UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TORINO

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TORINO FACOLTÀ DI AGRARIA CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE VEGETALI CURRICULUM BIOLOGIA VEGETALE TESI DI LAUREA Bioprotezione di prodotti da forno mediante l utilizzo di batteri lattici con attività antifungina Relatore: Prof. Luca Simone Cocolin Correlatore: Dott.ssa Valentina Alessandria Candidato: Sara Oglietti Anno accademico 2010/2011 0

2 1. Introduzione I microrganismi hanno un ruolo fondamentale nelle trasformazioni alimentari perché sono in grado, con la loro attività metabolica, di modificare notevolmente le caratteristiche chimicofisiche e organolettiche delle materie prime utilizzate. Nei processi industriali di produzione degli alimenti, i microrganismi possono essere coinvolti direttamente come agenti di trasformazione nelle fermentazioni, indirettamente come alteranti (che rendono l alimento inaccettabile dal punto di vista sensoriale) o patogeni (che possono determinare l insorgenza di patologie umane dopo l ingestione del prodotto). La microbiologia degli alimenti studia i microrganismi che sono presenti naturalmente, introdotti intenzionalmente o contaminanti dei prodotti alimentari. Questi microrganismi possono essere desiderati perché con la loro presenza ed attività biochimica possono trasformare materie prime in prodotti finiti con una shelf life (o vita commerciale) più estesa nel tempo e con caratteristiche organolettiche apprezzate dal consumatore finale. Esempi di prodotti di questo genere sono costituiti da formaggi, salumi, birra e vino (Cocolin e Comi, 2007). L abilità dei singoli gruppi di microrganismi di sopravvivere e duplicare in un determinato ecosistema alimentare in condizioni dinamiche determinerà la microflora dell alimento, definito come il consorzio di microrganismi presenti in un determinato ambiente. Parametri intrinseci (che sono propri dell alimento in sé) ed estrinseci (identificati nelle caratteristiche dell ambiente circostante, influenzanti sia l alimento stesso sia i microrganismi in esso contenuti) possono essere manipolati al fine di limitare la crescita e l attività microbica ed in questo modo conservare gli alimenti (Cocolin e Comi, 2007). Tra i parametri intrinseci si possono elencare: il contenuto di acqua: è definito dall attività dell acqua (A w ), che descrive le molecole di acqua che sono disponibili per il microrganismo in un ecosistema alimentare. I microrganismi possiedono esigenze diverse riguardo all attività dell acqua, ma in generale, dato che tutte le reazioni biologiche necessitano di un ambiente acquoso, ci si aspetta che una riduzione del valore di A w abbia un immediato effetto sul metabolismo e sullo stato fisiologico generale della cellula. il ph: la maggior parte dei microrganismi d interesse alimentare cresce a valori di ph vicini alla neutralità. Negli alimenti, i valori di ph variano da neutro ad acido: l acidità può essere inerente alla tipologia di alimento, oppure può essere il risultato di attività microbica (è il caso dei prodotti fermentati). Con le fermentazioni alimentari, vengono prodotti acidi organici deboli (pk a elevata) che possono diffondere attraverso la 2

3 membrana cellulare, dissociarsi all interno della cellula e di conseguenza diminuire il ph intracellulare. Ciò è importante per proteggere gli alimenti da microrganismi alteranti e patogeni. i composti naturalmente presenti che possono facilitare o inibire la crescita microbica: ciò dipende dalla matrice alimentare presa in considerazione. il potenziale ossidoriduttivo: è in funzione della capacità di crescita dei microrganismi in presenza di ossigeno. Le differenze tra i microrganismi sono basate sul fatto che l ossigeno può generare composti tossici a livello cellulare (intermedi reattivi dell ossigeno, detti ROS): esistono gruppi di microrganismi dotati di enzimi detossificanti (aerobi, anaerobi facoltativi), mentre altri gruppi non li possiedono (anaerobi stretti). la presenza di nutrienti: i microrganismi per proliferare hanno bisogno di nutrienti. In particolare, in ogni alimento che funga da substrato per la crescita microbica, deve essere sempre presente una fonte di carbonio ed energia (zuccheri, amminoacidi e alcoli), una fonte di azoto (amminoacidi e nucleotidi), minerali, vitamine e fattori di crescita. Tra i parametri estrinseci si ritrovano: la temperatura: è il parametro più importante che permette di suddividere i microrganismi in diversi gruppi in base alla loro capacità di crescere in specifici intervalli di temperatura. Il cambiamento della temperatura durante il processo produttivo (pastorizzazione e sterilizzazione) e durante la conservazione (refrigerazione e congelamento) è una tecnica molto utilizzata per salvaguardare la qualità degli alimenti. l atmosfera circondante l alimento: tale condizione deve essere controllata in base alle caratteristiche del microrganismo e dell alimento stesso, in modo da garantire la migliore produzione e conservazione. Esistono diversi metodi di confezionamento in atmosfera modificata impiegati per modificare l ambiente gassoso, utilizzando l anidride carbonica come gas preservante (Jay et al., 2009). 1.1 La bioprotezione Le tossinfezioni alimentari rappresentano un crescente problema per la salute pubblica a livello internazionale. Sono conosciute attualmente oltre 250 malattie trasmesse attraverso gli alimenti, causate da diversi agenti patogeni, come batteri, muffe, virus e parassiti. La conservazione biologica degli alimenti attraverso l'impiego di colture starter e colture di batteri produttori di batteriocine in combinazione con altre tecnologie di conservazione, può rappresentare per le 3

