DNA BARCODE: ALLESTIRE UNA BANCA DATI PER TUTELARE LE NOSTRE RISORSE E GARANTIRE LA TRACCIABILITA.

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1 DNA BARCODE: ALLESTIRE UNA BANCA DATI PER TUTELARE LE NOSTRE RISORSE E GARANTIRE LA TRACCIABILITA. Ogni regione italiana vanta una quantità notevole di prodotti agroalimentari ed animali tipici e caratteristici. Tuttavia per quanto si cerchi di tutelarne al massimo la tipicità, alcuni strumenti non si stanno rivelando totalmente efficaci visto il numero di frodi commerciali sugli alimenti che tuttora di verificano. La necessità di poter tracciare l origine e l autenticità di un prodotto agroalimentare ed animale è un esigenza emergente del consumatore e un metodo di lavoro inderogabile per il produttore. La difficoltà principale risiede nel riuscire ad individuare una caratteristica del prodotto che abbia la proprietà di contraddistinguerlo univocamente e lungo tutti gli step del processo di trasformazione, dalla materia prima al prodotto finito. Ciò che contraddistingue ogni singolo essere vivente e che lo rende esclusivo è l informazione contenuta nel suo DNA. Per questo, l analisi del DNA (fingerprinting genetico) è stata già da tempo scelta come sistema di elezione per numerose indagini, quali le analisi di paternità umane e per certificazioni di cultivar o razza originaria di appartenenza in ambito vegetale e animale. Quindi il DNA può essere utilizzato come un invisibile codice a barre, DNA BARCODE, per l identificazione di un prodotto, infatti, anche dopo i processi di lavorazione le caratteristiche fenotipiche del prodotto non sono più riconoscibili, la natura del suo DNA non subisce trasformazioni. La tracciabilità genetica è importante per offrire maggiore garanzia e trasparenza al consumatore, valorizzare e tutelare le produzioni tipiche e dare un valore aggiunto al prodotto. L industria agro-alimentare italiana trae vantaggio dalla ampia disponibilità e diversità di specie orto-frutticole di pregio. Questi nostri materiali genetici, spesso non adeguatamente valorizzati e conosciuti, rappresentano una importante risorsa per incrementare la competitività del comparto agricolo italiano nei mercati internazionali. Inoltre, la crescente preferenza dei consumatori per alimenti salubri, tradizionali e sicuri fornisce una ulteriore opportunità all agricoltura italiana per affermarsi anche sui mercati interni, tramite la valorizzazione dei cosiddetti prodotti tipici. La tutela dei marchi dei prodotti tipici e dell indicazione di provenienza deve però necessariamente prevedere l impiego di strumenti analitici affidabili, principalmente per evitare un uso indebito, anche ai soli fini pubblicitari, di un carattere distintivo della varietà da proteggere, quali il nome stesso, il suo luogo di origine o le sue peculiarità. Tali strumenti analitici sono indispensabili soprattutto per prodotti processati industrialmente o impiegati come ingredienti di altri alimenti, in quanto i consumatori e la distribuzione molto difficilmente sono in grado di distinguere una denominazione indebitamente usata. Un uso improprio di una denominazione provoca infatti un doppio danno, determinando disorientamento della clientela, che non ritrova più nel prodotto acquistato le sue reali caratteristiche distintive, e sottraendo flussi commerciali alle imprese che

