Identificazione di mutazioni e analisi dei polimorfismi del DNA

Dimensione: px
Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "Identificazione di mutazioni e analisi dei polimorfismi del DNA"

Transcript

1 Identificazione di mutazioni e analisi dei polimorfismi del DNA L identificazione delle mutazioni che causano malattie può oggi essere effettuata con metodiche relativamente semplici e pratiche in un laboratorio di Biologia Molecolare Clinica, mediante l uso della reazione PCR; essa ha anche un ruolo importante anche nello studio dei polimorfismi di restrizione in quanto come abbiamo visto evita il ricorso alla analisi di Southern, tecnica molto più lunga e complessa. Le tecniche di identificazione delle mutazioni basate sulla PCR sono numerose: in biologia molecolare clinica sono particolarmente importanti quelle che consentono di effettuare rapidamente gli screening di popolazione. Due sono i metodi principali per rivelare piccole mutazioni all interno di una sequenza genica a seconda che si tratti di individuare mutazioni già note oppure sconosciute. Nel primo caso la PCR permette di amplificare la sequenza di DNA contenente la mutazione bersaglio ed eventualmente visualizzarla direttamente sottoponendo il prodotto di PCR a separazione elettroforetica, oppure ricorrendo a trattamenti post-pcr che rivelano la variazione di sequenza nucleotidica. Nel secondo caso si tratta di tecniche che non presuppongono la conoscenza della mutazione da individuare e debbono essere in grado di analizzare qualunque tipo di variazione anomala in una sequenza di DNA. 1. Metodo diretto Il metodo diretto si basa sulla determinazione delle dimensioni del prodotto di amplificazione: si utilizza in caso di mutazioni che comportano grosse variazioni di dimensione del gene, come macro-delezioni o inserzioni che fanno si che l allele mutato all elettroforesi presenti bande di lunghezza anomala rispetto a quella di un allele normale. 2. Metodi post-pcr Se la mutazione non determina variazioni apprezzabili nella dimensione dell allele si dovrà ricorrere a trattamenti post-pcr, il più semplice dei quali è l analisi con enzimi di restrizione, specifiche attività enzimatiche con le quali si può tagliare e cucire il DNA. Gli enzimi di restrizione occupano un posto importante nella diagnostica molecolare perché consentono di riconoscere rapidamente variazioni di sequenza come mutazioni, polimorfismi, etc. Gli enzimi di restrizione sono in pratica delle endonucleasi, ricavate da batteri, che legano il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche originando tagli a doppio filamento all interno o in prossimità della sequenza stessa. Gli enzimi di restrizione vengono indicati con una nomenclatura che si basa sul genere e sulla specie del batterio dal quale è stato isolato l enzima stesso: per es. Bam HI deriva da Bacillus amylofaciens, Eco RI da Escherichia coli, Hind III da Haemophilus influentiae etc. La grande importanza degli enzimi di restrizione risiede nella loro specificità. Ogni particolare enzima di restrizione, infatti, riconosce una sequenza specifica di basi all interno di una catena di DNA. Le sequenze di DNA riconosciute dagli enzimi di restrizione sono spesso palindromiche cioè possono essere lette in un senso e nell altro. La maggior parte degli enzimi più comuni riconoscono da 4 a 6 basi. Il numero di basi riconosciute è di importanza pratica perché determina la frequenza media di taglio.

2 Eco RI G A A TTC C T T A A G G C T T A A A A TTC G E ovvio che un enzima che riconosce una sequenza di 4 basi taglierà più frequentemente di uno che ne riconosce 6 perché nel genoma le combinazioni di 4 basi sono più numerose delle combinazioni di 6 basi. Più in dettaglio, assumendo che la distribuzione delle 4 basi che compongono il DNA sia casuale avremo nel primo caso una frequenza uguale a 4 4 =256 basi, mentre nel secondo caso 4 6 = In altre parole un enzima con una sequenza di riconoscimento di 4 basi, come ad es. Alu I taglierà, in media ogni 256 bp, mentre uno come ad es. Bgl II ogni 4096 bp. In generale la frequenza di taglio è sempre uguale a 4 n, dove n = alla lunghezza del sito di riconoscimento. L'utilizzo degli enzimi di restrizione é semplice. La maggior parte di essi funziona in semplici soluzioni tampone tra ph 7 e 8, generalmente a 37 C (le condizioni di utilizzo di sono comunque sempre specificate dai fornitori). Tutti gli enzimi, in condizioni non ottimali, danno il cossidetto "effetto star", che consiste nella capacità dell'enzima di "confondersi" riconoscendo e tagliando sequenze simili, ma non identiche a quella bersaglio. Per evitare tale effetto é opportuno attenersi alle condizioni specificate dai fornitori, e soprattutto non mettere una quantità di enzima in eccesso. Alcuni enzimi riconoscono sequenze sino a paia di basi che spesso sono siti di riconoscimento degenerati ( per es. BsiEI riconosce la sequenza 5'-CGPuPyCG-3' dove Pu epy rappresentano " qualunque purina" e "qualunque pirimidina"), la maggior parte degli enzimi di restrizione utilizzati in biologia molecolare riconoscono sequenze specifiche che tagliano in tre modi diversi: Generando estremità piatte (blunt) 5'-CCC GGG-3' 3'GGG CCC-5 Es. SmaI Generando estremità coesive (sticky) sporgenti al 5' 5'-G AATTC-3' 3'-CTTAA G-5 Generando estremità coesive (sticky) sporgenti al 3' 5'-CTGCA G-3' 3'-G ACGTC-5' Es. EcoRI Es. PstI