4 industrie alimentari un modo efficace per poter fronteggiare le nuove tendenze alimentari espresse dai consumatori e allo stesso tempo garantire la dovuta qualità e sicurezza dei prodotti commercializzati. Naturalmente il successo di questi sistemi di produzione e conservazione è strettamente associato ai continui sviluppi delle conoscenze che emergono dalla ricerca applicata ad ogni specifico sistema alimentare. Nell'ultimo decennio si è definito un nuovo approccio alla stabilizzazione degli alimenti, chiamato bioprotezione (o bioconservazione), che si basa sull'antagonismo dimostrato da alcuni microrganismi nei confronti di altri; in particolare i batteri lattici rappresentano un gruppo di microrganismi che può svolgere un ruolo protettivo contrastando lo sviluppo di microrganismi patogeni (Cocolin et al., 2010). I batteri lattici, infatti, sono spesso utilizzati come colture starter, in quanto, oltre a determinare (insieme ad altre famiglie di batteri) il flavour del prodotto, hanno un importante effetto protettivo, che si riflette anche in un prolungamento della shelf life. La fermentazione dei carboidrati presenti nella materia prima determina un abbassamento del ph in seguito alla produzione di acido lattico che disturba l'omeostasi del microrganismo patogeno e quindi la sua sopravvivenza. La richiesta da parte dei consumatori di alimenti sempre più sani e naturali, spinge i produttori ad abbandonare, dove possibile, gli agenti chimici. Come conseguenza l interesse per agenti microbici naturali sta crescendo di anno in anno. I microrganismi, per loro stessa natura, sono in grado di attivare una serie di sistemi difensivi estremamente varia. Tra questi sistemi rientrano i classici antibiotici, svariati agenti litici, diversi prodotti del metabolismo batterico, varie tipologie di esotossine, e le batteriocine. Nell ambito della conservazione e della qualità alimentare, lo studio sulle batteriocine prodotte dai batteri lattici assume un ruolo fondamentale (Cocolin et al., 2010). Queste sostanze sono in prevalenza di tipo proteico, biologicamente attive sintetizzate a livello ribosomiale ed eventualmente modificate post-traduzionalmente, in grado di esercitare attività battericida nei confronti di altre specie batteriche, ma non sul microrganismo produttore. Le batteriocine sono, infatti, capaci di inibire la crescita di microrganismi, in alcuni casi anche patogeni. Numerosi studi hanno descritto che queste molecole non sono attive contro microrganismi eucarioti, come lieviti o muffe (Batish et al., 1996; Daliè et al., 2009). Con il termine batteriocine, coniato nel 1953 da Jacob e collaboratori, vengono indicate quelle molecole proteiche di produzione batterica generate indifferentemente da Gram-positivi e da Gram-negativi e dotate di attività inibitoria nei confronti di ceppi batterici diversi dal ceppo produttore (Figura 1.1). Le batteriocine prodotte dai batteri Gram negativi sono generalmente proteine ad elevato peso molecolare che presentano un caratteristico dominio, specifico per 4

5 l adesione, la traslocazione o l attività di killing della batteriocina stessa, mentre le batteriocine prodotte dai batteri Gram positivi sono generalmente peptidi cationici, di piccole dimensioni e termostabili, inizialmente sintetizzati come pre-peptidi e che, in seguito a fenomeni di scissione, si trasformano nelle molecole biologicamente attive. I geni che codificano per le batteriocine prodotte dai batteri Gram negativi risultano localizzati a livello plasmidico, mentre i geni che codificano per le batteriocine prodotte dai Gram positivi possono essere presenti sia a livello plasmidico che cromosomico, ed inoltre si localizzano specificamente in strutture multigene operone-simili; il corredo genetico deputato alla produzione delle batteriocine ad opera dei Gram positivi risulta anche estremamente più ampio rispetto a quello dei Gram negativi. Le batteriocine prodotte dai batteri Gram negativi si differenziano rispetto a quelle elaborate da microrganismi Gram positivi in quanto le prime agiscono mediante formazione di canali ionici a livello di membrana citoplasmatica e mostrano, una volta penetrate nella cellula sensibile/target, una spiccata attività nucleasica, mentre le seconde sono membrana-attive, ossia operano direttamente a livello di membrana. Lo spettro d inibizione delle batteriocine prodotte dai Gram negativi è strettamente correlato alla specie produttrice, mentre le batteriocine prodotte dai Gram positivi si dimostrano attive non solo verso altri batteri Gram positivi ma, occasionalmente, anche verso microrganismi Gram negativi (Raffi e Ossiprandi, 2006). Figura 1.1: i batteri lattici possono produrre diversi composti antimicrobici, ma le batteriocine sono spesso i più potenti inibitori di batteri patogeni. Un produttore di batteriocine (in alto) può essere identificato dalle zone di inibizione prodotta in una capsula petri contenente cellule di batteri sensibili ad esse (Deegan et al., 2006) 5