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1 I n t r o d u z i o n e a l l e t e c n i c h e d i bi o l o g i a m o l e c o l a r e e l o r o a p p l i c a z i o n i ne l L a b o r a t o r i o C l i n i c o Corso di aggiornamento Milano - Sabato 16 Ottobre 2004 Premessa La biologia molecolare e le tecniche ad essa connesse sono materia altamente specialistica in continua evoluzione ed avranno un sempre maggiore impatto nell'attività di diagnostica di laboratorio. La diagnosi molecolare trova già oggi estesa applicazione in Microbiologia (ricerca qualitativa e/o quantitativa di acidi nucleici virali) e sull uomo; la conclusione del sequenziamento del genoma umano consentirà di migliorare la conoscenza dei meccanismi molecolari alla base di numerose malattie. Obiettivi Fornire nozioni di base, teoriche e pratiche, sulla struttura degli acidi nucleici, sulle modalità di replicazione, sulle metodiche biomolecolari utilizzate ai fini diagnostici nei laboratori biomedici (fase di estrazione, tecniche di amplificazione e di rilevazione, aspetti organizzativi). Destinatari Il corso si rivolge a Medici, Biologi e Tecnici Sanitari di Laboratorio Biomedico. Verranno accettate fino ad un massimo di 200 iscrizioni. Responsabile Scientifico del programma formativo Prof. Giuseppe Banfi Membro del Consiglio Direttivo e Coordinatore del Comitato Scientifico di Italbioforma Direttore Sanitario dell Istituto Ortopedico Galeazzi di Milano Partnership L evento è organizzato in collaborazione con l Ordine Nazionale dei Biologi _ I T A L B I O F O R M A - S. S. d el S e m p i o n e, S. L or e n z o d i P a r a b i a g o ( M I ) I t a l y C. F P. I T el F a x E - m a i l i n f i t a l b i of or m a. or g w w w. i t a l b i of or m a. or g O r g a n i z z a z i o n e C e r t i f i c at a U N I E N I S O : C er t. n

2 Programma H 8.45: Registrazione dei partecipanti H 9.15: Presentazione del corso Giuseppe Banfi, Italbioforma H 9.30: Strutture degli acidi nucleici, codice genetico e replicazione del DNA Paolo Amboni, AO Ospedali Riuniti di Bergamo H 10.30: break H 10.45: Estrazione e conservazione di DNA e RNA da diversi materiali Francesco Broccolo, Università Bicocca Milano H 11.30: Ibridazione degli acidi nucleici: teoria e applicazioni Francesca Dulcetti, Lab. Analisi Biomediche TOMA, Busto Arsizio (VA) H 12.15: Amplificazione genica: l origine della Polymerase Chain Reaction (PCR) e descrizione della metodica Annapaola Callegaro, AO Ospedali Riuniti di Bergamo H 13.00: Confronto/dibattito tra pubblico ed esperti Conduttore: A. Clivio H 13.15: pausa H 14.15: Descrizione ed applicazioni di tecniche di amplificazione diverse dalla PCR Anna Maria Ruggeri, Lab. Analisi Biomediche TOMA, Busto Arsizio (VA) H 15.00: Tecniche per la rilevazione dei prodotti di PCR: dai metodi colorimetrici alla PCR Real Time Annapaola Callegaro, AO Ospedali Riuniti di Bergamo H 16.00: Applicazioni della tecnologia dei microarrays nella ricerca di base ed applicata. Alberto Clivio, Dip. di Scienze Pre-cliniche, Università di Milano H 17.00: L organizzazione del Laboratorio di Biologia Molecolare Francesco Broccolo, Università Bicocca Milano H 17.30: Proteomica Alberto Clivio, Dip. di Scienze Pre-cliniche, Università di Milano H 18.00: Confronto/dibattito tra pubblico ed esperti Conduttore: A. Clivio H 18.15: Somministrazione del questionario di verifica dell apprendimento e della Scheda di valutazione dell'evento formativo Sede A T T E N Z I O N E! I l c o r s o n o n a v r à p i ù l u o g o p r e s s o l a S a l a T e a t r o S a l e s d e l l I s t i t u t o S a l e s i a n o S. A m b r o g i o i n V i a C o p e r n i c o 9 a M i l a n o b e n s ì p r e s s o l a S a l a T e a t r o d e l l I s t i t u t o M a r i a S S. C o n s o l a t r i c e i n g r e s s o d i v i a G a l v a n i 2 6 s e m p r e a M i l a n o. 2