3 Gli enzimi di restrizione sono utili in quanto consentono di distinguere facilmente due sequenze di DNA che differiscono per uno o più nucleotidi, qualora tale differenza sia in grado di modificare il sito bersaglio riconosciuto dall enzima. Esiste una tecnica di laboratorio che sfrutta questa caratteristica per mettere a confronto le varie molecole di DNA. Tale tecnica viene indicata con la sigla RFLP (dall'inglese restriction fragment length polymorphism, polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione). Il DNA da analizzare deve essere prima di tutto amplificato mediante PCR (reazione a catena della polimerasi) e poi sezionato in frammenti di restrizione mediante opportuni enzimi. Questi enzimi, come abbiamo, visto effettuano il taglio esclusivamente in corrispondenza di particolari sequenze nucleotidiche, specifiche per ogni enzima. I frammenti di restrizione vengono quindi separati per lunghezza mediante elettroforesi su gel d'agarosio. La distanza tra i punti di taglio causate dagli enzimi di restrizione varia tra un individuo e l'altro, dando quindi luogo a variazioni nella lunghezza dei frammenti. Ciò comporta una diversa posizione delle bande di DNA sul gel e tale differenza può essere usata per distinguere geneticamente due individui o per dimostrare la presenza di una mutazione o di un polimorfismo. Le mutazioni possono introdurre o eliminare un nuovo sito di restrizione nel segmento di DNA che le contiene: in tal caso basta amplificare tale segmento e sottoporre il prodotto a digestione con l appropriato enzima scelto fra i tanti attualmente disponibili in commercio. L analisi del pattern di restrizione del campione in cui si sospetta la presenza di una mutazione potrà rivelare analogie o differenze rispetto ad un campione positivo per quella mutazione o ad un DNA normale. Naturalmente questo metodo funziona solo quando la mutazione cercata altera la mappa di restrizione del frammento amplificato, il che non sempre accade: ci sono mutazioni che non modificano il pattern di restrizione per nessuno degli enzimi disponibili, oppure il numero di siti per quell enzima presenti nella sequenza è troppo elevato e non vengono generati frammenti di dimensioni sufficientemente grandi, l enzima può presentare un attività scarsa o richiedere temperature di lavoro inconsuete, oppure ancora l enzima è troppo costoso o di difficile reperibilità. Il metodo ha quindi alcune limitazioni e solo in alcuni casi (per fortuna abbastanza frequenti) si rivela utile per la ricerca delle mutazioni. Per ovviare a quei casi in cui la mutazione non altera spontaneamente la mappa di restrizione del segmento di DNA da analizzare, si deve ricorrere ad altri metodi come quelli basati sull amplificazione con primer mutagenico (primer mismatch). Primer mutagenico. In questo caso l amplificazione viene effettuata con um primer costruito in modo tale da contenere un errore di appaiamento all estremità 3, ma che nonostante ciò è tollerato e permette alla reazione di PCR di avvenire e di produrre un amplificato contente una mutazione artificiale. La reazione PCR infatti è abbastanza tollerante rispetto agli appaiamenti non corretti tra primer di PCR e DNA stampo. La PCR è inefficiente quando il DNA stampo non si appaia con l'estremità 3' del primer, ma anche questi primer amplificheranno ugualmente il DNA se le altre condizioni per la PCR saranno ottimali. Questa mutazione, in aggiunta a quella naturale associata all allele patologico determina la formazione di un sito di restrizione che distingue l allele normale da quello mutato. Tuttavia, questa tattica non è raccomandata per i laboratori clinici a causa dei rischi di contaminazione crociata con i prodotti della PCR. Una strategia alternativa è l'amplificazione semi-nested in un solo ciclo della PCR. Due primer esterni non mutagenici vengono aggiunti alla reazione, ma uno è in quantità limitante. Il primer mutagenico ibridizza con il prodotto di PCR a valle del primer limitante. Nei primi cicli di PCR i primer esterni amplificano efficientemente il DNA stampo. Tuttavia il primer limitante viene presto consumato e non può produrre abbastanza prodotto di PCR da essere visualizzato su gel colorati con bromuro di etidio. Nei cicli successivi, la temperatura di appaiamento viene abbassata per permettere al primer mutagenico inefficiente di amplificare il DNA. Grazie al DNA stampo generato nei primi cicli, il primer mutagenico è in grado di produrre materiale in quantità sufficiente per consentire la visualizzazione dopo la digestione con l'enzima di restrizione e l'elettroforesi su gel.

4 L'amplificazione con la PCR è intrinsecamente meno efficiente per i primer mutagenici che per quelli non mutagenici. Questo può non interessare campioni in cui le altre condizioni di PCR sono ideali ma impedirà il buon esito per i campioni in condizioni non ottimali, che a volte si incontrano nella pratica clinica. Un'amplificazione insufficiente può essere superata con la tattica della PCR semi-nested descritta in precedenza, sebbene questa richieda la sintesi di un primer extra. Lo svantaggio più grande della tecnica del primer ingegnerizzato è che non è incluso un controllo positivo per l'efficienza della restrizione. La mancata digestione segnala la presenza di alleli normali, ma questi potrebbero essere prodotti dalla presenza di inibitori dell'endonucleasi di restrizione o dalla mancata aggiunta dell'enzima o del tampone appropriato durante la digestione. Sonde allele-specifiche. Nella strategia con oligonucleotidi allele-specifici (ASO) il DNA viene amplificato, fissato su una superficie solida, messo a contatto con un oligonucleotide marcato allele specifico e i risultati rivelati con un rivelatore enzimatico o radioattivo. I prodotti di PCR a doppio filamento vengono separati in singoli filamenti con un tampone a ph alcalino. Per mezzo di un dot blot o uno slot blot, mediante applicazione di vuoto, i prodotti di PCR provenienti da numerosi pazienti e dai controlli possono essere messi su di un singolo filtro di nitrocellulosa o nylon e legati saldamente al filtro tramite riscaldamento o illuminazione ultravioletta. Alternativamente uno dei primer può essere marcato con biotina, permettendo alla streptoavidina legata al foglio la cattura della catena prodotta con la PCR. Le sonde oligonucleotidiche si ibridano con le regioni complementari dei prodotti della PCR a singolo filamento. L'ibridazione ha tipicamente luogo in condizioni di alta forza ionica e alta concentrazione colloide per velocizzare l'associazione sondabersaglio. Le superfici vengono lavate in condizioni di bassa forza ionica o di temperature più elevate per rimuovere la sonda legata in modo aspecifico. La forza ionica e la temperatura della soluzione di lavaggio possono essere adattate per rimuovere quasi completamente un singolo nucleotide appaiato erroneamente, pur tuttavia permettendo una considerevole ibridazione di un oligonucleotide perfettamente appaiato. Questa differenziazione richiede oligonucleotidi corti (20 nt) ed è facilitata da soluzioni di lavaggio contenenti cloruro di tetrametilammonio per incrementare la differenza nelle temperature di fusione tra sonde perfettamente appaiate e sonde con un singolo appaiamento errato. Qualche volta viene incluso un solvente organico, quale la formamide, per destabilizzare l'appaiamento delle basi fra sonda e prodotto di PCR legato e, quindi, per ridurre la temperatura di lavaggio. Le condizioni ottimali di lavaggio e la temperatura devono essere stabilite empiricamente per ogni sonda ASO. Nella pratica tradizionale, le sonde oligonucleotidiche sono state marcate con fosforo radioattivo e i risultati della ibridazione rivelati con l'esposizione dei filtri lavati a lastre per raggi X. Tuttavia, le sonde possono essere marcate con altri marcatori e possono essere rivelate in piastre di plastica o su altre superfici con dosaggi quali l'elisa. I marcatori comprendono la biotina o altre piccole molecole, apteni, che consentono di legare enzimi per mezzo della streptoavidina, di anticorpi anti-aptene o in altri modi. Dopo l'ulteriore lavaggio, viene aggiunto il substrato enzimatico per produrre un prodotto colorato o luminescente che viene rivelato in uno spettrofotometro, un luminometro o con lastre per raggi X. Ibridazione ASO inversa: Una variante dell'ibridazione ASO è il dot blot inverso. Questa analisi funziona esattamente come l'analisi ASO su descritta, eccetto che per il fatto che i componenti della fase di ibridazione sono invertiti. Gli oligonucleotidi allele-specifici sono legati ad una superficie solida e sono ibridizzati a prodotti di PCR, a singolo filamento, marcati. Amplificazione allele-specifica. Nel metodo noto come Amplification-Refractory Mutation System (ARMS) si utilizzano primer allele-specifici che amplificano solo se complementari alla sequenza bersaglio. Questa strategia ha solo due fasi: l'amplificazione con la PCR e la rivelazione. Le