2 legittimamente impiegano e sfruttano un determinato marchio o prodotto tipico. Anche per rispondere a queste problematiche, la tracciabilità di filiera, è divenuta dal gennaio 2005 obbligatoria per tutte le aziende agro-alimentari. Il Reg. CE 178/2002 la definisce come la capacità di rintracciare e seguire un alimento, un mangime, un animale produttore di alimenti o una sostanza attraverso tutti gli stadi della produzione e della distribuzione. Il perseguimento della tracciabilità così definita include anche la tracciabilità genetica dei materiali vegetali. Tale attività è di vitale importanza soprattutto per la difesa e la tutela dei prodotti che sono utilizzati nelle filiere produttive che si fregiano di marchi collettivi: DOP (Denominazione di Origine Protetta): denominazione attribuita per identificare un prodotto la cui produzione, trasformazione ed elaborazione hanno luogo in un area geografica ben delimitata, in base ad un esperienza riconosciuta e constatata e secondo un determinato processo produttivo (disciplinare di produzione); IGP (Indicazione Geografica Protetta): viene attribuita a quei prodotti il cui legame con una specifica area geografica è rappresentato da almeno uno delle fasi della sua preparazione; STG (Specialità Tradizionale Garantita): questa dicitura non fa riferimento ad un origine ma ha per oggetto la valorizzazione di una composizione o di un metodo di produzione tradizionale. Inoltre sono presenti i marchi DOC, IGT e DOCG per il comparto vinicolo. Sebbene questo tipo di analisi sia già conosciuto e validato e tale approccio sia ormai di uso comune in molti laboratori, manca una vera e propria banca dati che metta insieme tutti le sequenze target identificate al fine di creare una sorte di raccolta che possa poi essere fruibile per le caratterizzazioni e la creazione e lo sviluppo di tecniche di analisi più veloci, mirate e con costi contenuti e di marchi genetici specifici. Quest attività si propone di agire su due fronti: una parte è dedicata alla ricerca, un laboratorio di analisi molecolari nel quale si tipizzano le produzioni tipiche non ancora studiate, partendo dalle produzioni caratteristiche e ricercando sequenze del DNA target, al fine di costruire primers specifici, mettere appunto kit e metodiche di analisi specie-specifici e brevettarli. Dall altra fornire uno strumento efficace per garantire la tracciabilità, smascherare i truffatori, e garantire la tipicità dei prodotti. In considerazione del fatto che molte produzioni sono già state analizzate nella ricerca di base, abbiamo valutato la costruzione di una grande banca dati, che sia studiata regione per regione, alimento per alimento, animale per animale, unendo così tutti i codici a barre DNA, per diventare una strumento di ricerca codici a barre ma anche una sorte di motore di ricerca che raccolga tutte le sequenze già analizzate e brevettate da enti, università e altri.

3 Descrizione della tecnica di analisi. Il DNA (Acido Desossiribonucleico), è la base chimica della vita che si complessa con proteine per formare i cromosomi. Dal punto di vista strutturale il DNA è una doppia elica formata da unità dette nucleotidi. Ogni nucleotide è composto da una base azotata [Adenina (A), Timina (T), Guanina (G), Citosina (C)], uno zucchero e un gruppo fosfato. La disposizione sequenziale dei nucleotidi nel DNA di un individuo è responsabile dell unicità di una data forma individuale di vita, sia essa un essere umano, una pianta, un animale o un microrganismo. Il DNA è racchiuso all interno del nucleo di ogni cellula e contiene le informazioni genetiche necessarie alla sintesi dell RNA. Durante la divisione cellulare il DNA si spiralizza in strutture dette cromosomi. I cromosomi sono in numero caratteristico per ogni specie (nell uomo 46, nel moscerino della frutta 8, nel topo 40, nel cane 78, nel gamberetto 254 etc.). Il numero dei cromosomi si dimezza nelle cellule aploidi ovvero i gameti sessuali. Il codice genetico è una sorta di linguaggio basato su una particolare sequenza dei nucletidi (del DNA e dell RNA). Esso è universale, cioè è uguale in tutti gli organismi viventi. Poiché il nucleotide è costituito solo da 3 elementi (lo zucchero, il gruppo fosfato e la base azotata) e poiché l unico elemento variabile è rappresentato dalla base azotata, ne deriva che l elemento determinante la sequenza del codice genetico è la base azotata. Ogni organismo vivente ha un proprio DNA caratteristico, e con l'eccezione dei gemelli omozigoti identici, il DNA di ogni individuo è unico. Per questa ragione è stata messa a punto una tecnica che si basa su questi principio, il DNA fingerprint, l impronta digitale del DNA. La prima operazione da eseguire per la realizzazione del DNA fingerprint, è estrarre un campione di DNA da un tessuto o da un liquido biologico, come ad esempio capelli, sangue o saliva. Il campione deve essere ora suddiviso utilizzando enzimi di restrizione, la cosiddetta digestione, i siti di restrizione sono i punti dove gli enzimi di restrizione vanno a tagliare, la differenza che si evidenzierà sarà la frammentazione: due DNA uguali produrranno lo stesso numero di frammenti con lo stesso peso molecolare. I segmenti ottenuti sono organizzati in base alla loro grandezza usando: 1. un processo chiamato elettroforesi; 2. evidenziati con un colorante fluorescente; 3. esposti per lo studio ai raggi ultra violetti. Il DNA fingerprint è stato ultilizzato per la prima volta come tecnica di identificazione nel Attualmente all analisi con enzimi di restrizione si sono affiancate tecniche quali l amplificazione del DNA tramite PCR che permette di amplificare regioni di DNA ripetute in tandem dette STR e VNTR che sono sequenze caratteristiche di

