1. Quantificazione del genomico e determinazione della purezza

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1 ESERCITAZIONE 2 1. Quantificazione del genomico e determinazione della purezza Una volta estratto il DNA si procede con la quantificazione. Tale quantificazione viene fatta normalmente con l utilizzo di uno spettrofotometro in grado di leggere assorbanze a 260 nm e 280 nm. Il metodo spettrofotometrico sfrutta la capacità degli acidi nucleici di assorbire la luce UV con un massimo di assorbimento ad una lunghezza d'onda di 260 nm, lo spettro di assorbimento varia da 230nm a 280 nm. Noi utilizzeremo uno spettrofotometro di nuova generazione, Nanodrop, che ci permette di utilizzare un volume molto piccolo (1µl) per poter quantificare i nostri campioni. La lettura delle assorbanze viene effettuata leggendo: 1. Il rapporto A260/A280: usato per stimare la purezza degli acidi nucleici, dal momento che le proteine assorbono a 280 nm. Rapporto A260/A280 = indice della contaminazione da proteine. I rapporti di purezza sono normalmente di: per il DNA e per l RNA. Rapporti superiori indicano una contaminazione da proteine. L assorbanza a 230 nm riflette la contaminazione del campione dovuta a sostanze come carboidrati, fenoli, peptidi o composti aromatici. (Fig. 2 e 3) 2. Rapporto A260/A230 = indice della contaminazione da carboidrati e fenoli (solventi) Il valore ottimale di questo rapporto e di circa 2.2. Rapporti inferiori indicano contaminazione da solventi. Un esempio di spettro di assorbimento che rispecchia una ottima qualità dei campioni è raffigurato in figura Esempio di spettro di assorbimento degli acidi nucleici 1

2 Fig 2 e 3 Esempi di spettri di assorbimento con contaminazioni (Genomico poco puro). 2

3 2. PCR (Polymerase chain reaction) La PCR è un metodo rapido e semplice utile per amplificare DNA, messo a punto dal biochimico Kary Mullis alla fine degli anni 80. Lo scopo della PCR è di produrre un enorme numero di copie di una sequenza di DNA, sia essa un gene o parte di questo. L unica condizione è che si conosca almeno in parte la sequenza nucleotidica del gene che deve essere copiato. Componenti principali della PCR sono: 1. DNA stampo, che contiene il frammento da amplificare; 2. Taq DNA Polimerasi ( da Thermus acquaticus), che copia la regione da amplificare (si usano le DNA polimerasi di batteri termofili, che sono stabili ad elevate temperature;); 3. Due primers forward e reverse che determinano l inizio e la fine della regione da amplificare; NB. I Primer, a partire dai quali la DNA polimerasi inizia a sintetizzare le catene complementari, delimitano il frammento di DNA bersaglio. 4. Nucleotidi (dntps), per la sintesi di nuovo DNA; 5. Buffer, che fornisce l ambiente chimico ideale per la DNA Polimerasi. 6. MgCl 2 usato come tampone di reazione, cofattore essenziale per il funzionamento della polimerasi, inoltre il il Mg 2 influenza l appaiamento dei primer al filamento stampo. Maggiore è la concentrazione minore sarà la specificità di appaiamento. Nb. Una alta stringenza si otterrà ad alta temperatura di annealing e bassa concentrazione di MgC l2 Il processo della PCR consta di tre steps principali che vengono ripetuti dalle 30 alle 40 volte, attraverso l utilizzo di un termociclatore. (Fig.3) 1) Denaturazione a 94 C (Melting): Durante la denaturazione, i due filamenti di DNA si separano e tutte le reazioni enzimatiche si arrestano, questa fase dura 1-2 minuti. 2) Annealing a C: La temperatura di questo stadio dipende dai primers usati. Questa fase 1-2 minuti ed avviene ad una temperatura inferiore a quella di denaturazione. Tale temperatura viene calcolata mediantel applicazione della formula empirica: T= 2*(A+T)+4*(G+C) dove ATGC sono il numero di nucleotidi presenti nei primer Durante l annealing vengono utilizzati due primers (Forward e Reverse), che si legano ai loro siti specifici. Si formano e si rompono continuamente i legami ionici tra i filamenti dei primers ed i singoli filamenti di DNA che funzionano da templato (filamento stampo). I primers che si appaiano esattamente con il filamento stampo formano i legami più stabili ed, in questo piccolo tratto di doppia elica, si lega la polimerasi, che così inizia a copiare il filamento stampo; 3

4 3) Estensione a C (Elongation): La temperatura di elongation dipende dalla DNA Polimerasi, solitamente 72 C. Durante l estensione, la Polimerasi estende i primers aggiungendo le basi (complementari al templato) all estremità 3. Il risultato sono 2 copie di DNA a doppio filamento. Questa fase dura circa 1-3 minuti. Fig. 3 -Fasi schematiche della PCR Caratteristiche della PCR Si possono utilizzare piccole quantità di DNA(ng); La qualità del DNA può anche non essere buona; Alta riproducibilità, specificità e sensibilità; Applicazioni cliniche e nella ricerca; Molto rapida e poco costosa; 4