5 condizioni della reazione PCR e i primers vengono messi a punto in modo tale che viene amplificato con successo solo l'allele desiderato. Come abbiamo visto in precedenza, l'amplificazione con la PCR è inefficiente quando lo stampo non appaia il nucleotide in posizione 3' del primer. Nonostante il primer in 3' non si appai con il DNA stampo, qualche volta c'è un'amplificazione rivelabile. Questo problema viene attenuato in parte prestando particolare attenzione allo stampo e alla concentrazione di Mg++ e all'aggiunta di solventi organici come la formamide per ridurre la forza di appaiamento delle basi. Un mancato appaiamento al penultimo nucleotide del primer o al terzultimo nucleotide riduce un po' l'efficienza della PCR, ma disappaiamenti in tutte e due queste posizioni e a livello del nucleotide in 3' praticamente eliminano l'innesco. I prodotti della reazione della PCR vengono visualizzati in genere mediante un'elettroforesi su gel di agarosio a bassa risoluzione. La marcatura fluorescente dei primer sequenza-specifici permette l'esame di entrambi gli alleli, normale e mutato, in una singola PCR. Questo permette analisi rapide con un analizzatore per fluorescenza. PCR con primer sequenzaspecifici vengono comunemente eseguite in provette di reazione separate e un risultato negativo in una provetta indica l'assenza di un particolare allele. Tuttavia, un risultato negativo in una provetta potrebbe anche esser causato dalla presenza di un inibitore della PCR o dall'omissione nell'aggiunta di un reagente. Perciò, è essenziale preparare PCR multiple, usando entrambe le batterie di primer d'esame e di controllo, in ciascuna provetta di reazione. Il prodotto della PCR di controllo dovrebbe avere un'analoga composizione in basi, ma un peso molecolare più grande del frammento del gene bersaglio. Mutazioni sconosciute. Nel caso si tratti di identificare mutazioni sconosciute si devono utilizzare metodiche meno specifiche, capaci cioè di riconoscere una sequenza mutata qualunque sia la localizzazione della variante all interno del segmento di DNA analizzato. È superfluo osservare che queste metodiche devono possedere una elevata sensibilità, cioè essere in grado possibilmente di scoprire sempre la presenza di mutazioni. La metodica più semplice, rapida, maneggevole ed universalmente utilizzata per l identificazione di sequenze di DNA mutate è ancora l analisi mediante Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP). Essa si basa sul principio che la mobilità elettroforetica di una singola elica di DNA non dipende solo dalle dimensioni della molecola, ma anche dalla conformazione assunta in base alla sua sequenza nucleotidica. Nell analisi SSCP il DNA viene amplificato, denaturato ad alta temperatura in presenza di formammide per ottenere filamenti singoli, quindi, sottoposto ad elettroforesi non denaturante. I singoli filamenti assumono conformazioni uniche in base alla sequenza nucleotidica e migrano con velocità diversa all interno del gel: eventuali variazioni nella migrazione elettroforetica indicano la presenza di varianti nella sequenza in esame. Per la visualizzazione delle bande di DNA a filamento singolo si ricorre molto spesso alla colorazione argentica, molto sensibile. L analisi mediante SSCP consente di identificare l 80% circa delle mutazioni ma il suo potere risolvente diminuisce progressivamente per frammenti di DNA più lunghi di 300 bp. Un campo in cui la Biologia Molecolare si è rivelata di notevole ausilio è quello della diagnosi di Infertilità di coppia mediante la determinazione delle microdelezioni del cromosoma Y (AZF), nei casi di infertilità maschile. Infine, un notevole vantaggio apportato dall'introduzione di tecniche di Biologia Molecolare nel laboratorio di medicina legale, è nel campo delle analisi di accertamento di paternità: i DNA in esame vengono analizzati in PCR per loci specifici ripetitivi altamente polimorfici (microsatelliti). L'analisi degli amplificati viene eseguita con un analizzatore automatico ed uno specifico software matematico permette di attribuire una percentuale statistica di probabilità per l'esclusione o l'attribuzione della paternità.

6 Cenni sull analisi mutazionale mediante HPLC denaturante. L HPLC denaturante è una tecnica relativamente recente, sensibile, rapida e completamente automatizzabile che facilita lo screening di mutazioni e/o polimorfismi del DNA. I campioni sono amplificati normalmente secondo protocolli standard di PCR. L amplificato di un DNA normale (controllo) viene miscelato col campione, riscaldato e lasciato ricombinare con un raffreddamento lento (da 95 a 65 C in 30 minuti). Si formano in tal modo le coppie di omoduplex e di eteroduplex che vengono iniettate dentro una colonna di cromatografia denaturante (DHPLC). Mentre la molecola di omoduplex è intatta, la coppia eteroduplex mostra una parziale denaturazione nel sito di non perfetto appaiamento dovuto alla presenza della mutazione e viene solitamente eluita prima della coppia omoduplex. La separazione avviene ad una temperatura molto stabilizzata. Esistono degli algoritmi computerizzati che calcolano la temperatura alla quale si effettua la separazione. Tale temperatura potrebbe richiedere piccoli aggiustamenti (di un paio di gradi) attorno a quella calcolata per trovare sperimentalmente quella più corretta. Una volta stabilita la temperatura ideale, che è specifica per la sequenza in esame, si procede ad analizzare tutti i campioni alle stesse condizioni. La separazione si ottiene in meno di 5 minuti e il risultato viene registrato dal PC e riportato sotto forma grafica dal cromatogramma; si riconosce la presenza di una mutazione quando il tracciato cromatografico riporta più di una singola banda (picco). Per rivelare le separazioni ottenute in colonna si utilizza uno spettrofotometro munito di microcella a flusso e lettura nell ultravioletto a 260 nm. I vantaggi del DHPLC sono la precisione, la riproducibilità e la rapidità. Naturalmente eventuali errori di amplificazione portano inevitabilmente a scarsi risultati in DHPLC.