4 ogni individuo e che vengono poi evidenziate sempre tramite elettroforesi su gel di agarosio. Alla luce di questo tipo di conoscenze si costruiscono tutte le analisi del DNA. Per effettuare queste analisi è quindi necessario aver ben chiaro dall inizio quale è il prodotto genico finale di interesse e scegliere poi il metodo, la tecnica e i reagenti da utilizzare. I macchinari sono i medesimi tranne qualche rara eccezione come nelle analisi del mtdna che prevede il sequenziamento di parti del genoma mitocondriale e che vengono effettuate con l ausilio di macchinari costosi attualmente in dotazione a centri di ricerca e università che forniscono in service per privati il sequenziamento. L analisi del DNA si effettua sembre seguendo gli stessi steps: -campionamento -estrazione -purificazione -amplificazione -quantificazione -lettura dei risultati - conservazione del campione FASI DI ORGANIZZAZIONE DEL SERVIZIO CAMPIONAMENTO Potrà essere effettuato in due modi a seconda della richiesta del cliente: -in loco da un operatore -tramite kit estrattivo preventivamente richiesto dal cliente Campionamento in loco: viene effettuato da un operatore che preleva il campione biologico. Nel caso dell agroalimentare, sementi, foglie e frutti o lo stesso alimento costituiscono la matrice biologica. Il prelievo viene effettuato senza l utilizzo di dispositivi di sicurezza specifici ma solo con guanti e riposto in contenitori sterili. L utilizzo di guanti e contenitori sterili è un accorgimento per evitare la contaminazione e la degradazione del DNA. Campionamento con kit: il cliente richiede un test genetico e gli viene recapitato un kit di estrazione del campione e/o le istruzioni per raccogliere e inviare correttamente il campione. ESTRAZIONE DEL DNA L isolamento e la purificazione degli acidi nucleici sono i primi delicati passi nella maggior parte delle applicazioni di biologia molecolare. L ottimizzazione dell estrazione dipende: - dal tipo di acido nucleico che si vuole isolare (per esempio singola o doppia catena di DNA, RNA totale, mrna );

5 - dalla fonte utilizzata per l estrazione (tessuti animali o vegetali, cellule eucariotiche o procariotiche, ); - dal materiale biologico contenente la fonte degli acidi nucleici usato per l estrazione (organo intero, sangue, siero, plasma, saliva, tessuto etc); - dall applicazione prevista post-estrazione (PCR, clonaggio, restrizione enzimatica, Southern blotting...) Indipendentemente dalla tecnica di estrazione usata, essa deve rispondere a due requisiti principali: la resa e la purezza, intesa sia come presenza in soluzione dell acido nucleico in esame, sia come assenza di sostanze contaminanti che, legandosi ai reagenti in soluzione, potrebbero modificare i risultati. Dopo aver scelto il campione biologico da cui estrarre il materiale genetico, il percorso di estrazione e purificazione prevede quattro fasi: 1. Lisi delle cellule. La dissoluzione della cellula (distruzione della membrana) è una fase delicata in quanto risultato di due eventi contrastanti: l esigenza di frammentare il materiale di partenza e quella di non alterare gli acidi nucleici da analizzare. I metodi tradizionali di lisi si basano su trattamenti complessi che includono la digestione enzimatica, la solubilizzazione tramite detergente o tecniche meccaniche di spaccatura. 2. Inattivazione delle nucleasi cellulari. 3. Separazione e recupero dell acido nucleico dalla soluzione contenente il lisato cellulare. Un primo metodo per effettuare tale operazione prevede l uso di solventi organici (come fenolo o cloroformio), che consentono la separazione degli acidi nucleici dai contaminanti (proteine); successivamente, dopo centrifugazione, gli acidi nucleici vengono recuperati in soluzione acquosa. Sono stati ultimamente sviluppati protocolli chimici per la separazione e l isolamento di frammenti di DNA realizzati in un singolo passaggio. Una seconda metodologia di separazione prevede l adsorbimento del DNA sulla superficie di una matrice di gel di silice in presenza di sali caotropici (in commercio si trovano diversi kit di separazione basati su questo principio). 4. Precipitazione: avviene di solito in alcool etilico o isopropanolo e permette il recupero degli acidi nucleici in forma solida. Dopo lavaggio con etanolo, si ha una valutazione quali-quantitativa degli acidi nucleici estratti con metodi spettrofotometrici e quindi la loro conservazione. AMPLIFICAZIONE DEL DNA Amplificare un acido nucleico significa produrre delle copie del gene o della porzione di interesse. È la fase biotech del nostro processo, dove vengono utilizzati enzimi estratti da microorganismi per isolare il DNA d interesse. Le informazioni a monte sono il gene d interesse e le sequenze fiancheggianti per l acquisto dei primers specifici. Quindi si prepara una mix di reazione che

