Metodiche Molecolari

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1 Metodiche Molecolari La rivelazione degli acidi nucleici virali è un altro saggio che può essere utilizzato sia per verificare la presenza di un virus in un determinato campione biologico, sia per studiare in maniera dettagliata le fasi del ciclo di replicazione.

2 Ricerca diretta degli acidi nucleici virali E possibile eseguire tale rivelazione se si seguono le seguenti condizioni: 1) l acido nucleico virale deve poter essere estratto dai campioni biologici su cui si vuol eseguire il saggio (colture cellulari, biopsie, siero, ecc.) 2) deve essere disponibile una sonda di acido nucleico per l identificazione del virus.

3 IBRIDAZIONE I Saggio che prevede di trattare il materiale estratto dal campione con una sonda oligonucleotidica con una sequenza complementare alla regione virale specifica che si vuole identificare. La sonda è sempre marcata o con un isotopo radioattivo, o con un marcatore enzimatico, fluorescente o chemioluminescente.

4 Tecniche di ibridazione

5 IBRIDAZIONE II Northern blot analisi effettuata su RNA (genomico o RNAm). Southern blot analisi effettuata su DNA. In entrambi i casi il saggio prevede estrazione, purificazione e denaturazione del DNA o RNA e una corsa elettroforetica che comporta la separazione degli acidi nucleici virali in base alla loro lunghezza, seguita da un trasferimento su filtri idonei a far avvenire la successiva fase di ibridazione.

6 Southern blot

7 Saggi di amplificazione degli acidi nucleici Reazione di amplificazione a catena (PCR) permette di amplificare (DNA-polimerasi) un determinato frammento di acido nucleico. Cicli ripetuti di denaturazione, ibridazione e polimerizzazione fanno sì che la sequenza virale, se presente, venga amplificata in maniera esponenziale. Trattando il materiale estratto con trascrittasi inversa per trascrivere l RNA in DNA, la PCR può essere usata anche con virus a RNA (RT-PCR).

8 Schematic of PCR Each cycle doubles the copy number of the target

9 PCR: Amplificazione DNA Primers dntps DNA polimerasi DNA

10 PCR E realizzata ripetendo più cicli di amplificazione (20-40 cicli) -Denaturazione : Separazione delle due eliche di DNA (95 C), 30 sec. da amplificare -Ibridazione: (55 60 C), 30 sec. -Estensione: (72 C), tempo variabile a seconda della grandezza dell amplificato. I primers si ibridano con le sequenze complementari del DNA target Sintesi dei due nuovi filamenti di DNA complementari alla sequenza bersaglio mediante la DNA polimerasi

11 PCR: Analisi del prodotto di amplificazione 1) Gel di agarosio al 2%. 2) Elettroforesi: 100~150 volt. 3) Analizzare su un transilluminatore UV la banda del prodotto di amplificazione

12 PCR: Analisi del prodotto di amplificazione M C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 200 bp

13 Informazioni importanti!!! L'uso della PCR nella routine richiede una cura particolare nell'evitare contaminazioni da amplificati di DNA, attraverso l'adozione di pratiche laboratoristiche rigorose. L approccio migliore all uso della PCR nella routine è quello di adottare pratiche di laboratorio adeguate: separazione rigorosa dei reagenti pre e post amplificazione; linee guida specifiche per il campione manipolato; il personale laboratoristico dovrebbe essere costantemente cosciente delle fonti di contaminazione possibili: - carryover da campione a campione - contaminazione inavvertita dei campioni durante l aliquotazione e la distribuzione - presenza di sequenze bersaglio clonate nei laboratori che hanno isolato e caratterizzato le stesse sequenze che ricercano. L approccio migliore in assoluto è quello di includere reazioni di controllo negative per ognuno dei passaggi principali nel trattamento dei campioni.

14 PCR: Limiti PCR - Falsi positivi - Analisi qualitativa Nuove prospettive PCR real-time - Analisi quantitativa Una PCR quantitativa permette di determinare in un campione la quantità di DNA presente per unità di volume.

15 PCR real-time Utilizza un sistema che permette l amplificazione e la quantificazione ON-LINE con rilevazione in fluorescenza dei prodotti di PCR L amplificazione e la rilevazione fluorescente avvengono all interno dello stesso capillare (in vetro borosilicato) eliminando il problema della contaminazione

16 PCR real-time DNA polimerasi dntps Primers Sonde fluorescenti DNA

17 PCR real-time E in grado di analizzare diversi tipi di fluorescenza emessa da: FLUOROFORI INTERCALANTI IL DNA (SYBR GREEN) SONDE DI IBRIDAZIONE (FRET) SONDE DI IDROLISI (TAQMAN) Rapidità di esecuzione : 20 per 30 cicli

18 PCR real-time: Analisi quantitativa Monitorare real timeon line l andamento della reazione di amplificazione

19 PCR real-time time: : Vantaggi Semplicità di automazione Flessibilità Rapidità di esecuzione Elevate sensibilità e specificità Elevata riproducibilità

20 Analisi quantitativa

21 NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification). Utilizzando 3 enzimi (RNA polimerasi T7, RT, RNASi H) e 2 primer specifici si consente l amplificazione sia di RNA sia di DNA in maniera esponenziale. Si basa sullo schema di trasferimento dell informazione genica caratteristico del meccanismo di replicazione dei genomi dei retrovirus: da RNA a DNA e, di nuovo, RNA. Si usa contemporaneamente la miscela di enzimi che funzioneranno a temperatura costante per ottenere la replicazione dell acido nucleico.

