in laboratorio in cui il corpo dell ape passando all interno produce una perturbazione del debole campo elettrico applicato, un pirometro che evidenzi il passaggio dell ape attraverso l emissione di calore corporeo, e un sistema software di elaborazione di immagini acquisite da telecamera che conti oggetti in movimento che entrano o escono da una regione di interesse delimitata nell ambito dell immagine inquadrata. L efficacia di ciascun sensore sarà valutata confrontando il conteggio diretto visivo delle api con l acquisizione automatica dei dati (validazione del metodo). Uno o più sistemi di conteggio saranno prescelti per la realizzazione di un numero sufficiente di dispositivi per la sperimentazione in campo. In particolare le attività da svolgere possono essere così descritte: 1) Monitoraggio Arnia: #K

29 Studio di fattibilità di un sistema di misura della temperatura e umidità all interno dell arnia. In particolare si progetterà il sistema di condizionamento del segnale, acquisizione e memorizzazione dei dati. 2) Contatore Api: Progettazione di sistema di conteggio delle api entranti e uscenti dall arnia. Preliminarmente, si eseguirà un analisi dello stato dell arte nella letteratura scientifica e tecnica e sul mercato. Conseguentemente si farà una valutazione di fattibilità di sistemi prevalentemente di tipo ottico oppure capacitivo. Monitoraggio Arnia In questa prima fase si è definito il sistema di acquisizione il quale vista la particolarità della applicazione dove garantire l attività di monitoraggio delle variabili ambientali all interno dell arnia, quali temperatura e umidità, senza soluzione di continuità ed allo stesso tempo offrire la possibilità di fruire in modo semplice dei dati registrati. Questo imponeva che la catena di elaborazione potesse memorizzare continuamente i dati forniti dai sensori e renderli fruibile a seconda delle disponibilità dell operatore. Fig. 10 Schema di principio di un sistema di acquisizione dati A valle di tale considerazioni l idea implementata consisteva nel progettare una catena di elaborazione del dato di temperatura ed umidità, come quella concettualmente descritta in fig. 10. In essa si riconosce il sensore, il quale generalmente fornisce in output un segnale elettrico analogico proporzionale al grandezza da misurare. L esigenza di mettere in comunicazione il sensore con #P

30 l unità di elaborazione/controllo ed il successivo blocco di memorizzazione impone l utilizzo del convertitore analogico digitale (ADC). Individuata l organizzazione logica della catena di elaborazione si è passati alla scelta dei componenti al fine di implementare il sistema. In particolare la scelta dei sensori è ricaduta su due soluzioni, di prestazioni adeguate e costo contenuto, quali il sensore SHT15 (fig. 11), ed il DHT22, (fig. 12). Fig. 11 Sensore di umidità e temperatura. SHT15 Principali Caratteristiche Tecniche: sensori calibrati dalla fabbrica per temperatura ed umidita'relativa Interfaccia Digital 2-wire Punto di rugiada calcolabile con precisione Range di misura: 0-100% RH Accuratezza RH assoluta: +/- 2% RH ( % RH) Ripetibilita' RH: +/- 0.1% RH Accuratezza temperatura : +/ C Tempo di risposta < 4 sec. Basso consumo ( 30 µw tipico) Costo Contenuto ( 45,77) /Q

31 Fig. 12 Sensore di umidità e temperatura. DHT22 Principali Caratteristiche Tecniche:.3-6V Input 1-1.5mA measuring current ua standby current Humidity from 0-100% RH degrees C temperature range +-2% RH accuracy degrees C Basso Costo ( 10,59) Entrambi i sensori permettono di poter monitorare contemporaneamente sia la temperatura che l umidità dell aria inoltre offrono in uscita il dato digitale che permette la connessione diretta del sensore alla soluzione di elaborazione/gestione senza quindi la necessità di interfacciarli con un convertitore analogico-digitale. Il controllo e la gestione di tali dispositivi veniva affidato alla piattaforma hardware basata su microcontrollori ATMEL Arduino 2009 (www. arduino.cc), (fig. 13). /!