6 utilizza H2O, Mg2, primers F e R, nucleotidi, Taq polimerasi e il DNA precedentemente estratto. Quindi si procede con la PCR. La PCR (Polymerase Chain Reaction) è un metodo attraverso cui una sequenza di acido nucleico può essere amplificata esponenzialmente in vitro. Lo stesso metodo può essere usato per modificare la sequenza amplificata o per aggiungerle nuova informazione di sequenza. È necessario che le estremità della sequenza da amplificare siano conosciute con sufficiente precisione per poter sintetizzare degli oligonucleotidi che saranno ibridizzati ad esse, e che una piccola quantità della sequenza sia disponibile per dare inizio alla reazione. Non è necessario che la sequenza da sintetizzare enzimaticamente sia inizialmente presente in forma pura; essa può anche essere una frazione minoritaria di una miscela complessa, come un segmento di un gene a singola copia nel DNA totale umano. La sequenza da sintetizzare può essere presente inizialmente come una molecola discreta oppure può essere parte di una molecola più grande. In entrambi i casi, il prodotto della reazione sarà una molecola discreta di dsdna con estremità corrispondenti a quelle 5' degli oligomeri utilizzati. Un tipico ciclo PCR prevede: 1. Denaturazione al calore di uno stampo di DNA che deve essere copiato (94-99 C) 2. Appaiamento (annealing) di coppie di oligo, (30-65 C) 3. Estensione da parte di DNApol termoresistente a partire dai primer. (65-72 C) La scelta delle condizioni operative del ciclo (tempo e temperatura) è compito dell'operatore, è una scelta empirica e non prefissata. REAL TIME-PCR L'evoluzione della tecnica di PCR proposta dal saggio Taq Man permette oggi una drastica riduzione dei tempi di esecuzione e del materiale consumato

