Divisione di Gastroenterologia - Casa Sollievo della Sofferenza- IRCCS San Giovanni Rotondo

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1 EPATITE B: DIAGNOSI. Il Laboratorio GA Niro, A Andriulli Divisione di Gastroenterologia - Casa Sollievo della Sofferenza- IRCCS San Giovanni Rotondo La descrizione del meccanismo replicativo del virus dell epatite B (HBV), nel 1980, e l introduzione del metodo PCR (polymerase chain reaction), nel 1990, hanno rappresentato tappe conoscitive essenziali nel campo virologico. Sono state messe a punto metodiche di diagnostica molecolare utili alla comprensione della malattia HBV correlata ed al monitoraggio della risposta terapeutica. 1) Tests sierologici: marcatori di infezione e risposta immunitaria dell ospite. L HBV non è direttamente citopatico; il danno epatico deriva dalla reazione del sistema immunitario dell ospite responsabile della necrosi delle cellule infette. Per l inquadramento sierologico dell infezione si ricercano i prodotti virali (gli antigeni, che riflettono la complessità strutturale del virus, o l acido nucleico) e gli anticorpi (prodotti dalla risposta immune del soggetto infettato). Si distinguono: marcatori di infezione (HBsAg, anti-hbc, anti-hbe), di replica virale (HBV-DNA, HBeAg), di danno virus-indotto (IgM anti-hbc), di immunità (anti-hbs) (1). HBsAg ed Anti-HBs L HBsAg resta il marcatore di infezione per eccellenza. E determinabile da 1 a 10 settimane dall infezione acuta e prima dell insorgenza dei sintomi o dell incremento delle transaminasi. Nei pazienti che guariscono l HBsAg diventa negativo dopo 4-6 mesi. La persistenza oltre 6 mesi indica la progressione della malattia nella forma cronica. L anticorpo verso l HBsAg ( anti-hbs) appare in concomitanza con la scomparsa dell HBsAg e frequentemente persiste, conferendo immunità duratura (2).

2 HBcAg ad Anti-HBc L antigene core ( HBcAg) non è determinabile nel siero. L anticorpo (anti-hbc) appare precocemente e persiste durante l infezione. In corso di infezione acuta è una immunoglobulina della classe IgM. In soggetti che guariscono l anti-hbc è della classe IgG ed è associato all anti-hbs. E inoltre presente in pazienti con epatite cronica attiva, in associazione all HBsAg. E' riconosciuto il ruolo delle IgM anti-hbc nell' epatite cronica anti-hbe positiva: questa è caratterizzata da importanti fluttuazioni della viremia (range di genomi/ml). I livelli sierici di HBV-DNA possono risultare non determinabili (con metodi di ibridazione), pur in presenza di alterati indici di citolisi; le IgM anti-hbc, dosate con metodica quantitativa ad elevata sensibilità, sono un marcatore diagnostico di epatite B, in grado di identificare i portatori di HBsAg con danno epatico (1). HBeAg ad Anti-HBe L HBeAg è un marcatore di replica virale e di infettività. E associato ad alti titoli di HBV-DNA nel siero, malattia epatica attiva ed alto grado di infettività. Pazienti con infezione perinatale possono tuttavia essere HBeAg positivi ed avere basso grado di flogosi epatica e normali livelli di ALT. La sieroconversione da HBeAg ad anti-hbe e la negatività dell HBV-DNA sierico indicano generalmente guarigione. La maggior parte dei pazienti, nella nostra area geografica, presenta la mutazione nella regione precore del genoma virale, che impedisce l espressione dell HBeAg; in questi soggetti si riscontra malattia epatica attiva, HBV-DNA positivo nel siero ed HBeAg negativo. HBV-DNA sierico L HBV-DNA nel siero è un indicatore sensibile e specifico di replica virale. Con i metodi di ibridazione ed amplificazione del segnale (branched DNA) è possibile determinare genomi/ml, mentre la PCR individua equivalenti virali/ml. La guarigione dall infezione acuta e la sieroconversione da HBeAg ad anti-hbe, in corso di infezione