3 Segreteria Organizzativa: Italbioforma S.S. del Sempione, S. Lorenzo di Parabiago (MI) TEL FAX Referente: dott.ssa Raffaella Gnocchi ASSISTENTE DI DIREZIONE ITALBIOFORMA Mobile e.mail: Quota di iscrizione - 50,00 + IVA 20% = 60,00 per le iscrizione effettuate entro il termine del 15 settembre ,00 + IVA 20% = 72,00 per le iscrizioni che venissero effettuate dal 16 settembre al 11 ottobre 2004 La quota è comprensiva di iscrizione e materiale didattico. Informiamo che se, a pagamento effettuato, si dovesse rinunciare all iscrizione sarà possibile ottenere un rimborso del 50% della quota versata solo qualora la disdetta venga inoltrata alla Segreteria Organizzativa entro il 9 ottobre 2004: oltre tale data non è previsto alcun rimborso così come non è previsto per le quote di iscrizione non usufruite per le quali non sarà giunta la rispettiva rinuncia entro il termine di cui sopra. E tuttavia possibile, in qualsiasi momento, provvedere alla sostituzione del nominativo dell'iscritto; le sostituzioni dovranno essere tempestivamente comunicate alla Segreteria Organizzativa. Modalità di partecipazione Le iscrizioni al corso saranno aperte dal 20 luglio 2004 e potranno essere effettuate con il pagamento della relativa quota (tramite Carta di Credito o Bonifico Bancario) direttamente sul sito fino ad esaurimento dei posti disponibili. Il numero dei posti è limitato. Le iscrizioni verranno accettate secondo l ordine di registrazione: un contatore automatico reso attivo sulla pagina web dedicata alle iscrizioni consentirà di accettare le iscrizioni fino ad esaurimento dei posti disponibili. Se la procedura di iscrizione sarà portata a termine correttamente, l iscritto riceverà pochi minuti dopo la conclusione della medesima una di conferma dell avvenuta registrazione. In caso di mancata ricezione dell di conferma o di impossibilità ad effettuare l iscrizione online si suggerisce di contattare la Segreteria Organizzativa. ATTENZIONE: in caso di iscrizione da parte da parte di ASL non saranno accettati pagamenti a convegno avvenuto. Qualora l ASL non fosse in grado di provvedere al pagamento all atto dell iscrizione il partecipante dovrà anticipare la quota. Sarà nostra premura provvedere al rilascio della fattura quietanzata intestata all ASL. Per l esenzione dell IVA è necessario che l ASL invii apposita richiesta alla Segreteria Organizzativa presso la sede di Italbioforma. Modalità di verifica dell apprendimento Alla conclusione dell evento formativo i partecipanti compileranno un questionario di verifica dell apprendimento ed una scheda di valutazione del corso, con particolare attenzione ai seguenti aspetti: rilevanza degli argomenti, qualità educativa/di aggiornamento ed efficacia dell evento. Crediti ECM Per tutte le categorie professionali cui il corso si rivolge, ovvero per i medici, biologi e tecnici di laboratorio, è stato richiesto l accreditamento ECM (Rif. ECM n e ). Non appena ne riceverà comunicazione dal Ministero la segreteria organizzativa pubblicherà nella sezione Corsi del sito il numero di crediti attribuiti al corso. Il rilascio della certificazione dei crediti è subordinato alla partecipazione effettiva all intero programma formativo (100% delle ore di formazione). Attestato Ai Partecipanti sarà rilasciato un Certificato di Partecipazione valido per l inserimento nel curriculum formativo. 3

4 ABSTRACT Strutture degli acidi nucleici, codice genetico e replicazione del DNA P. Amboni Il corso ha l'obbiettivo di dare le conoscenze di base sulla struttura e sulle funzioni degli acidi nucleici. Gli argomenti trattati saranno i seguenti: la struttura molecolare delle basi azotate con le relative caratteristiche chimico fisiche la composizione del DNA, la sua struttura molecolare e tridimensionale, e come questa ne determini le caratteristiche chimiche l'organizzazione del filamento di DNA all'interno dei procarioti e degli eucarioti Il codice genetico le modalità di trasmissione dell'informazione genetica sia di procarioti che eucarioti. la replicazione del DNA con particolare attenzione agli aspetti molecolari della forca replicativa i telomeri e le telomerasi la trascrizione e la maturazione del DNA Estrazione e conservazione di DNA e RNA da diversi materiali F. Broccolo Verranno