protozoi ematici Plasmodi Trypanosomi Tec. Maria Gobbo Servizio Autonomo di Epidemiologia e Laboratorio di Malattie Tropicali (SAELMT)

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1 Plasmodi protozoi ematici Trypanosomi Tec. Maria Gobbo Servizio Autonomo di Epidemiologia e Laboratorio di Malattie Tropicali (SAELMT)

2 In laboratorio: Riconoscere la presenza del parassita Definire la specie Plasmodiumfalciparum Plasmodiumvivax Plasmodiumovale Plasmodiummalariae Plasmodiumknowlesi Carica parassitaria

3 Raccolta del campione OTTIMALE SANGUE SENZA ANTICOAGULANTE l'anticoagulante potrebbe provocare modificazioni morfologiche dei globuli rossi parassitati e dei parassiti stessi. SANGUE VENOSO SENZA ANTICOAGULANTE Preparare le gocce spesse e gli strisci sottili a partire dal prelievo di sangue prima di farlo defluire in una provetta con l anticoagulante SANGUE VENOSO CON ANTICOAGULANTE Quando i preparati non possono essere allestiti immediatamente, il campione di sangue viene raccolto in una provetta contenente l anticoagulante. I preparati devono essere allestiti nel piùbreve tempo possibile (massimo un ora dal prelievo) pena l introduzione di possibili modificazioni morfologiche a carico dei globuli rossi parassitatie del parassita stesso. SANGUE CAPILLARE DAL POLPASTRELLO Fare attenzione a non utilizzare sangue coagulato.

4 Esami Diagnosi parassitologica diretta Emoscopia Antigeni PCR Emoscopiaconvenzionale (G.S. e S.S.) Colorazione dei preparati ematici con coloranti fluorescenti Quantitative BuffyCoat (QBC) centrifugazione/colorazione fluorocromica Test rapidi (metodi immuno-cromatografici) Ibridazione con sonde di DNA Diagnosi parassitologicaindiretta Anticorpi Sierologia (IHA, IF, ELISA)

5 Diagnosi parassitologicadiretta la Goccia Spessa Emoscopia convenzionale

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7 Emoscopia convenzionale lo Striscio Sottile

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9 Emoscopia convenzionale Colorazione: Giemsa, Field, M.G.-G.

10 Colorazione

11 LETTURA DEI PREPARATI Goccia spessa: positivo/negativo Striscio sottile: diagnosi di specie Indice di parassitemia: gravità

12 INDICE DI PARASSITEMIA Su goccia spessa ci sono pochi parassiti Quando

13 INDICE DI PARASSITEMIA Su goccia spessa Su striscio sottile Quando Quando il numero di parassiti e tale che la loro conta risulta essere molto imprecisa

14 INDICE DI PARASSITEMIA Su goccia spessa Su striscio sottile Quando Quando Indice di gravità: >= 5% >= parassiti/ml

15 emazia Emazia parassitata parassita granulazioni pigmento vacuolo nucleo citoplasma

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17 LE FORME DEL PARASSITA Trofozoite Schizonte Gametocita

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24 Pro Emoscopia convenzionale (goccia spessa e striscio sottile) CNecessitàdi microscopio ottico CRelativamente rapido, poco costoso (ma tempo dell operatore) CPossibilitàdi diagnosi di specie CStima quantitativa della parassitemia CRiconoscimento delle diverse forme di sviluppo del parassita Contro DNecessità di un operatore esperto

25 Quantitative buffy coat(qbc)

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27 Sensibilitàe specificità del QBC nella diagnosi di malaria a bassa parassitemia (< 10 parassiti/µl) comparati all emoscopia convenzionale Sensibilità Specificità QBC 98% 100% Trop.Med. 1995, Z. Bisoffi

28 Quantitative buffy coat(qbc) pro CRapida esecuzione CDiagnosi rapida CStima quantitativa della parassitemia contro D Equipaggiamento specifico D Necessità di microscopio a fluorescenza D Relativamente costoso D Non differenziazione delle specie D Difficile riconoscimento diverse forme di sviluppo del parassita

29 Test immunocromatografico 3 antigeni: -una proteina ricca di istidina2 di P. falciparum(pfhrp2); - Plasmodium aldolasi; -il lattatodeidrogenasi parassita specifico (pldh).

30 3 antigeni: Istidina proteinaricca di 2 P. falciparum (PfHRP2) èuna proteina solubilein acqua che viene prodotta dagli stadiasessuali e gametociti di P. falciparum, espressa sulla superficie della membranaeritrocitaria. Si èdimostratochequestoantigene puòrimanere nelsangue per almeno28 giorni dopol'iniziodella terapia antimalarica(antigene liberoo complessi antigene-anticorpo). Plasmodium aldolasi èun enzima della via glicolitica espresso dalle quattro specie di plasmodi. Lattatodeidrogenasi parassita (pldh) èun enzima glicolitico solubile prodotto dagli stadi asessuali e sessuali dei parassiti vivi ed è presente e rilasciato dagli eritrociti parassiti infetti. E 'stato trovato in tutti e 4 i tipi di malaria umana ed esistono per ciascuna delle quattro specie differenti isomeri di pldh.