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici 1. L Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) di DNA comporta lo studio delle dimensioni dei frammenti di DNA

Dettagli

Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica)

Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica) DNA Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica) Principali tecniche di base Enzimi di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento

Dettagli

Metodi di analisi mutazionale

Metodi di analisi mutazionale Metodi di analisi mutazionale I metodi impiegati per l analisi di mutazioni o polimorfismi nel DNA genomico possono essere suddivise in due principali categorie: (1) metodi per individuare mutazioni note,

Dettagli

ENZIMI DI RESTRIZIONE

ENZIMI DI RESTRIZIONE ENZIMI DI RESTRIZIONE La scoperta degli enzimi di restrizione e modificazione Intorno agli anni 50 si notò che talvolta l introduzione in E.coli di DNA esogeno, proveniente da un diverso ceppo di E.coli,

Dettagli

Polimorfismi LEZIONE 6. By NA 1

Polimorfismi LEZIONE 6. By NA 1 Polimorfismi LEZIONE 6 By NA 1 * Polimorfismo Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Variazioni nell aspetto By NA 2 Polimorfismo proteico Variazione presente nella popolazione

Dettagli

Maria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica

Maria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica Maria Antonietta Lepore Principali tecniche di biologia molecolare clinica Copyright MMIX ARACNE editrice S.r.l. www.aracneeditrice.it info@aracneeditrice.it via Raffaele Garofalo, 133 a/b 00173 Roma (06)

Dettagli

Principali tecniche di base

Principali tecniche di base Principali tecniche di base Enzimi di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione (Southern blotting) PCR (Polymerase Chain Reaction) (Sequenziamento) Tecniche di base Enzimi di di restrizione

Dettagli

Protocollo Crime Scene Investigation

Protocollo Crime Scene Investigation Protocollo Crime Scene Investigation Precauzioni da adottare in laboratorio: - non mangiare o bere - indossare sempre i guanti quando si maneggiano i tubini, i gel, le micropipette - nel dubbio, chiedere!

Dettagli

I marcatori molecolari. Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene

I marcatori molecolari. Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene I marcatori molecolari Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene Marcatori molecolari del DNA I marcatori molecolari sono sequenze di DNA

Dettagli

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 1955 A. Kronembreg e coll. (Stanford University) scoprono la DNA-polimerasi

Dettagli

Analisi molecolare dei geni

Analisi molecolare dei geni Analisi molecolare dei geni Denaturazione e rinaturazione di una molecola di DNA Si rompono i legami idrogeno 100 C Denaturazione del DNA Rinaturazione per riassociazione delle sequenze complementari Ogni

Dettagli

PCR. PCR o reazione di polimerizzazione a catena. Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte

PCR. PCR o reazione di polimerizzazione a catena. Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte PCR Prof.ssa Flavia Frabetti PCR o reazione di polimerizzazione a catena Fine anni 80 Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte Permette di estrarre

Dettagli

I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali. Dott.ssa Chiara Targhetta

I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali. Dott.ssa Chiara Targhetta I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali Dott.ssa Chiara Targhetta LOCUS localizzazione genomica unica all interno di un cromosoma; permette di definire la posizione di un gene

Dettagli

Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno

Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno Editoriale n.10 Newsletter aprile 2013 Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo alla realtà di ogni giorno Identificare la specie, un obiettivo fondamentale quando

Dettagli

PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale. Esercizio. Tipizzazione del gene PV92

PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale. Esercizio. Tipizzazione del gene PV92 PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale Esercizio Tipizzazione del gene PV92 Elementi trasponibili Che cosa sono gli elementi trasponibili? Sono segmenti di DNA che sono in grado di trasferirsi in

Dettagli

SEQUENZIAMENTO DEL DNA

SEQUENZIAMENTO DEL DNA SEQUENZIAMENTO DEL DNA Il metodo di Sanger per determinare la sequenza del DNA Il metodo manuale La reazione enzimatica Elettroforesi in gel denaturante di poliacrilammide Autoradiografia Il metodo automatico

Dettagli

ANALISI DI MUTAZIONI PUNTIFORMI NON NOTE ANALISI DI SEQUENZA.

ANALISI DI MUTAZIONI PUNTIFORMI NON NOTE ANALISI DI SEQUENZA. ANALISI DI MUTAZIONI PUNTIFORMI NON NOTE Margherita Vinciguerra U.O. Ematologia II Laboratorio per lo Studio e la Diagnosi Molecolare Prenatale di Talassemia A.O. V. Cervello, Palermo. Analisi di sequenza

Dettagli

8-06-2010. BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING. BLOTTING delle proteine: NORTHERN BLOTTING SOUTHERN BLOTTING

8-06-2010. BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING. BLOTTING delle proteine: NORTHERN BLOTTING SOUTHERN BLOTTING 8-06-2010 TECNICHE PER L ANALISI DELL ESPRESSIONE GENICA BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR REAL TIME PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING BLOTTING delle proteine: MICROARRAYS MACROARRAYS

Dettagli

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR (Polymerase Chain Reaction) Metodo enzimatico estremamente rapido e semplice per produrre una quantità illimitata di copie della sequenza di un singolo gene Sometime a good idea comes to yow when you

Dettagli

Isolamento e purificazione di DNA e RNA. -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine)

Isolamento e purificazione di DNA e RNA. -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine) Isolamento e purificazione di DNA e RNA -Rompere la membrana cellulare -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine) -Separare gli acidi nucleici tra loro -Rompere la membrana

Dettagli

LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio

LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR Dott. Paolo Cascio Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction) 1) Introdotta da Kary Mullis alla metà degli anni

Dettagli

DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE

DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE Il doppio strand della molecola di DNA può denaturarsi dando due singoli strand ad alte temperature (>90 C). Due strand di DNA complementari possono accoppiarsi dando

Dettagli

ELETTROFORESI SU GEL

ELETTROFORESI SU GEL ELETTROFORESI SU GEL Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA da una miscela complessa E una tecnica fondamentale per: l analisi (elettroforesi analitica) la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi

Dettagli

Metodiche Molecolari

Metodiche Molecolari Metodiche Molecolari La rivelazione degli acidi nucleici virali è un altro saggio che può essere utilizzato sia per verificare la presenza di un virus in un determinato campione biologico, sia per studiare

Dettagli

Diagnosi genetiche molecolari

Diagnosi genetiche molecolari Diagnosi genetiche molecolari INDICAZIONI per la diagnosi genetica Ricorrenza nella famiglia di una malattia genetica - identificazione dei portatori - confermare la diagnosi basata sul quadro clinico

Dettagli

Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni

Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Preparazione dei campioni: (Estrazione del DNA o dell RNA dal tessuto di interesse) Analisi delle mutazioni: SSCP DHPLC Dot blot - Southern - PCR (ARMS

Dettagli

PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO

PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO La collaborazione con il Virgilio e il progetto dell IFOM Il progetto DNA chiavi in mano è un percorso pensato dal Centro di Ricerca internazionale IFOM per avvicinare i ragazzi

Dettagli

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI. ( PCR =Polymerase Chain Reaction)

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI. ( PCR =Polymerase Chain Reaction) REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI ( PCR =Polymerase Chain Reaction) Verso la metà degli anni 80, il biochimico Kary Mullis mise a punto un metodo estremamente rapido e semplice per produrre una quantità

Dettagli

Esperienza 2: gli enzimi di restrizione

Esperienza 2: gli enzimi di restrizione Esperienza 2: gli enzimi di restrizione Gli enzimi di restrizione sono delle proteine sintetizzate dai batteri per proteggersi dalle infezioni virali (batteriofagi). Questi enzimi tagliano il DNA virale

Dettagli

Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3. Criteri di identificazione

Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3. Criteri di identificazione Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3 Criteri di identificazione Tradizionale (fenotipo) Tecniche di biologia molecolare Il livello di risoluzione

Dettagli

immagine Biologia applicata alla ricerca bio-medica Materiale Didattico Docente: Di Bernardo

immagine Biologia applicata alla ricerca bio-medica Materiale Didattico Docente: Di Bernardo Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Biologia applicata alla ricerca bio-medica immagine Docente: Di Bernardo TECNICHE PER L ANALISI

Dettagli

La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino

La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La Polymerase Chain Reaction (PCR) o reazione di amplificazione a catena è una tecnica che permette di amplificare una specifica

Dettagli

METODI DI MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

METODI DI MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI METODI DI MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI Marcatura di acidi nucleici Una sonda per ibridazione è una molecola di DNA marcata, con una sequenza complementare al DNA bersaglio da individuare. Poiché la sonda

Dettagli

PROGETTO DNA chiavi in mano. Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi

PROGETTO DNA chiavi in mano. Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi PROGETTO DNA chiavi in mano Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi PROGETTO DNA chiavi in mano PROGETTO DNA chiavi in mano IFOM PROGETTO DNA

Dettagli

SOLUZIONI AI PROBLEMI DEL CAPITOLO 20

SOLUZIONI AI PROBLEMI DEL CAPITOLO 20 SOLUZIONI AI PROBLEMI DEL CAPITOLO 20 Domande concettuali C1. Si potrebbe concludere che la donna porta una delezione nel gene che è riconosciuto dalla sonda. Per clonare questo gene, potresti iniziare

Dettagli

Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di. DNA umano. 22-26 giugno 2009

Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di. DNA umano. 22-26 giugno 2009 Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di 22-26 giugno 2009 DNA umano 1 GENETICA FORENSE La genetica forense applica tecniche di biologia molecolare al fine

Dettagli

AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) PCR: reazione polimerasica a catena Inventata da Kary Mullis negli anni 80 (premio Nobel 1993) Serve per ottenere una grande quantita

Dettagli

Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di

Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di reazione Inizialmente i 20 µl dell amplificato vengono

Dettagli

di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro

di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro Polymerase Chain Reaction Inventata a metà degli anni 80 da Kary Mullis, è a tutt oggi uno strumento

Dettagli

PCR. (Reazione a catena della polimerasi) ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO. Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani,

PCR. (Reazione a catena della polimerasi) ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO. Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani, PCR (Reazione a catena della polimerasi) & ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani, ESERCITAZIONE DI LAB. N.2 La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica

Dettagli

Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici

Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici In questa lezione darò qualche breve cenno sui metodi di sequenziamento del DNA e specialmente quelli con marcatura fluorescente che attualmente vengono effettuati

Dettagli

Definizione di genoteca (o library) di DNA

Definizione di genoteca (o library) di DNA Definizione di genoteca (o library) di DNA Collezione completa di frammenti di DNA, inseriti singolarmente in un vettore di clonaggio. Possono essere di DNA genomico o di cdna. Libreria genomica: collezione

Dettagli

La possibilita di conoscere i geni deriva dalla capacita di manipolarli:

La possibilita di conoscere i geni deriva dalla capacita di manipolarli: La possibilita di conoscere i geni deriva dalla capacita di manipolarli: -isolare un gene (enzimi di restrizione) -clonaggio (amplificazione) vettori -sequenziamento -funzione Il gene o la sequenza

Dettagli

SAGE: Serial Analysis of Gene Expression

SAGE: Serial Analysis of Gene Expression SAGE: Serial Analysis of Gene Expression L insieme di tutti gli mrna presenti in una cellula si definisce trascrittoma. Ogni trascrittoma ha una composizione complessa, con migliaia di mrna diversi, ciascuno

Dettagli

Replicazione del DNA

Replicazione del DNA Replicazione del DNA la replicazione del DNA viene effettuata da ENZIMI: DNA-polimerasi (catalizza la formazione del legame fosfodiestere) ogni filamento fa da stampo (enzima diretto dallo stampo) le DNA-polimerasi

Dettagli

PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b)

PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a) RT-PCR: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mrna da esso trascritto PCR COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA

Dettagli

Lezione XLI-XLII martedì 17-1-2012

Lezione XLI-XLII martedì 17-1-2012 Lezione XLI-XLII martedì 17-1-2012 corso di genomica aula 8 orario : Martedì ore 14.00-16.00 Giovedì ore 13.00-15.00 Esami 31- gennaio 2012 7- febbraio 2012 28 - febbraio 2012 D. Frezza Esercitazione II

Dettagli

immagine Biologia applicata alla ricerca bio-medica Materiale Didattico Docente: Di Bernardo

immagine Biologia applicata alla ricerca bio-medica Materiale Didattico Docente: Di Bernardo Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Biologia applicata alla ricerca bio-medica immagine Docente: Di Bernardo HUMAN GENOME PROJECT