trattati i vari metodi di estrazione degli acidi nucleici da diverse matrici biologiche. In particolare verranno affrontati tutte le problematiche che si possono incontrare durante tali procedure e i vari accorgimenti per poter valutare il recovery di DNA e la presenza di eventali inbitori presenti nel campione che lo rendono non idoneo. Saranno anche confrontati i metodi manuali con i metodi su piattaforme 96 well che si interfacciano con stazioni automatizzate. In particolare: - Estrazione e purificazione del DNA/RNA: principi teorici e aspetti pratici - Metodi di estrazione del DNA e RNA - Precauzioni da adottare lavorando con il DNA e RNA - Sistemi di quantificazione del DNA/RNA - Conservazione del DNA Ibridazione degli acidi nucleici: teoria e applicazioni F. Dulcetti L'ibridazione è un metodo per identificare molecole di acidi nucleici con sequenze di basi strettamente correlate a quelle di un acido nucleico marcato che funge da sonda. Più in generale possiamo dire che l'ibridazione è la reazione attraverso la quale due sequenze di acidi nucleici a singolo filamento, tra loro complementari, reagiscono specificatamente formando un ibrido. In questa breve relazione descriveremo le caratteristiche e le applicazioni di questa metodica. L origine della PCR e descrizione della metodica A. Callegaro A metà degli anni 80 Kary B. Mullis lavorò ad una innovazione tecnologica che avrebbe rivoluzionato l attività dei laboratori di ricerca e di diagnostica, e che trova applicazione nei diversi campi della medicina: la Polymerase Chain Reaction che consente di ottenere rapidamente milioni di molecole di DNA a partire da quantità minime, anche una singola copia, di acido nucleico. La PCR può essere definita come: una reazione di amplificazione in vitro di un segmento di DNA specifico o target, per mezzo di una DNA polimerasi. La reazione di PCR può essere considerata una trasformazione di reagenti in prodotti e i reagenti coinvolti sono: DNA target da amplificare Due primers oligonucleotidici a singolo filamento che, appaiandosi in modo specifico con il DNA target, forniscono gli elementi di innesco per la sintesi di una nuova molecola di DNA complementare al target. 4

5 La DNA polimerasi, Taq polimerasi termostabile, ottenuta da Thermus acquaticus, che sintetizza il nuovo filamento di DNA I disessoribonucleotidi (dntps) per la nuova molecola di DNA. Sali minerali, la cui concentrazione dipende dalla specificità del processo di amplificazione. I parametri necessari per l amplificazione sono: Denaturazione del DNA target ad alta temperatura (94 C- 95 C) Annealing o appaiamento dei primers alla sequenza target ( 50 C-60 C) Estensione dei primers ed elongazione della nuova molecola di DNA (72 C) L insieme di questi tre parametri viene chiamato ciclo e in una reazione di amplificazione vengono effettuati cicli. Poiché il nuovo DNA prodotto in un ciclo può funzionare da stampo per il ciclo successivo, il numero delle sequenze target di DNA viene raddoppiato ad ogni ciclo. Il cosiddetto effetto plateau è il punto in cui la reazione di amplificazione cessa di essere esponenziale. Uno dei grandi successi della PCR dipende dalla possibilità di amplificare anche piccolissime quantità di DNA presenti ad esempio nei campioni clinici,dell ordine di nanogrammi. Si possono amplificare segmenti di DNA molto piccoli e anche parzialmente degradati. E quindi una metodica estremamente sensibile e rapida. La PCR presenta però anche alcuni svantaggi.proprio perché si tratta di una metodica estremamente sensibile, vi la possibilità di false positività dovute alle contaminazioni dei campioni con DNA amplificati in precedenti reazioni di PCR ( Carry over ).Un altro svantaggio è la possibilità di falsi negativi dovuti alla prenza di inibitori della Taq polimerasi presenti nei campioni clinici. Alcuni di questi problemi con il tempo, la standardizzazione e l automazione della metodica sono stati parzialmente superati e la PCR svolge un ruolo decisivo nella diagnostica molecolare. Descrizione ed applicazioni di