31 Test immunocromatografico pro CElevata sensibilitàe specificità CSemplicità e rapiditàdi esecuzione CNon necessitàdi strumenti di laboratorio CConservazione a temperatura ambiente contro DNon permettono di ottenere informazioni quantitative e sugli stadi del parassita DAntigenemiapermanente dopo trattamento nelle infezioni ad alte cariche DPossibile cross-reazione dell PfHRP2 con le altre specie DPossibiliàdi falsi negativi a cariche parassitarie elevate (effetto prozona)

32 PolymeraseChainReaction (PCR) PCR Sensibilità Specificità 100% 100%

33 PolymeraseChainReaction (PCR) pro CElevata sensibilitàe specificità CStudio del polimorfismo genico CStudio chemioresistenze contro DNon rapiditàdi esecuzione DNecessitàdi ambienti, strumentazione appositi D Necessitàdi un operatore esperto DAlto costo

34 Diagnosi parassitologica indiretta Metodi sierologici Ricerca di anticorpi anti-p. falciparum

35 Metodi sierologici pro CDiagnosi in condizioni cliniche particolari ( paludismoviscerale cronico) CUtilizzo in indagini epidemiologiche e/o screening di donatori di sangue contro DNon permette diagnosi rapida DRivelano solo anticorpi

36 MALARIA Caratteristiche di un metodo per la conferma diagnostica C Rapidità C Sensibilità C Specificità C facilità di esecuzione ed interpretazione CBasso costo

37 G.S./S.S. QBC ICT PCR rapidità sensibilità specificità facilità di esecuzione ed interpretazione basso costo rapidità sensibilità specificità facilitàdi esecuzione ed interpretazione basso costo rapidità sensibilità specificità facilitàdi esecuzione ed interpretazione basso costo rapidità sensibilità specificità facilitàdi esecuzione ed interpretazione basso costo

38 Trypanosomi

39 DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA T. cruzi T. rangeli?? T.bruceigambiense T.bruceirhodesiense

40 Tripanosoma nell uomo Forma Trypomastigote Flagello Cinetoplasto Membrana ondulante Blefaroplasto Nucleo

41 Metodi diagnostici T.b.rhodesiense: fase acuta esame diretto sangue periferico o liquor T.b. gambiense: T. cruzi: T. rangeli:

42 Esame diretto T.b. gambiense/ T.b. rhodesiense

43 Metodi diagnostici T.b.rhodesiense: fase acuta esame diretto sangue periferico o liquor T.b. gambiense: T. cruzi: fase acuta esame diretto sangue periferico o T. rangeli:

44 Esame diretto T.b. gambiense/ T.b. rhodesiense

45 Metodi diagnostici T.b.rhodesiense: fase acuta esame diretto sangue periferico o liquor T.b. gambiense: T. cruzi: fase acuta esame diretto sangue periferico o ricerca con MHT T. rangeli:

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49 Metodi diagnostici T.b.rhodesiense: fase acuta esame diretto sangue periferico o liquor T.b. gambiense: T. cruzi: fase acuta fase cronica esame diretto sangue periferico o ricerca con MHT sierologia, T. rangeli:

50 I.H.A. C.A.T.

51 Metodi diagnostici T.b.rhodesiense: fase acuta esame diretto sangue periferico o liquor T.b. gambiense: T. cruzi: fase acuta fase cronica esame diretto sangue periferico o ricerca con MHT sierologia, ricerca con MHT, tripla centrifugazione o ricerca in linfonodo T. rangeli:

52 Metodi diagnostici T.b.rhodesiense: fase acuta esame diretto sangue periferico o liquor T.b. gambiense: T. cruzi: fase acuta fase cronica fase acuta esame diretto sangue periferico o ricerca con MHT sierologia, ricerca con MHT, tripla centrifugazione o ricerca in linfonodo esame diretto cute, in sangue periferico o con MHT T. rangeli:

53 Trypanosoma cruzi Esame diretto sangue periferico

54 Metodi diagnostici T.b.rhodesiense: fase acuta esame diretto sangue periferico o liquor T.b. gambiense: T. cruzi: fase acuta fase cronica fase acuta fase cronica esame diretto sangue periferico o ricerca con MHT sierologia, ricerca con MHT, tripla centrifugazione o ricerca in linfonodo esame diretto cute, in sangue periferico o con MHT sierologia, T. rangeli:

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56 Metodi diagnostici T.b.rhodesiense: fase acuta esame diretto sangue periferico o liquor T.b. gambiense: T. cruzi: fase acuta fase cronica fase acuta fase cronica esame diretto sangue periferico o ricerca con MHT sierologia, ricerca con MHT, tripla centrifugazione o ricerca in linfonodo esame diretto cute, in sangue periferico o con MHT sierologia, PCR ricerca con MHT, o esame istologico T. rangeli:

57 PCR Amastigoti in muscolo cardiaco

58 Metodi diagnostici T.b.rhodesiense: fase acuta esame diretto sangue periferico o liquor T.b. gambiense: T. cruzi: fase acuta fase cronica fase acuta fase cronica esame diretto sangue periferico o ricerca con MHT sierologia, ricerca con MHT, tripla centrifugazione o ricerca in linfonodo esame diretto cute, in sangue periferico o con MHT sierologia, PCR ricerca con MHT, o esame istologico T. rangeli: esame diretto sangue periferico

59 Trypanosoma rangeli

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