7 utilizzando un solo strumento ed eliminando completamente l'impiego di reagenti radioattivi o tossici. Comparato alle PCR tradizionali, il test non solo mantiene spiccate caratteristiche di sensibilità, ma garantisce anche decisivi miglioramenti in termini di specificità, di precisione e di intervallo di quantificazione del campione incognito. Questi vantaggi sono dovuti all'innovativo sistema di rilevamento e misurazione "in tempo reale" del DNA amplificato, che consente sia di ridurre il numero delle repliche necessarie alla determinazione di ogni campione, sia di abbandonare tutte le manipolazioni successive all'amplificazione, che rappresentano potenziali fonti di alterazione dei risultati, ed inoltre e dotata di elevata sensibilità. La tecnologia Real-Time PCR ha permesso lo sviluppo di approcci quantitativi basati sull'utilizzo di sonde TaqMan raggiungendo limiti di rilevazione pari a 0,80 g di DNA target in miscele complesse. Nell attuale PCR Real Time con sonde tipo TaqMan l estensione dei primer durante la reazione PCR produce fluorescenza. Se infatti la sequenza target e presente nella miscela di reazione, la sonda TaqMan si appaia a valle del sito di attacco del primer e durante l estensione dei primer, viene degradata dall attivita 5 nucleasica della Taq polimerasi. Tipicamente, una sonda TaqMan contiene FAM (6 carboxy-fluorescein) come reporter fluorescente legato covalentemente all estremita in 5 e TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) legata covalentemente all estremita 3. La degradazione della sonda non puo avvenire quando questa e libera in soluzione, ma esclusivamente dopo annealing ai frammenti di neosintesi, per la citata attivita 5 nucleasica, e corrisponde ad emissione di fluorescenza, per la separazione tra la molecola del reporter e del quencher. Il vantaggio di un sistema di questo tipo sta essenzialmente nella specificita della sonda, capace di legarsi solo ad ampliconi specifici. La possibilita di utilizzare diversi tipi di fluorocromi per mancare sonde diverse, consente inoltre di rilevare più di una sequenza target in una sola reazione, realizzando cosi una reazione in multiplex. Uno svantaggio sta invece nell obbligo di sintetizzare, per ogni target, una sonda ad hoc. In aggiunta alle sonde TaqMan sono state proposte e brevettate altri tipi di sonde, quali FRET (Forster resonance energy transfer), SunRise, molecular beacons, Scorpions. In alternativa alle sonde fluorogeniche l accumulo di amplificati si puo seguire in Real Time utilizzando coloranti specifici del DNA con i seguenti vincoli: capacita di emettere fluorescenza crescente all aumentare degli amplificati legati e capacita di non interferire in alcun modo nell evolversi della reazione PCR.

8 Un colorante dotato di queste caratteristiche e il SYBRR Green I, con sensibilità paragonabile a quella del bromuro di etidio: il SYBR Green I si lega anche a prodotti di amplificazione aspecifici eventualmente generati durante la reazione. Gli strumenti per PCR Real Time, oltre a fungere da termociclatori, eccitano, durante la PCR con un laser a ioni argon o con lampade al tungsteno, i fluorocromi presenti nei campioni e convogliano quindi la fluorescenza emessa in risposta lungo fibre ottiche fino ad uno spettrografo che provvede a separare le componenti del reporter e del quencher. Appositi software acquisiscono lo spettro di emissione di ogni singolo campione per tutta la durata della PCR e convertono la variazione di fluorescenza del reporter in una rappresentazione in tempo reale della cinetica di amplificazione. In maggiore dettaglio, l algoritmo di analisi calcola l emissione del reporter (R) e del quencher (Q) ogni pochi secondi. I valori di Rn riflettono la quantita di sonda fluorescente degradata e possono essere rappresentati in un grafico in funzione del numero dei cicli. Contemporaneamente, l algoritmo determina il ciclo soglia che corrisponde ad effettiva emissione di fluorescenza, scorporata dal rumore di fondo. Il calcolo della quantita di DNA dei campioni incogniti viene effettuata determinando il ciclo della PCR (ciclo soglia, Ct) in cui viene raggiunto il valore soglia di fluorescenza del reporter che separa i segnali di amplificazione specifici da quelli del rumore di fondo del sistema. Il numero dei cicli necessari

9 perche un campione raggiunga il suo Ct e inversamente proporzionale al numero di copie target presente inizialmente. Una curva di referenza costruita con i Ct di campioni standard a contenuto di DNA noto in funzione del logaritmo della relativa quantita di DNA, consente poi l estrapolazione del contenuto di DNA nei campioni incogniti. Il vantaggio in termini di precisione e di intervallo di quantificazione rispetto alla PCR tradizionale, e dovuto alla possibilita di quantificare il DNA al ciclo soglia, che e sempre calcolato nella fase esponenziale della reazione PCR, fase in cui i reagenti sono ancora lontani dall esaurimento e gli elementi di variabilita sono cosi ridotti al minimo. QUANTIFICAZIONE Il metodo spettrofotometrico sfrutta la capacità degli acidi nucleici di assorbire la luce UV con un massimo di assorbimento ad una lunghezza d'onda di 260 nm, lo spettro di assorbimento varia da 230 nm a 280 nm. Acido Nucleico dsdna 50 ssdna 37 RNA 40 Oligo 30 Concentrazione con assorbimento unitario (µg/ml) Di sotto riporto un esempio di lettura della concentrazione allo spettrofotometro per dsdna: Impostare lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 260 nm. 1. In una cuvetta di quarzo porre 1ml di acqua (bianco) e azzerare lo strumento (il volume può variare in base alla capacità della cuvetta). 2. Preparare una cuvetta di quarzo contenente 996ul di H20 e aggiungere 4ul della soluzione di dsdna (diluizione 1:250). E' possibile anche utilizzare diluizioni differenti, a seconda della situazione. 3. Coprire con parafilm e miscelare capovolgendo delicatamente la cuvetta. 4. Introdurre la cuvetta nello spettrofotometro e leggere l'assorbanza (A) a 260 nm e 280 nm. (in alcuni spettrofotometri molto vecchi è necessario impostare manualmente le lunghezze d'onda e leggere prima a 260 e poi a 280) 5. Coi risultati ottenuti, calcolare la concentrazione di DNA sapendo che in una cuvetta con un cammino di 1 cm, il DNA a doppio filamento alla