Dettagli

Lezioni di biotecnologie

Lezioni di biotecnologie Lezioni di biotecnologie 2 Lezione 2 Analisi del DNA e delle proteine 3 Analizzare DNA e proteine Per le applicazioni delle biotecnologie è di fondamentale importanza: 1. essere in grado di identificare

Dettagli

Cenni storici. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica:

Cenni storici. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica: DNA Microarray: griglia di DNA costruita artificialmente, in cui ogni elemento della griglia riconosce una specifica sequenza target di RNA o cdna. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di

Dettagli

SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo

SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo C.R.A. Consiglio per la Ricerca in Agricoltura Centro di ricerca per la genomica Fiorenzuola d Arda (Piacenza) SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo Tutor: Dott. Gianni TACCONI Studente:

Dettagli

Verifiche qualitative dell RNA e cdna in ambito dei trials BCR/ABL e AML translocation programme. Massimo Degan, CRO Aviano (PN)

Verifiche qualitative dell RNA e cdna in ambito dei trials BCR/ABL e AML translocation programme. Massimo Degan, CRO Aviano (PN) e cdna in ambito dei trials BCR/ABL e AML translocation programme Massimo Degan, CRO Aviano (PN) perchè è importante verificare l RNA La verifica della qualità dell RNA nei saggi diagnostico-molecolari

Dettagli

Biotecnologie ed OGM. Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati.

Biotecnologie ed OGM. Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati. Biotecnologie ed OGM Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati. COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE? Si dicono Biotecnologie i metodi tecnici che permettono lo sfruttamento di sistemi

Dettagli

Elettroforesi degli acidi nucleici

Elettroforesi degli acidi nucleici Elettroforesi degli acidi nucleici Una volta che i frammenti del DNA o del RNA da analizzare sono stati amplificati con la reazione PCR è necessario separarli ed identificarli. A tale scopo si utilizza

Dettagli

Tecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici

Tecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici Tecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici Prof.ssa Flavia Frabetti aa. 2010-11 Estrazione acidi nucleici (DNA o RNA) Verifica tramite elettroforesi su gel di agarosio Amplificazione o clonaggio

Dettagli

DNA footprinting. Interazioni DNA-proteine. Il promotore è la regione di DNA al 5 di un gene, dove si lega la RNA polimerasi.

DNA footprinting. Interazioni DNA-proteine. Il promotore è la regione di DNA al 5 di un gene, dove si lega la RNA polimerasi. Interazioni DNA-proteine Il promotore è la regione di DNA al 5 di un gene, dove si lega la RNA polimerasi. L analisi della sequenza dei primi promotori nei batteri non rivelò, come atteso, la stessa sequenza

Dettagli

Esperienza 10: la PCR

Esperienza 10: la PCR Esperienza 10: la PCR La tecnica della polimerizzazione a catena (in inglese polymerase chain reaction) o PCR, permette di amplificare milioni di volte un unico frammento di DNA. Questo metodo è diventato

Dettagli

PROGETTO BIOFORM. Tipizzazione del gene PV92

PROGETTO BIOFORM. Tipizzazione del gene PV92 Ci fu un tempo in cui per amplificare il DNA, dovevi crescere tonnellate e tonnellate di piccole cellule. Poi è arrivato un ragazzo di nome Dr. Kary Mullis, Ha detto che si può amplificare in vitro altrettanto

Dettagli

TEST GENETICI INDIRETTI. per la diagnosi di patologie genetiche ereditarie

TEST GENETICI INDIRETTI. per la diagnosi di patologie genetiche ereditarie TEST GENETICI INDIRETTI per la diagnosi di patologie genetiche ereditarie Diagnosi molecolare indiretta Quando non è nota la mutazione malattia, la diagnosi molecolare di quella malattia in una data famiglia

Dettagli

RELAZIONE TECNICA. Indagini Biologico-Molecolari per Accertamento di Paternità

RELAZIONE TECNICA. Indagini Biologico-Molecolari per Accertamento di Paternità RELAZIONE TECNICA Indagini Biologico-Molecolari per Accertamento di Paternità PROSPETTO RIASSUNTIVO DELL'ANALISI ANALISI INDAGINE DI PATERNITA' PERSONE SOTTOPOSTE AL TEST QUESITO Campione Biologico Tampone

Dettagli

MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI La marcatura degli acidi nucleici è una delle tecniche di base nello studio della Biologia Molecolare, rappresenta infatti una tappa preliminare

Dettagli

PCR Polymerase Chain Reaction = Reazione a catena della polimerasi

PCR Polymerase Chain Reaction = Reazione a catena della polimerasi PR Polymerase hain Reaction = Reazione a catena della polimerasi mplifica un frammento di D di cui si conosce almeno in parte la sequenza Utilizza un enzima, la D Polimerasi, per copiare una molecola di

Dettagli

CAPITOLATO TECNICO PER DIAGNOSTICI PER TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DA DESTINARSI AL LABORATORIO DI GENETICA MOLECOLARE-MEDICINA LEGALE P.O.

CAPITOLATO TECNICO PER DIAGNOSTICI PER TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DA DESTINARSI AL LABORATORIO DI GENETICA MOLECOLARE-MEDICINA LEGALE P.O. ALLEGATO A CAPITOLATO TECNICO PER DIAGNOSTICI PER TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DA DESTINARSI AL LABORATORIO DI GENETICA MOLECOLARE-MEDICINA LEGALE P.O. MONSERRATO Durata della fornitura: 1 anno + 1 rinnovabile

Dettagli

Purificazione degli acidi nucleici

Purificazione degli acidi nucleici A cosa serve? Purificazione degli acidi nucleici DNA genomico: per costruire librerie genomiche e/o usato nell analisi d ibridazione Southern. mrna: sintesi del cdna; analisi d ibridazione Northern, o

Dettagli

Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico

Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Dottoressa Camerin Consuelo Laboratorio Oncoematologia Pediatrica

Dettagli

Elettroforesi. Elettroforesi: processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilita.

Elettroforesi. Elettroforesi: processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilita. Elettroforesi Elettroforesi: processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilita. A qualunque ph diverso dal pi le proteine hanno una carica netta quindi,

Dettagli

Oggetto: presentazione progetto di ricerca anno 2010

Oggetto: presentazione progetto di ricerca anno 2010 Associazione Un Vero Sorriso Onlus via Morghen, 5 10143 Torino Torino, 01/10/2010 Oggetto: presentazione progetto di ricerca anno 2010 Titolo: Nuovi approcci per l identificazione di mutazioni rare in

Dettagli

Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica A.A

Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica A.A Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica A.A. 2006-2007 Metodi di sequenziamento del DNA con particolare attenzione all analisi del DNA mitocondriale e cenni sulla diagnostica delle principali

Dettagli

PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR. PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a)

PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR. PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a) EAZIONE A CATENA DELLA POLIMEASI (PC) PINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PC UPPE primer LOWE primer GENE X 1. Identificazione di agenti patogeni nell uomo, negli animali o negli alimenti (batteri e virus) 2.