5 Utilizzo della PCR Diversi tipi di analisi tra cui: Genetic fingerprinting, test di paternità, studi di evoluzione e filogenesi; identificazione di malattie; clonaggio di un gene; genotipizzazione di specifiche mutazioni e polimorfismi. 3. Elettroforesi su gel di agarosio L elettroforesi su gel è la tecnica più usata per separare proteine ed acidi nucleici in base alle loro dimensioni. L'apparecchiatura per l'elettroforesi è composta fondamentalmente da due parti: un alimentatore ed una cella elettroforetica. L'alimentatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi applicati alla cella elettroforetica e pertanto i cationi migrano verso il catodo e gli anioni verso l'anodo ad una velocità che dipende dall'equilibrio che si instaura tra le forze di spinta del campo elettrico e le forze frenanti esistenti tra ioni e mezzo circostante. (Fig.4) L'elettroforesi viene solitamente condotta su un supporto inerte ed omogeneo, il campione viene caricato in pozzetti, solitamente organizzati in pettini., Figura 4 Movimenti di ioni in un campo elettrico La mobilità elettroforetica di una molecola carica, µ, sarà uguale a: µ = V/E dove V è la velocità della particella (molecola) ed E è il potenziale elettrico. D altra parte V è direttamente proporzionale ad E ed alla carica della molecola, q, ed è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità del mezzo in cui si muove (forze frizionali f o resistenza): V = Eq/f dove f = 6πr η 5

6 Il gel può essere composto da: 1. Poliacrilammide: un polimero con legami crociati, che, formando un setaccio molecolare, diminuisce la mobilità elettroforetica delle molecole in funzione delle loro dimensioni e migliora quindi la loro separazione. Utilizzato ad alta concentrazione permette di separare frammenti che differiscono per un solo nucleotide. 2. Agarosio: polimero di glucosio che forma un reticolo poco compatto. Poiché negli acidi nucleici densità di carica e forma sono pressoché costanti, la velocità di migrazione dipende dalla lunghezza dei frammenti: i frammenti più corti migreranno più velocemente. Gli acidi nucleici a ph 7-8 portano numerose cariche negative dovute ai gruppi fosfato, e in un campo elettrico migrano verso il polo positivo: i frammenti più piccoli si muovono nel gel più velocemente di quelli a maggiori dimensioni rendendo quindi possibile la separazione di molecole a differente lunghezza. Il metodo più semplice e più utilizzato è l elettroforesi orizzontale su gel di agarosio in un tampone, a ph 8.0, che può essere: 1. TBE (Tris-borato EDTA) ha una migliore capacità tamponante e fornisce una più accurata risoluzione. E in grado di inibire la DNA ligasi che può causare problemi nel caso si volesse procedere con la purificazione o la ligazione del DNA. Generalmente più costoso. 2. TAE (Tris-acetato EDTA) permette una maggiore velocità di migrazione del DNA ed è meno caro. La funzione del EDTA in entrambi i buffer è quella di sequestare i cationi bivalenti. La migrazione viene visualizzata ad un transilluminatore, tale visualizzazione è permessa dall aggiunta di un colorante fluorescente che si lega al DNA intercalandosi tra le coppie di basi e che mostra una forte fluorescenza quando illuminato con luce ultravioletta. Da queste considerazioni possiamo quindi affermare che è fondamentale conoscere a priori la dimensione del nostro frammento per: preparare il gel alla giusta concentrazione di agarosio ( vedi Tabella 1) per permettere la giusta migrazione nella cella elettroforetica e determinarne il voltaggio in funzione anche della grandezza della cella Tabella 1 Riferimenti generali per la % di agarosio in funzione della dimensione del DNA 6

7 All aumentare della concentrazione di agar presente nel gel si diminuisce la dimensione delle maglie del gel, in tal modo le molecole più piccole riusciranno a correre verso l elettrodo positivo più facilmente. scegliere il marker da utilizzare per avere un riferimento e controllare l amplificazione al transilluminatore (Es. Fig 4) Ladder Ladder 300bp 200bp Fig. 4 Esempio di corsa su gel di agarosio di prodotti di PCR a diverse concentrazioni per due coppie di primer specifici per Pseudomonas syringae pv. actinidiae e Ladder di riferimento 100bp. Pozzetti da sinistra con amplificato di 280bp Pozzetti con amplificato di 175 bp. Un ultimo esempio: tecniche di fingerprinting molecolare per l analisi della variabilità (Fig.5). In questo tipo di analisi è fondamentale scegliere il giusto voltaggio, le concentrazioni di agarosio e il marker da utilizzare per permettere la separazione dei frammenti a diverso peso molecolare e poterli identificare. Solitamente per queste tecniche, sulla base delle precedenti considerazioni, si utilizza una maggiore quantità di agar ad un voltaggio più lento. Figura 5 Esempio di corsa su gel di agarosio Fingerprintig molecolare su Psa. 7