32 Fig. 13 Piattaforma hardware Arduino2009. Principali Caratteristiche Tecniche: microprocessore: ATMEGA 328 (ATMEL) I/O 13 ingressi digitali 5 ingressi analogici 1 ADC 10 bit Alimentazione 5V 12V. Alimentabile da USB Costo ( 30,00) Una volta individuata la piattaforma di controllo la scelta della soluzione di memorizzazione ricadeva sulla shield micro-sd, interfacciabile con l Arduino Tale soluzione permette di memorizzare fino a 2GB di dati. Fig. 14 Shield microsd. Interfacciata all Arduino permette la memorizzazione del dato rilevato (Costo circa 20,00). /#

33 Fig. 15 Il sistema assemblato. Si osservi che il sensore di DHT22 è montato su basetta solo per facilitarne l utilizzo in questa fase di studio. In figura 15 è visibile l intero sistema assemblato. Ovviamente esso si presenta nella forma di prototipo e non nella forma finale. La scelta di utilizzare due sensori sarà ovviamente limitata alla sola fase di studio in quanto sarà necessario verificare l affidabilità e la ripetibilità della misura all interno dell arnia. I primi test effettuati fuori dall arnia mostrano un buon accordo tra le misure dei due sensori sia per i valori di temperatura che quelli di umidità. Il passo successivo prevederà di studiare una soluzione che possa inglobarli all interno dell arnia senza che la loro presenza non alteri il comportamento delle api. Si ipotizza l uso di gabbiette da regina o di analoga gabbietta costruita appositamente, da inglobare in un favo. Contatore Api Allo scopo di poter monitorare l attività delle api ed in particolare il flusso netto definite come differenza tra le api entranti ed uscenti dall arnia stiamo valutando l ipotesi di poter utilizzare sensori ottici commerciali generalmente utilizzati all interno del mouse. Infatti tali dispositivi restituiscono un informazione di movimento nelle direzione x ed y dello spazio. Tale informazione può essere ottenuta in linea di principio sia quando è il sensore a muoversi su di una superficie che nel caso opposto, cioè qualcosa è transitato al di sotto del sensore. //

34 Oltre alle coordinate spaziali tali sensori restituiscono un informazione di surface quality in particolare ogni variazione nella trama/colore della superficie osservata è rilevata. Tali caratteristiche permettono di pensare che tali soluzioni possono essere utilizzate allo scopo di conteggio, secondo lo schema logico qui proposto: ogni volta che un ape transita sotto il sensore questo produrrà un informazione di posizione x o y a seconda di come sarà disposto il sensore rispetto al moto dell ape; la presenza di un ape produrrà un cambio nella trama della superficie osservata dal sensore che si tradurrà in un informazione di surface quality. È importante osservare che in letteratura è ampiamente documentato che la luce rossa emessa da tali dispositivi non nuoce alle api le quali risultano insensibili. Fig. 16. Kit per mouse ADNS Si riconoscono il sensore le due lenti ed il diodo led Allo scopo di poter effettuare lo studio di fattibilità di tale soluzione è stato predisposto l acquisto del kit di sensori ADNS 2051 (fig. 16). Anche in questo caso il sensore fornisce l informazione in formato digitale e quindi si presta ad essere interfacciato con microcontrollori senza convertitori ADC. Per continuità progettuale la piattaforma di elaborazione è stata identificata in Arduino /7

35 In questa prima fase ci si e dedicati con esito positivo all interfacciamento del sensore con Arduino con lo scopo di trasferire il dato rilevato al PC. Sono inoltre in essere delle attività di sperimentazione per validare il rilevamento di un oggetto che transiti al disotto del sensore. Al fine di poter effettuare prove in sito si è definito il layout del PCB (fig. 17). Fig. 17 Circuito stampato La prototipazione, validazione e realizzazione dei ciruiti necessari alla sperimentazione sarà affidata alla ditta spin-off universitaria Oben s.r.l. di Sassari. Si verificherà periodicamente l efficienza dei sistemi di conteggio, anche tenendo conto del probabile deterioramento dei dispositivi anche ad opera delle api (in particolare dovuti alla propolizzazione), riparando eventuali dispositivi danneggiati e modificandoli ove necessario. /I