10 concentrazione di 50µg/ml ha un assorbimento di 1 a 260nm: Concentrazione DNA (ug/ml)=a260nm 50ug/ml 1 Unità assorbimento 6. Per risalire alla concentrazione iniziale della soluzione moltiplicare il valore ottenuto per il fattore di diluizione (250 o quello scelto al passaggio 2). Il procedimento è identico per la lettura di ssdna, RNA o Oligo ma bisognerà utilizzare gli appropriati valori di "Concentrazione con assorbimento unitario" riportati in tabella. Per determinare la purezza dell'acido nucleico vengono utilizzati i seguenti rapporti: rapporto A260/A280 = indice della contaminazione da proteine Per in DNA il rapporto deve essere mentre per l'rna , rapporti superiori indicano una contaminazione da proteine. rapporto A260/A230 = indice della contaminazione da carboidrati e fenoli (solventi) il valore ottimale di questo rapporto e di circa 2.2, rapporti inferiori indicano contaminazione da solventi E' possibile utilizzare anche la lunghezza d'onda di 320nm come background: a questa lunghezza d'onda non assorbono né acidi nucleici né proteine quindi l'assorbanza dovrebbe essere zero. Comunque deve essere il 5% della assorbanza a 260nm altrimenti vuol dire che il campione (o la cuvetta) è molto sporco e non è possibile fare una lettura accurata. Il valore di assorbanza a 320nm deve essere sottratto agli altri valori di assorbanza. LETTURA DEI RISULTATI L elettroforesi in gel è il metodo standard utilizzato per separare, identificare e purificare frammenti di DNA. Il gel può essere costituito da agarosio o da poliacrilamide. I gel di poliacrilamide sono usati per separare frammenti di DNA < 500 bp e hanno un elevata risoluzione, ma sono più complicati e pericolosi da preparare e più difficili da maneggiare rispetto ai gel di agarosio. I gel di agarosio sono semplici da preparare e sono tipicamente usati per separare frammenti di dimensioni variabili da poche centinaia di basi a 20 kb. Essi sono largamente utilizzati per la maggior parte delle analisi routinarie su DNA. L agarosio è un polimero di carboidrati estratto dalle alghe. Esso, se fuso e gelificato, forma una matrice, la cui porosità dipende dalla concentrazione dell agarosio.

