PCR. (Reazione a Catena della Polimerasi) Kary Mullis

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1 POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR PCR Polymerase Chain Reaction (Reazione a Catena della Polimerasi) Kary Mullis Premio Nobel per la Chimica nel 1993, Kary Mullis è divenuto una leggenda per la scoperta della Reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction o PCR) una tecnica che ha rivoluzionato il mondo della chimica e della Biologia Molecolare, permettendo lʼamplificazione in vitro di frammenti di DNA, con innumerevoli applicazioni in campo biologico, medico, agrario, e nelle investigazioni della magistratura. Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) E un procedimento molto semplice che consente di ottenere un numero elevatissimo di copie di uno specifico segmento di DNA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 2. La PCR è una tecnica molto sensibile che consente di rivelare la presenza del DNA o dell RNA di interesse partendo da quantità minime di materiale biologico 1

2 Estensione - Forcina di Replicazione Leading Strand (veloce) Lagging Strand (lento) Okazaki fragment DNA Polimerasi III RNA Primers Primasi sintetizza primers di RNA Single Strand Binding proteins (SSB)- Impediscono la rinaturazione del DNA Elicasi- srotola il DNA (DnaB) ELEMENTI NECESSARI PER LA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE Primers DesossiriboNucleotidi trifosfati (dntp) DESOSSIRIBOSIO Base Azotata (Adenina, Timina, Citosina, Guanina,) DNA polimerasi DNA STAMPO ELEMENTI FONDAMENTALI PER LA REAZIONE DI PCR UN CICLO DI PCR 1) Frammento di DNA contenente il segmento da amplificare 2) Coppia di inneschi (o primers) per la DNA Polimerasi: oligonucleotidi lunghi basi, di sequenza complementare a quelle fiancheggianti il segmento di DNA da amplificare. Primer 1 Primer 2 3) TAQ DNA POLIMERASI 4) dntp (N= A, C, G, T) 5) Mg 2+ 6) Apparecchio per PCR (es. Thermocycler) 1. DENATURAZIONE: il DNA viene denaturato a 94 C per separare fra loro i due filamenti che formano la doppia elica. 2. ANNEALING: la temperatura scende a C (valore scelto in funzione della composizione in basi e della lunghezza degli inneschi) per consentire l appaiamento fra gli inneschi e le due eliche di DNA ad essi complementari 3. ESTENSIONE: La temperatura sale a 72 C e la Polimerasi sintetizza i nuovi filamenti di DNA partendo dai due inneschi in direzione utilizzando come stampo le due eliche di DNA. 2

3 Fase 2: ANNEALING I primers si appaiano alle sequenze complementari sul DNA stampo 94 C C Fase 3: ESTENSIONE La DNA polimerasi allunga gli inneschi e produce 2 nuove catene di DNA IL PROCESSO SI RIPETE 72 C 3

4 Ad ogni ciclo il numero di molecole di DNA copiato raddoppia DENATURAZIONE 94 C 3 min. PCR: AMPLIFICAZIONE ESPONENZIALE DEL DNA STAMPO ANNEALING 37 C - 65 C CICLI DENATURAZIONE 94 C ESTENSIONE 72 C 4

5 Resa teorica di una reazione di PCR a partire da una singola copia di DNA Numero di cicli ANDAMENTO TEORICO DELLA PCR Numero di molecole di amplificati n Y= numero molecole di DNA amplificato N= numero molecole di DNA di partenza n= numero dei cicli di PCR Y= N2 STESSA FORMULA CON FATTORE DI CORREZIONE CURVA DI REAZIONE PCR Y = N2 n-1 CICLO 3 CICLO 4 CICLO 5 CICLO 6 22=4 23=8 24=16 25=32 1) 2) Rappresentazione schematica dell aumento dei prodotti di amplificazione in funzione del numero di cicli di PCR. In questo caso, tra il 15 ed il 22mo ciclo esiste una relazione lineare tra il numero di cicli ed il prodotto di amplificazione ottenuto. Nei cicli successivi viene raggiunto il plateau. 5

6 OGNI CICLO DI PCR E COMPOSTO DA TRE FASI PCR Elettroforesi su gel di Agarosio 1. Denaturazione; 94 C 30 secs 1min 2. Annealing; 37 C - 65 C 30 secs 1min 3-4 ore 3. Estensione/Polimerizzazione; 72 C 1min Prodotto finale UV light ANALISI ELETTROFORETICHE L agarosio è uno zucchero che viene estratto da un alga marina, ed è un polimero di unità costituite da D-galattosio e 3,6- anidro L-galattosio. 6