3 cronica, si associano ad assente viremia, valutata con metodi diversi dalla PCR. Le Tabelle seguenti riportano diversi profili di marcatori dell HBV ed il loro significato (3). Test sierico HBsAg Anti-HBs Anti-HBc HBeAg Anti-HBe HBV-DNA INFEZIONE ACUTA Fase Precoce + - IgM Fase finestra - - IgM Guarigione - + IgG Test sierico HBsAg Anti-HBs Anti-HBc HBeAg Anti-HBe HBV-DNA INFEZIONE CRONICA Attiva Replica + - IgG Bassa Replica + - IgG Mutante Precore + - IgG/IgM Vaccinazione ) Determinazione dell HBV-DNA. L HBV ha un elevato potere replicativo e può raggiungere nel sangue titoli superiori a 10 9 virioni per ml. Per tale ragione il valore dell HBV- DNA è misurato in scala logaritmica e la risposta terapeutica espressa come riduzione logaritmica della viremia. Come in precedenza riportato, esistono diverse metodiche di determinazione dell HBV-DNA, essenzialmente basate su metodi di ibridazione in fase liquida (Abbott), metodi di ibridazione in fase solida (Digene II) e con amplificazione del segnale (Bayer), metodica PCR. La tabella 2 riporta la sensibilità delle diverse tecniche (4).

4 Sensibilità Copie/ml Branched DNA (Bayer) 7 x 10 5 Ibridazione liquida (Abbott) 4.5 x 10 5 Ibridazione (Digene II) 5 x 10 3 PCR-Amplicor (Roche) 4 x 10 2 Il metodo più appropriato per la valutazione iniziale del paziente con epatite cronica non è definito. In occasione della conferenza NIH (4) un valore di 10 5 copie/ml è stato arbitrariamente scelto come criterio diagnostico per l epatite cronica B. Permangono problemi non risolti in particolare per la standardizzazione dei metodi, la variabilità della viremia, e l incertezza sul livello di HBV-DNA associato a progressione di malattia epatica. Resta da interpretare, sul piano clinico, il significato di bassi livelli viremici quali 10 2 copie/ml. 3) Dalla PCR ai Genotipi e Mutanti dell HBV. Un importante vantaggio della PCR è la produzione di frammenti di DNA, che possono essere direttamente sequenziati dopo o durante l amplificazione. La riproduzione della sequenza nucleotidica permette di individuare anche mutazioni puntiformi del genoma virale. Nei primi studi le mutazioni sono state identificate in specifiche regioni dell HBV, specialmente del precore e core; al momento attuale sono note mutazioni anche dell antigene di superficie e della regione polimerasica. L HBV presenta una percentuale di mutazioni 10 volte superiore a quello di altri virus a DNA, stimato intorno ad 1 nucleotide / basi /anno di infezione. L introduzione in campo terapeutico di analoghi nucleosidici (famciclovir, lamivudina), ha esercitato una ulteriore pressione selettiva sulla popolazione virale, con sviluppo di varianti nella regione polimerasica (YMDD) (5). Sono stati introdotti tests diagnostici per

5 l identificazione dei genotipi virali (si distinguono 6 genotipi dell HBV, A F) e la determinazione di mutanti dell HBV, entrambi di crescente interesse nella pratica clinica. La metodica Inno-Lipa HBV DR dimostra virus emergenti, resistenti al trattamento, più precocemente rispetto alla sequenza diretta, ed individua i coesistenti virus wild-type e mutante. Le informazione derivanti da questa analisi possono orientare nelle scelte terapeutiche, prevenendo i flares epatitici da mutanti YMDD. Bibliografia 1) Brunetto MR, Bellati G, Colloredo-Mels G. Impiego delle IgM anti-hbc nelle infezioni croniche da virus dell epatite B. Ed. Minerva Medica, Torino ) Vivek Raj. Treatment of Hepatitis B. Clinical Cornerstone Excerpta Medica, Inc. 2001; 3: ) Chan HLY, Lok ASF. Hepatitis B in adults: a clinical perspective. Clin Liver Dis. 1999; 3: ) Lok ASF, McMahon BJ. Chronic Hepatitis B. Hepatology 2001; 34: ) Hunt CM, McGill JM, Allen MI, Condreay LD. Clinical relevance of Hepatitis B Viral Mutations. Hepatology 2000; 31:

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