11 La molecola del DNA è caricata negativamente e, quindi, in un campo elettrico migrerà verso il polo positivo. La matrice porosa del gel ritarda la migrazione del DNA, consentendo ai piccoli frammenti di spostarsi più velocemente rispetto ai più grandi. Il risultato è che i frammenti di DNA si separeranno nella matrice in funzione del peso molecolare e della forma (superelica, circolare o lineare). Più elevate concentrazioni si usano per separare le molecole più piccole e, viceversa, concentrazioni più basse sono più adatte a separare frammenti più grandi. Il tampone di elettroforesi è una soluzione salina che serve sia a condurre la corrente elettrica che a controllare il ph durante l elettroforesi. Il tampone di caricamento (colorante + addensante), che si aggiunge ai campioni prima dell elettroforesi, serve ad appesantire i campioni, permettendo la loro permanenza nei pozzetti, e a fornire un marker visivo del progredire della corsa elettroforetica. Dopo l elettroforesi le bande di DNA sono colorate di routine con bromuro di etidio (agente intercalante cancerogeno) La concentrazione dell agarosio può essere variata per ottimizzare la migrazione, se si ha un idea della grandezza dei frammenti di DNA da migrare. I gel di uso più comune sono allo 0,8-1%. Questa concentrazione riesce a separare un range di dimensioni da circa 500 bp a circa bp. Separazione significa differenziare tra 2 o più frammenti di differenti dimensioni. Per sciogliere l agarosio, piuttosto che usare l acqua distillata, si usano soluzioni tamponate che consentono al DNA di muoversi uniformemente lungo il gel. Queste soluzioni hanno lo scopo, infatti, di determinare e mantenere stabili il ph e la concentrazione di ioni del gel. TAE e TBE sono i tamponi più comunemente usati per l elettroforesi. T sta per Tris, che consente il mantenimento di un valore costante di ph della soluzione; E sta per EDTA, che chela i cationi divalenti, come il magnesio. Questo è importante, perché la maggior parte delle nucleasi richiede cationi divalenti per funzionare. A o B sta per acido Borico o Acetico che forniscono l appropriata forza ionica al tampone. Dopo aver pesato l agarosio e misurato il tampone, i due vengono mescolati. Dal momento che l agarosio non è solubile a temperatura ambiente, esso deve essere portato ad ebollizione o in forno a microonde o in autoclave o su un agitatore magnetico. Il sistema di costruzione di un gel di agarosio è costituito da tre parti, la piastra, il supporto e il pettine. Quest ultimo serve a realizzare i pozzetti: si immerge nel gel a denti in giù, quando è caldo e liquido e poi, quando l agarosio si sarà solidificato, si estrae, lasciando gli spazi precedentemente occupati dai denti. A temperatura ambiente, il gel polimerizza in minuti. Il gel viene quindi sistemato nella camera di elettroforesi e sommerso completamente con il tampone di elettroforesi, in modo che l intero gel sia soggetto ad uguale corrente elettrica.

12 Per monitorare la migrazione del DNA nel gel, si aggiungono anche molecole caricate coloranti, di differenti colori e dimensioni. Uno, il blu di bromofenolo, è più piccolo di quasi tutti i frammenti di DNA e, quindi, migrerà più Il campione di DNA, di qualsiasi tipo (estratto, restrizione enzimatica, etc.) è in soluzione acquosa. L altro, lo xilene cianolo, è una molecola grande, che migra insieme ai frammenti di più elevato peso molecolare. Si può perciò presumere che la maggior parte dei campioni migrerà nella zona interposta tra i due coloranti, cosicché quando il blu di bromofenolo sarà giunto in prossimità del fondo del gel, si potrà interrompere la corsa. Tipicamente 5-20 ul sono caricati in ogni pozzetto, immergendo il puntale nel tampone di elettroforesi, fino ad avvicinarsi all ingresso del pozzetto. A questo punto si collega l apparecchio ad un alimentatore e si applica il campo elettrico. Dopo aver rimosso il gel dall apparecchio di elettroforesi, si può visualizzare il DNA mediante colorazione con bromuro di etidio, una molecola che emette fluorescenza una volta esposta agli UV. Il bromuro di etidio è un agente che si intercala tra le basi del DNA e quando è legato al DNA ha uno spettro di eccitazione della fluorescenza con un massimo a 302 nm e presenta una fluorescenza circa 10 volte maggiore rispetto alla molecola del bromuro di etidio libero. Il gel viene posto su un transilluminatore a luce UV e viene osservato. Sebbene la mobilità elettroforetica del DNA in presenza di bromuro di etidio si riduca di circa il 15%, la possibilità di esaminare il gel direttamente agli UV durante la migrazione può essere molto utile. Inoltre, la risoluzione è nettamente migliore, in caso di frammenti di DNA di basso peso molecolare. Nel caso, invece, di colorazione del gel dopo la migrazione, il gel è immerso per minuti nella soluzione colorante e osservato agli UV. Una decolorazione non è il più delle volte necessaria, ma l identificazione di piccole quantità di DNA è più facile, se il background causato dal bromuro di etidio non legato viene ridotto immergendo il gel in acqua distillata per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo l uso, le soluzioni di bromuro di etidio dovrebbero essere decontaminate, attraverso trattamenti chimici che ne riducano l attività mutagena. Il bromuro di etidio si decompone a 262 C.

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