Dettagli

La farmacogeneticanella gestione del paziente con tumore colorettale, l esperienza traslazionaleal CRO di Aviano

La farmacogeneticanella gestione del paziente con tumore colorettale, l esperienza traslazionaleal CRO di Aviano SOC di Farmacologia Sperimentale e Clinica VI CONGRESSO NAZIONALE FITeLab Slow Medicine Laboratory: IT s the Future 1-2-3 Ottobre 2015 Ospedale Borgo Roma (Verona) La farmacogeneticanella gestione del

Dettagli

PRODA Istituto di Diagnostica Clinica

PRODA Istituto di Diagnostica Clinica Caratterizzazione molecolare delle Distrofie Muscolari di Duchenne (DMD) e di Becker (BMD): diagnosi di malattia e studi familari L Proda esegue le indagini molecolari per le Distrofie muscolari di Duchenne

Dettagli

Progettazione di primer per PCR. Verifica della specificità

Progettazione di primer per PCR. Verifica della specificità Progettazione di primer per PCR. Verifica della specificità La PCR (Polymerase Chain Reaction) ha progressivamente assunto importanza tra le tecnologie ricombinanti in quanto in diversi protocolli applicativi

Dettagli

Cromatografia Dal greco chroma : colore, graphein : scrivere 1903 Mikhail Twsett (pigmenti vegetali su carta)

Cromatografia Dal greco chroma : colore, graphein : scrivere 1903 Mikhail Twsett (pigmenti vegetali su carta) Cromatografia Dal greco chroma : colore, graphein : scrivere 1903 Mikhail Twsett (pigmenti vegetali su carta) E il termine generico che indica una serie di tecniche di separazione di molecole simili in

Dettagli

I MARCATORI GENETICI APPLICAZIONE AL SETTORE FORESTALE

I MARCATORI GENETICI APPLICAZIONE AL SETTORE FORESTALE I MARCATORI GENETICI APPLICAZIONE AL SETTORE FORESTALE Un marcatore genetico è un qualsiasi fattore ereditario (quindi trasmissibile alla progenie) di cui esistano più varianti genotipiche. Essi consentono

Dettagli

ZytoLight SPEC ERG Dual Color Break Apart Probe

ZytoLight SPEC ERG Dual Color Break Apart Probe ZytoLight SPEC ERG Dual Color Break Apart Probe IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro Produttore: ZytoVision GmbH Codice: Z-2138-200 (0.2ml).. Per l identificazione della traslocazione che coinvolge

Dettagli

NUCLEOTIDI e ACIDI NUCLEICI

NUCLEOTIDI e ACIDI NUCLEICI NUCLEOTIDI e ACIDI NUCLEICI Struttura dei nucleotidi Il gruppo fosfato conferisce carica negativa e proprietà acide FUNZIONI DEI NUCLEOTIDI MOLECOLE DI RISERVA DI ENERGIA L idrolisi dei nucleosidi trifosfato

Dettagli

Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E

Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E possibile scegliere selettivamente cosa amplificare (specificità)

Dettagli

Biotecnologie e bonifica ambientale

Biotecnologie e bonifica ambientale Biotecnologie e bonifica ambientale Prof. Laura Martinis Liceo Scientifico G. Marinelli Prof. Massimo Vischi e Luca Marchiol - Facoltà di Scienze Agrarie dell Università di Udine Cl. III B Noi studenti

Dettagli

Note Tecniche al LightCycler Selezione di sonde di ibridazione per LightCycler. Olfert Landt e Andreas Nitsche, TIB MOLBIOL, Berlino

Note Tecniche al LightCycler Selezione di sonde di ibridazione per LightCycler. Olfert Landt e Andreas Nitsche, TIB MOLBIOL, Berlino Note Tecniche al LightCycler Selezione di sonde di ibridazione per LightCycler Olfert Landt e Andreas Nitsche, TIB MOLBIOL, Berlino 1. Introduzione Scopo di questa nota La detezione di amplicon specifici

Dettagli

Tecniche Diagnostiche molecolari

Tecniche Diagnostiche molecolari Tecniche Diagnostiche molecolari Tecniche di Biologia Molecolare La scoperta che il DNA è alla base di tutte le funzioni della cellula ha aperto la strada allo sviluppo di una disciplina denominata biologia

Dettagli

GRUPPO DI STUDIO TUMORI CUTANEI LINEE GUIDA PER ANALISI GENETICO MOLECOLARI IN PAZIENTI AFFETTI DA MELANOMA METASTICO

GRUPPO DI STUDIO TUMORI CUTANEI LINEE GUIDA PER ANALISI GENETICO MOLECOLARI IN PAZIENTI AFFETTI DA MELANOMA METASTICO GRUPPO DI STUDIO TUMORI CUTANEI LINEE GUIDA PER ANALISI GENETICO MOLECOLARI IN PAZIENTI AFFETTI DA MELANOMA METASTICO Documento redatto da: Dott.ssa T.Venesio, Dr.ssa A. Balsamo - Laboratorio di Patologia

Dettagli

Corso di Laurea in Biotecnologie Anno-Accademico 2009-2010. Percorso nº 3: Clonaggio di segmenti di DNA

Corso di Laurea in Biotecnologie Anno-Accademico 2009-2010. Percorso nº 3: Clonaggio di segmenti di DNA Corso di Laurea in Biotecnologie Anno-Accademico 2009-2010 Percorso nº 3: Clonaggio di segmenti di DNA 11-5-2010 I plasmidi: un mondo da esplorare. Elementi genetici capaci di replicarsi autonomamente

Dettagli

Biologia molecolare clinica. Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica

Biologia molecolare clinica. Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica Biologia molecolare clinica Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica Le tecniche di biologia molecolare negli ultimi anni si sono diffuse nei laboratori di diagnostica clinica dove

Dettagli

Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri).

Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri). Retrotrascrizione l mrna viene convertito in cdna per mezzo dell enzima trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNAdipendenti ricavate dai virus della mieloblastosi aviaria AMV o della leucemia murina di

Dettagli

PROGETTO BIOFORM. Tipizzazione del locus PV92

PROGETTO BIOFORM. Tipizzazione del locus PV92 Ci fu un tempo in cui per amplificare il DNA, dovevi crescere tonnellate e tonnellate di piccole celle. Poi è arrivato un ragazzo di nome Dr. Kary Mullis, Ha detto che si può amplificare in vitro altrettanto

Dettagli

Un nuovo approccio: la VEQ in biologia molecolare

Un nuovo approccio: la VEQ in biologia molecolare Un nuovo approccio: la VEQ in biologia molecolare Il crescente interesse nella biologia molecolare applicata alla diagnostica è il risultato dei profondi progressi ottenuti nelle conoscenze scientifiche

Dettagli

Materiali e Metodi MATERIALI E METODI

Materiali e Metodi MATERIALI E METODI MATERIALI E METODI 62 1. Pazienti con IBS Per eseguire l analisi del polimorfismo 5HTTLPR è stato necessario ottenere campioni di sangue intero o saliva dai quali estrarre il DNA genomico. A tal fine è

Dettagli

Francesca Ceroni. Biotecnologie tradizionali. Biologia Sintetica. F. Ceroni 16/09/2010. Bressanone GNB 2010 1. 1) DNA ricombinante 2) PCR

Francesca Ceroni. Biotecnologie tradizionali. Biologia Sintetica. F. Ceroni 16/09/2010. Bressanone GNB 2010 1. 1) DNA ricombinante 2) PCR XXIX Scuola Annuale di Bioingegneria. Bressanone, 13-17 settembre 2010 Francesca Ceroni Biotecnologie tradizionali 1) DNA ricombinante 2) PCR 3) Sequenziamento automatizzato Biologia Sintetica 4) Approccio

Dettagli

PRESENTAZIONE DEI RISULTATI FINALI DEL PROGETTO. Università degli Studi di Palermo C.I.R.I.T.A.

PRESENTAZIONE DEI RISULTATI FINALI DEL PROGETTO. Università degli Studi di Palermo C.I.R.I.T.A. PROGETTO POR SICILIA 2000/2006 1999.IT.16.1.PO.011/4.17b/8.3.7/0056 Università degli Studi di Palermo C.I.R.I.T.A. PRESENTAZIONE DEI RISULTATI FINALI DEL PROGETTO Studio della struttura genetica e demografica

Dettagli

Le tecniche molecolari nell epidemiologia infettiva e nella sorveglianza delle Hospital Acquired Infections (HAI)

Le tecniche molecolari nell epidemiologia infettiva e nella sorveglianza delle Hospital Acquired Infections (HAI) Le tecniche molecolari nell epidemiologia infettiva e nella sorveglianza delle Hospital Acquired Infections (HAI) Dott.ssa G. Scalet Sezione Microbiologia-Dipartimento Di Patologia e Diagnostica Università

Dettagli

PURIFICAZIONE DI DNA

PURIFICAZIONE DI DNA PURIFICAZIONE DI DNA Esistono diverse metodiche per la purificazione di DNA da cellule microbiche, più o meno complesse secondo il grado di purezza e d integrità che si desidera ottenere. In tutti i casi

Dettagli

Progetto della classe II C

Progetto della classe II C Progetto della classe II C Preparazione allo svolgimento dell esperienza La II C è preparata all esperienza presso il centro di ricerca E.B.R.I. iniziando un intenso lavoro di approfondimento sulla genetica

Dettagli

Modulo di GENETICA APPLICATA. Esame integrato di METODOLOGIE BIOTECNOLOGICHE CORSO DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE. Docente: FLAVIA CERRATO

Modulo di GENETICA APPLICATA. Esame integrato di METODOLOGIE BIOTECNOLOGICHE CORSO DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE. Docente: FLAVIA CERRATO Modulo di GENETICA APPLICATA Esame integrato di METODOLOGIE BIOTECNOLOGICHE CORSO DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE Docente: FLAVIA CERRATO a. a. 2008-2009 2009 PROGRAMMA 1. Tecniche di base. Taglio e saldatura

Dettagli

U.O.C. di Epatologia Clinica e Biomolecolare. Unità di misura. Repertorio. 200 ml 10.000 U. 500 test

U.O.C. di Epatologia Clinica e Biomolecolare. Unità di misura. Repertorio. 200 ml 10.000 U. 500 test U.O.C. di Epatologia Clinica e Biomolecolare Lotto N. DESCRIZIONE PRODOTTO Quantità annua richiesta Unità di misura Repertorio CND Codice Prodotto, Confezione Offerta e nome commerciale Prezzo unitario

Dettagli

Caratterizzazione della comunità microbica

Caratterizzazione della comunità microbica Caratterizzazione della comunità microbica Monitoraggio biologico annuale dell impianto Dipartimento di Biologia Università di Pisa Monitoraggio biologico del reattore Monitoraggio biologico del prototipo

Dettagli

III giorno: Da questo punto in poi, per entrambe le tipologie di campioni, si segue un protocollo comune:

III giorno: Da questo punto in poi, per entrambe le tipologie di campioni, si segue un protocollo comune: III giorno: 1) Estrazione del DNA genomico da campioni SECCHI e da coltura liquida 2) Preparazione del gel di agarosio 3) Corsa del DNA genomico in gel di agarosio e sua visualizzazione 4) PCR del DNA

Dettagli

Biotecnologie ed OGM : come vengono trasferiti i geni?

Biotecnologie ed OGM : come vengono trasferiti i geni? Biotecnologie ed OGM : come vengono trasferiti i geni? a cura di Leonardo Magneschi Scuola Estiva di Orientamento Volterra 2007 Venerdì 29 giugno 2007 1 Introduzione all Ingegneria Genetica L ingeneria

Dettagli

Soluzioni e tamponi utilizzati per la PCR, senza DNA

Soluzioni e tamponi utilizzati per la PCR, senza DNA Materiali biologici In questo file sono elencati, capitolo per capitolo, i materiali biologici da richiedere al CusMiBio (o centro simile) per realizzare gli esperimenti che abbiamo illustrato (www.cusmibio.unimi.it).

Dettagli

Sequenziamento ed analisi dell esoma intero (All Exon)

Sequenziamento ed analisi dell esoma intero (All Exon) Sequenziamento ed analisi dell esoma intero (All Exon) Obiettivi La procedura ha l obiettivo di sequenziare solo le regioni trascritte e codificanti del genoma che rappresentano, almeno nell uomo, circa

Dettagli

Ingegneria Genetica e Microbiologia Applicata

Ingegneria Genetica e Microbiologia Applicata Corso di Laurea in Biotecnologie Anno Accademico 2009-2010 Ingegneria Genetica e Microbiologia Applicata Percorso n 3: Clonaggio di segmenti di DNA Settima esercitazione - 13 maggio 2010 F 1 1 1: taglio

Dettagli