PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale. Esercizio. Tipizzazione del gene PV92

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1 PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale Esercizio Tipizzazione del gene PV92

2 Elementi trasponibili

3 Che cosa sono gli elementi trasponibili? Sono segmenti di DNA che sono in grado di trasferirsi in altre posizioni del genoma Replicate Element Generalmente, sono considerati come DNA egoista ; normalmente non beneficiano ne danneggiano i loro ospiti Scoperti da Barbara McClintock (1940s-50s) mentre lavorava con mais Donor molecule Recipient molecule

4 Elementi Alu Elementi Alu sono un tipo di elementi trasponibili. Gli elementi Alu sono lunghi 300bp. Si trovano solo nei primati (umani inclusi) Approssimativamente 500,000 copie Alu per genoma aploide, rappresentando circa il 5%del genoma aploide! Il nome deriva dal sito di restrizione Alu I che è presente nell elemento.

5 Alu nel PV92 PV92 è localizzato sul cromosoma 16 L inserimento di un Alu avvenne come evento mutazionale in un soggetto (fondatore) migliaia di anni fa Possibili genotipi del PV92 : +/+ +/- -/- Usati in genetica delle popolazioni,analisi di paternità, e medicina forense. Nessuna associazione con fenotipi.

6 Programma sperimentale Cromosoma 16 PV92 Alu Alu PV92

7 1) Estrazione del DNA... Prelievo di cellule dalla cavità orale facendo un lavaggio energico con soluzione fisiologica

8 1) Estrazione del DNA... Il liquido raccolto nel bicchiere viene mescolato 1 ml viene trasferito in una provetta. e

9 1) Estrazione del DNA... I campioni vengono centrifugati. Sul fondo della provetta si deposita il pellet di cellule. Il sovranatante viene aspirato e buttato lasciando una piccola quantità di soluzione che servirà per risospendere le cellule.

10 1) Estrazione del DNA Una aliquota di sospensione cellulare viene utilizzata per l estrazione del DNA. Tale aliquota viene infatti mescolata vigorosamente con una soluzione chiamata CHELEX. La miscela viene fatta bollire per 10 minuti e successivamente centrifugata. Sul fondo della provetta si depositeranno le proteine mentre l acido nucleico rimarrà nel sovranatante che deve essere quindi recuperato e trasferito in un tubo pulito, pronto per la PCR.

11 2) Amplificazione del DNA tramite PCR... Si allestisce una reazione di PCR utilizzando dei tubi di PCR Ready-To-Go Beads che contengono i reagenti necessari per la reazione (sali minerali con funzione tamponante, desossinucleotidi trifosfati, cloruro di magnesio e la Taq polymerase liofilizzata). A tale tubo bisogna aggiungere l acqua, gli oligonucleotidi specifici per la regione pv92 Alu, il colorante di caricamento ed un aliquota di DNA estratto.

12 2) Amplificazione del DNA tramite PCR... I tubi vengono messi in un thermocycler e si eseguono 30 cicli alle seguenti condizioni: * Denaturazione del DNA: 94 C per 30 secondi * Appaiamento: 68 C per 30 secondi * Estensione: 72 C per 30 secondi

13 3) Elettroforesi del prodotto di amplificazione Si prepara un gel di agarosio al 2% in TBE 1x. Il prodotto di PCR viene caricato nel pozzetto del gel.

14 3) Elettroforesi del prodotto di amplificazione Dopo aver caricato i campioni di PCR, si applica un voltaggio di 120 V per 30 minuti. Sotto l azione di un campo elettrico il DNA viene separato sulla base del peso molecolare e migrerà dal polo negativo a quello positivo.

15 3) Ripresa delle immagini Poichè il gel contiene una piccola quantità di etidio bromuro, alla fine della corsa elettroforetica è possibile visualizzare il DNA quando il gel viene illuminato con luce ultravioletta.

16 3) Valutazione dei risultati PV92 Senza Alu 415 bp Regione da amplificare PV92 Con Alu 300bp 715bp Regione da amplificare

17 3) Valutazione dei risultati 1. Una sola banda visibile di 715 bp: l inserto pv92 Alu è presente su entrambi gli alleli, omozigote per l inserzione PV92 Alu (+/+). 2. Una sola banda visibile di 415 bp: pv92 Alu è assente su entrabi gli alleli, omozigote per l assenza dell inserzione PV92 Alu (-/-). 3. Due bande visibili di cui una di 715 bp e l altra di 550 bp: pv92 Alu è presente solo su un allele, eterozigote per l inserzione PV92 Alu (+/-). +/+ -/- +/- 715 nt 415 nt

18 Esempio di un risultato M

19 I RISULTATI DI BIOFORM 2009 SONO SUL SITO:

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