7 LA PCR E UNA TECNICA DOTATA DI UNA ELEVATA SENSIBILITA : CONTAMINAZIONI DA DNA POSSONO RAPPRESENTARE UN PROBLEMA L IMPORTANZA DI UN CONTROLLO POSITIVO E NEGATIVO DELLA REAZIONE DI SOLITO SI USANO ZONE DI LAVORO DEDICATE, CAPPE PER PCR AD U.V. OTTIMIZZAZARE LE CONDIZIONI DI REAZIONE OTTIMIZZARE LE CONDIZIONI DI REAZIONE: I COMPONENTI PRINCIPALI X DNA/RNA: TESSUTI, CELLULE, SANGUE, BULBO PILIFERO, SALIVA, LIQUIDO SEMINALE DNA POLIMERASI TERMOSTABILE polimerasi OLIGONUCLEOTIDI progettati ad hoc! BUFFER Tris-HCl (ph ) Mg 2+ dntps (datp, dctp, dgtp, dttp) 7

8 OTTIMIZZAZARE LE CONDIZIONI DI REAZIONE: I COMPONENTI PRINCIPALI DELLA REAZIONE DNA/RNA: TESSUTI, CELLULE, SANGUE, BULBO PILIFERO, SALIVA, LIQUIDO SEMINALE DNA POLIMERASI TERMOSTABILE polymerase OLIGONUCLEOTIDI progettati ad hoc! BUFFER Tris-HCl (ph ) Mg2+ dntps (datp, dctp, dgtp, dttp) OTTIMIZZAZARE LE CONDIZIONI DI REAZIONE: I COMPONENTI PRINCIPALI DELLA REAZIONE DNA/RNA: TESSUTI, CELLULE, SANGUE, BULBO PILIFERO, SALIVA, LIQUIDO SEMINALE DNA POLIMERASI TERMOSTABILE polimerasi OLIGONUCLEOTIDI progettati ad hoc! BUFFER Tris-HCl (ph ) Mg2+ dntps (datp, dctp, dgtp, dttp) OTTIMIZZAZARE LE CONDIZIONI DI REAZIONE: I COMPONENTI PRINCIPALI DELLA REAZIONE DNA/RNA: TESSUTI, CELLULE, SANGUE, BULBO PILIFERO, SALIVA, LIQUIDO SEMINALE DNA POLIMERASI TERMOSTABILE polymerase OLIGONUCLEOTIDI progettati ad hoc! BUFFER Tris-HCl (ph ) Mg2+ dntps (datp, dctp, dgtp, dttp) 8

9 PRIMER DESIGN CARATTERISTICHE DEI PRIMERS USO DI SOFTWARES SPECIFICI OLIGO Medprobe PRIMER DESIGNER Sci Ed software Internet WEB SITE Lunghezza compresa tra basi Contenuto di G+C pari al % Valori di Tm simili. Evitare sequenze interne complementari FORMAZIONE DI DIMERI E DI LOOP CALCOLO DELLA Tm ACTG CAGT Tm = (log 10 [ J + ] (% G+C) - (600/l) ACTG [ J + ]= concentrazione di cationi monovalenti TGAC ACTG CAGT TGAC GTCA Per esempio: PCR buffer = 60 mm (J + ) Primers 20 mer 55% G+C Tm = = 53.8 Ta (annealing) = Tm (3-12 C) 9

10 OTTIMIZZAZARE LE CONDIZIONI DI REAZIONE: I COMPONENTI PRINCIPALI DELLA REAZIONE DNA/RNA: TESSUTI, CELLULE, SANGUE, BULBO PILIFERO, SALIVA, LIQUIDO SEMINALE DNA POLIMERASI TERMOSTABILE polymerase OLIGONUCLEOTIDI progettati ad hoc! BUFFER Tris-HCl (ph ) Mg2+ dntps (datp, dctp, dgtp, dttp) UN ESEMPIO TIPICO DI REAZIONE µl in tubini Eppendorf (0.5ml) COMPONENTI VOLUME Concentrazione Finale 10 X PCR Buffer (MgCl 2 ) 5µl 1X dntps (2mM) 5µl 200µM Upper primer (10pmols/µl) 5µl 1µM Lower primer (10pmols/µl) 5µl 1µM DNA Genomico da usare come stampo 500 ng/µl Thermostable polymerase (2U/ µl) 2µl 1µg 0.5µl 1 unit C 1 V 1 =C 2 V 2 H 2 O (50µl di volume Finale) 27.5µl Design primers with this sequence information Region to be amplified Identical to this sequence Reverse complement of this sequence 10

11 Primers Primers polymerase is thermostable Forward primer anneals to lower strand Reverse primer anneals to upper strand 11

12 synthesises DNA in the to direction synthesises DNA in the to direction synthesises DNA in the to direction synthesises DNA in the to direction 12

13 PCR CYCLE 2 PCR CYCLE 2 13

14 PCR CYCLE 2 PCR CYCLE 2 Two single strands of correct length PCR CYCLE 3 PCR CYCLE 3 14

15 PCR CYCLE 3 END OF PCR CYCLE 3 PCR CYCLE 4 PCR CYCLE 4 15

16 PCR CYCLE 4 PCR CYCLE 4 16