36 8;#E.552#2#6&*%)#'(#5)*'.#6.,#32#/(5&,21()*.#'.332#%./6.,2%&,2#.'#&/('(%I#,.32%(+2#233F(*%.,*)#'.G3(#23+.2,(#.#3),)#:)332&')#(*#26(2,()# In fase di realizzazione

37 Attività 3: prove di campo 9el periodo gennaio dicembre 2011 sono state svolte dal dottor Giovanni Formato missioni in territorio nazionale per realizzare visite in apiario per confrontarsi con le diverse metodologie di lotta alla varroa. Nello specifico, le visite in apiario sono state finalizzate a: - monitorare fenomeni di moria/spopolamento di api; - correlare gli eventi di moria e spopolamento rilevati ai diversi protocolli di lotta alla varroa (es. anche con le strategie messe a punto da altri Enti di ricerca operanti sul territorio nazionale: IZS Firenze, CRA-Api, etc.); - verificare la praticità, l efficacia acaricida e le modalità di somministrazione di diversi prodotti antivarroa a basso impatto ambientale impiegati dagli apicoltori; - verificare i dispositivi innovativi in fase di costruzione; - campionamento di matrici apistiche utilizzate per valutare la quantità di residui dei principi attivi (neem e timolo) oggetto dello studio nei prodotti dell alveare, come pure per ottenere api adulte e varroe vive da sottoporre a saggi di laboratorio per individuare la dose letale 50 (DL 50 ). Il dottor Formato ha infine preso parte ad eventi di formazione sull impiego di prodotti a basso impatto ambientale e fitoterapici per la lotta alla varroa in quanto attinenti al progetto di ricerca, con il fine di acquisire ulteriori conoscenze in merito all impiego di sostanze naturali per la lotta alla varroa ed alle malattie correlate. Mediante l osservazione diretta su alveari nel secondo anno di progetto sarà verificata l efficacia acaricida dei diversi principi attivi oggetto del presente progetto (neem, timolo ed RNAi) impiegati con i dispositivi innovativi costruiti relazionando i risultati alle condizioni climatiche (in particolare la temperatura esterna) e considerandone la tossicità in vivo per le api. /C

38 ;!#923&%21()*.#'.33F.77(:2:(2#2*%(+(,23.#'.3#6,)')%%)#2#<25.#'(#>-0(## In fase di realizzazione. In questa attività, che sarà completata per la fine del progetto (dicembre 2012), è prevista la somministrazione del prodotto innovativo (RNAi) per la resistenza agli attacchi virali alle dosi suggerite dal produttore, verificando l efficacia dell applicazione ad intervalli di: 7, 14 e 30 giorni. Sarà testata anche l applicazione dell RNAi in diversi momenti dell anno (es. autunno o primavera). I gruppi d applicazione saranno di almeno 4 arnie per tesi sperimentale. Le arnie devono essere omogenee per forza della colonia, disposte su 10 telaini e dotate di fondo antivarroa. I parametri valutati saranno i seguenti: produzione di miele, diminuzione dei livelli di infezione virale, eventuale evoluzione di altre patologie associate alle virosi (es. Nosema spp.), forza delle famiglie (n di telaini ricoperti da api), quantità di covata, mortalità delle api o delle regine. /K

39 ;8#923&%21()*.#'.(#6,)%):)33(#(**)+2%(+(#6.,#32#3)%%2#2332#+2,,)2# In fase di realizzazione. Nella sperimentazione in campo, che sarà completata per la fine del progetto (dicembre 2012), saranno costituiti dei gruppi di trattamento di almeno 8 alveari finalizzati a confrontare l efficacia acaricida di diversi protocolli di lotta alla varroa. Nei gruppi sarà anche incluso un numero di alveari in cui non verrà somministrato alcun trattamento (controllo). Per le diverse tesi sperimentali, saranno monitorati i seguenti indicatori di efficacia del protocollo: quantità di miele prodotto, vitalità delle colonie (mediante conta delle api morte cadute nelle gabbie underbasket, numero di favi occupati dalle api adulte, numero di telaini di covata), quantificazione dei patogeni oggetto dello studio (virus e varroa) e di altri eventuali patogeni associati (es. Nosema spp.), efficacia acaricida ed antivirale. Lì dove saranno effettuati trattamenti con neem, si procederà alla determinazione della presenza di residui nel miele prodotto, attraverso analisi LC-MS, indispensabili per garantire la qualità del miele prodotto /P