22 Due oligo, uno (A) funziona come molecola ibrida con due distinti domini e funzioni: la prima è complementare alla sequenza target, mentre la seconda contiene un promotore per una RNA polimerasi. I enzima RT che sintetizza DNA a partire dall RNA. Ibrido RNA_DNA. II enzima RNAsi-H degrada RNA e quindi il secondo oligo (B) si lega al DNA ed inizia la sintesi del cdna. III enzima T7 RNA polimerasi (DNA dipendente) trascrive il doppio filamento di DNA partendo dal promotore presente sul primo ibrido primer. Il prodotto della reazione NASBA è un RNA a singolo filamento, che rappresenta volte la sequenza bersaglio, sembra fornire maggiori garanzie di specificità.

23 branched DNA Utilizzando speciali sonde chemioluminescenti ibridazione sensibile che amplifica il segnale di rivelazione in maniera lineare. Questa tecnica offre la possibilità di quantificare gli acidi nucleici virali riducendo i rischi di contaminazioni. Vengono utilizzati per studiare pazienti in corso di infezione da HIV, HBV, HCV.

24 Amplificazione del segnale: branched DNA Metodo quantitativo che utilizza speciali sonde chemioluminescenti che si legano specificatamente alla sequenza di acido nucleico da identificare, creando una struttura ramificata branched DNA (bdna). Il segnale ottenuto alla fine della reazione è proporzionale alla quantità di bersaglio presente nel campione. Quantifica sia DNA che RNA: l acido nucleico legato ad un set di sonde specifiche (ibridazione) sul pozzetto di una micropiastra; un altro set di sonde, con una sequenza complementare ad un altra porzione del target, viene utilizzato per la rivelazione. A queste sonde vengono successivamente legate le molecole di DNA ramificate, che amplificano il segnale generato da ciascuna molecola target. L aggiunta di sonde marcate con fosfatasi alcalina, complementari a tre diversi siti di legame su ciascun ramo della molecola, e di un substrato chemiluminescente genera emissione di luce.

25 I step) LISI VIRALE E CATTURA DEL TARGET Lisi virale RNA o DNA target Rilascio genoma Capture Probes e Target Probes con sequenze complementari al target Capture Probes e Target Probes si ibridano al target e Target RNA or DNA Target Probes * si legano al fondo del micropozzetto ricoperto. Capture Probes Solid Phase Capture Probes Microwell * components containing Iso-C/Iso-G

26 II) PREAMPLIFICAZIONE Ogni Preamplifier si ibrida a 2 Target Probes Preamplifiers* Target RNA or DNA Target Probes * Capture Probes Solid Phase Capture Probes Microwell * components containing Iso-C/Iso-G

27 III) AMPLIFICAZIONE Amplifiers* L Amplifier si lega al Preamplifier Preamplifiers* Target RNA or DNA Target Probes* Capture Probes Solid Phase Capture Probes Microwell * components containing Iso-C/Iso-G

28 IV) IBRIDAZIONE DELLA SONDA MARCATA Amplifiers * with hybridized Label Probes* Sonde marcate con Fosfatasi Alcalina si legano agli Amplifier Target RNA or DNA Preamplifiers * Target Probes * Capture Probes Solid Phase Capture Probes Microwell * components containing Iso-C/Iso-G

29 V) GENERAZIONE DEL SEGNALE Amplifiers * with hybridized Label Probes* La luce ottenuta dall idrolisi del diossietano condotta dalla F.A. è proporzionale alla concentrazione iniziale del target Target RNA or DNA Preamplifiers * Target Probes * Capture Probes Solid Phase Capture Probes Microwell * components containing Iso-C/Iso-G

30 Applicazioni delle tecniche di amplificazione degli acidi nucleici

31 Sequenziamento Il sequenziamento dei prodotti amplificati può fornire una valida informazione sia sull identità di un virus il cui acido nucleico è stato amplificato sia sulla presenza di mutanti virali associati a resistenza ai farmaci antivirali. La sua principale applicazione nella diagnostica virale è il rilevamento del sottotipo virale (HBV, HCV, HPV, HIV) e della resistenza ai farmaci anti-hiv da campioni di plasma da pazienti trattati in fallimento terapeutico.

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