tecniche di amplificazione diverse dalla PCR A.M. Ruggeri La PCR (Polymerase Chain Reaction) è senza alcun dubbio la più conosciuta e la più utilizzata tra le tecniche di amplificazione degli acidi nucleici, esistono però numerose altre tecniche di amplificazione genica quali : la LCR(ligase Chain Reaction), Il NASBA ( Nucleic Acid Sequenze Based Amplification), il TMA (Trascription Mediaded Amplification) ed il bdna (branched DNA). In questa breve relazione prenderemo in esame le caratteristiche di queste metodiche i loro punti di forza ed i loro limiti. Tecniche per la rilevazione dei prodotti di PCR: dai metodi colorimetrici alla PCR Real Time A. Callegaro L ultima fase di una reazione di PCR riguarda la valutazione del prodotto di PCR stesso. Questa fase è molto importante perché permette di accertare che il frammento amplificato corrisponda esattamente alla sequenza bersaglio attesa. Uno dei primi e più semplici metodi utilizzati per la rivelazione del DNA amplificato consiste in una corsa elettroforetica su gel di agarosio e successiva colorazione con etidio bromuro e visualizzazione del DNA ai raggi UV. Per verificare però la specificità del prodotto ottenuto è necessaria una ibridazione con una sonda oligonucleotidica specifica. Per poter rivelare il prodotto dell ibridazione tra amplificato e sonda, uno dei due componenti deve essere marcato. Sono stati recentemente sviluppati metodi di ibridazione basati sull uso di specifiche sonde o primers di amplificazione marcati con traccianti enzimatici, fluorescenti, chemiluminescenti. Sono stati recentemente messi a punto dei sistemi di PCR in tempo reale o Realtime PCR che consentono di amplificare e contemporaneamente rivelare il DNA di interesse. La quantificazione dei prodotti di PCR avviene nella fase esponenziale della reazione determinando maggiore sensibilità e accuratezza del dosaggio. L automazione del processo riduce notevolmente i rischi di contaminazione da carry-over. 5

6 Applicazioni della tecnologia dei microarrays nella ricerca di base e applicata A. Clivio Verranno esposti i presupposti teorici, i principi pratici e i problemi riguardanti gli approcci ad ampio spettro che caratterizzano la tecnologia dei Microarrays. Si farà uso di esempi pratici che riguardano la ricerca di base (analisi del profilo di espressione genica in cellule diverse, ricostruzione di reti di interazioni tra geni, utilizzazione dei microarrays per la sequenziazione e l identificazione di polimorfismi a singolo nucleotide) ma anche alla ricerca applicata alla Medicina, con l identificazione di geni coinvolti nel processo di metastatizzazione, una possibile futura utilizzazione dei profili nella prognosi dei tumori, l identificazione ad ampio spettro di agenti patogeni virali e batterici. L organizzazione del Laboratorio di Biologia Molecolare F. Broccolo Verrà descritto quali sono gli spazi necessari secondo le normative europee per poter utilizzare tutte le strumentazioni necessarie per la biologia molecolare in campo diagnostico. In particolare sarà affrontato in modo esauriente tutte le precauzioni che devono essere prese per le reazioni di amplificazione mediante PCR e Real-time PCR. Proteomica A. Clivio Verranno esposti i principi di preparazione, purificazione ed analisi delle proteine da campioni biologici, con particolare riferimento alle tecniche cromatografiche in HPLC, alla elettroforesi mono- e bidimensionale delle proteine, agli approcci immunologici per la dissezione del repertorio proteico e all analisi in spettrometria di massa. Verranno portati esempi pratici originali di analisi del proteoma urinario per lo studio di patologie particolari (tumore della vescica) ed esempi in collegamento Internet, di analisi dello spettro di massa mediante utilizzazione delle banche di dati disponibili sul sìto NCBI. Questi argomenti verranno integrati con informazioni sui microarrays di proteine, che saranno, in un futuro non molto lontano, uno strumento diagnostico potente ed affidabile. 6

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