40 & ;;#E)*(%),2GG()#.#5%&'()#'(#26(2,(#56)6)32%(#)'#2#,(5:D()#'(#56)6)32/.*%)# Grazie all osservazione dal vivo di fenomeni di moria/spopolamento di alveari è stato possibile costruire la tabella riassuntiva di seguito riportata in cui si correlano le perdite di alveari evidenziate con i diversi protocolli di lotta alla varroa messi in atto dagli apicoltori. Tabella- Risultati delle visite in apiario in caso di moria/spopolamento di alveari Casi di moria/ spopolamento Motivo del sopralluogo Correlazione tra il fenomeno di moria/spopolamento con i protocolli di lotta alla varroa adottati Caso 1 moria e spopolamento Varroatosi e virosi associate (mancato trattamento acaricida invernale). Alcune famiglie erano affette da patologie denunciabili (Peste americana, peste europea, nosemosi) Caso 2 moria e spopolamento Varroatosi e virosi associate (mancato trattamento acaricida invernale). Alcune famiglie erano affette da (Peste americana Caso 3 moria Varroatosi e virosi associate(mancato trattamento acaricida invernale). Avvelenamento da sostanze presenti in una discarica limitrofa allo apiario. Caso 4 spopolamento Forte sospetto di avvelenamento da agro farmaci (sintomi acuti sulle api adulte di tremori e movimenti sconnessi) Indebolimento delle famiglie per trattamento acaricida ripetuto in periodo invernale (9 volte AO gocciolato nei mesi invernali) Caso 5 moria Avvelenamento da trattamenti fitosanitari su mais. Alcune famiglie erano morte per Peste Americana Caso 5 moria e spopolamento Avvelenamento da agro farmaci su trattamento della vite Caso 6 moria varroatosi e virosi associate (gran parte delle famiglie presenti in 7Q

41 apiario presentavano Parasitic Mite Syndrome) (mancato trattamento acaricida estivo). Caso 7 moria Varroatosi e virosi associate (Errore gestionale: trattamento con timolo nel periodo ottobre-novembre). Avvelenamento per presenza di una industria di confetture e conserve nel raggio di 300 m dall apiario. Caso 8 moria e spopolamento Avvelenamento da diserbanti glifosati (Klorane) Varroatosi (l apicoltore non ha realizzato alcun trattamento acaricida estivo) Caso 9 moria e spopolamento Varroatosi e virosi asosciate (L apicoltore non tratta da anni per la varroa). Avvelenamento doloso da parte di un vicino Caso 10 moria Varroatosi e virosi associate (l apicoltore non ha eseguito alcun trattamento acaricida invernale ed ha trattato quale trattamento estivo le famiglie con APIGUARD in periodo non idoneo: settembre-ottobre 2010 Caso 11 moria e spopolamento Lo spopolamento è verosimilmente da attribuire a fenomeni di avvelenamento oppure a virosi particolarmente gravi Caso 12 spopolamento Varroatosi generalizzata a tutto l apiario (mancato trattamento con acido ossalico per ritardi nell arrivo di Api-Bioxal). Avvelenamento per trattamento fitosanitario contro la mosca dell olivo realizzato con Imidacloprid (Confidor) e Dimetoato. Caso 13 moria e spopolamento L apicoltore ipotizza un avvelenamento da agrofarmaci per il trattamento di coltura di sorgo, girasole e vite. ' Si realizzerà infine, entro la fine del progetto, una attività di monitoraggio in campo di apiari a rischio di spopolamento in quanto affetti da varroatosi e/o malattie correlate (virosi e nosemiasi), 7!

42 per verificare l andamento delle popolazioni di api mediante loro conteggio in entrata/uscita impiegando i dispositivi messi a punto. Si provvederà infatti ad installare i dispositivi di conteggio delle api, prevedendo un sistema affidabile di acquisizione e immagazzinamento dei dati basato su datalogger e/o rete senza filo per il trasferimento di dati ad una unità centrale. 7#

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