Trascritti alternativi nei tumori del colon-retto: IDENTIFICAZIONE MEDIANTE DNA MICROARRAYS

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1 TUMORI EREDITARI: dalla biologia al trattamento Modena Novembre 2010 Trascritti alternativi nei tumori del colon-retto: IDENTIFICAZIONE MEDIANTE DNA MICROARRAYS Dr.ssa Anna Panza

2 SPLICING ALTERNATIVO (AS) Fonte di variabilità del genoma 95% di tutti i geni multi-esonici umani presentano almeno una variante di AS [Wang, 2008; Pan, 2008] Utilizzo di siti alternativi al 3 e/o al 5 o ritenzione di introni Attività fisiologica delle varianti di AS: uguale, opposta o completamente differente e non correlata alla proteina di origine Varianti di splicing cancro-associate: disregolazione del meccanismo di AS o attività biologica di svariate isoforme di splicing Geni con AS: EGFR, CD44, NER, tiroxina-idrossilasi lattatodeidrogenasi, cadherin-11, fibronectin e BRN-3α [Venables et al., 2004] 2

3 OBIETTIVO DEL PROGETTO DNA Microarray: insieme di sequenze di DNA allineate e bloccate su di un supporto solido che permettono l analisi di miglia di geni in un singolo esperimento 3

4 OBIETTIVO DEL PROGETTO A tal fine si è scelto di utilizzare gli Human Exon 1.0 ST Arrays che ci hanno permesso di osservare i livelli di espressione di singoli esoni ed individuare eventuali isoforme di splicing associate al cancro PSR: Probes Selection Region 4

5 CRC Numero Pazienti 20 Età 60 ±14 Maschi/Femmine 14/6 MATERIALI E METODI Normal tissue (N) (KC) Primary tumor Normal tissue (N) (KC) Primary tumor N1 T1 N20 T20 Estrazione RNA totale: TRIzol Integrità: 2100 Bioanalyzer Concentrazione: NanoDrop 1000 Exon Chip: protocollo Affymetrix Sintesi 1 e 2 filamento cdna IVT > crna > 1 filamento cdna Frammentazione del ssdna Marcatura terminale con biotina Ibridizzazione Lavaggio alla fluidica Scansione > Row data 5

6 ANALISI DEI DATI Partek Genomic Suite Software 6.4 Normalizzazione dei dati grezzi: Robust Multichip Avarage (RMA) Analisi della segregazione dei tessuti (T vs N): Principal Component Analysis (PCA) Analisi delle variabili cliniche (tipo di tessuto, sesso M/F, età): ANOVA 6

7 RISULTATI 1 Alternative Splicing TESSUTO (N vs T) Geni significativi: 5498 (FDR 0.05) Probeset IDs significativi: (FDR 0.05) 1. p-value : < AspicDB: eventi di skip in CDS e/o coinvolti in un dominio proteico 3. Analisi funzionale: funzioni associate al cancro come l invasione, l apoptosi, la differenziazione (PubMed, Gene Ontology, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 4. Esclusione: eventi di splicing alternativo nelle regioni al 5 o al 3 di un gene 7

8 RISULTATI 1 Alternative Splicing TESSUTO (N vs T) Geni significativi: 5498 (FDR 0.05) Probeset IDs significativi: (FDR 0.05) cancro-correlati (8/17, 47%) LRRFIP2, CDH11, PEMT PLCG1, TRPC6, PRDM5 SLC35C2, HDAC5 adesione cellulare, citoscheletro e migrazione (3/17, 18%) VCL, CD44, TPM1 apoptosi e proliferazione (6/17, 35%) CMTM8, BUB1, CDC25B ZAK, RARRES3, PLK4 8

9 VALIDAZIONE a) Primer Sequence b) BLAT Exon up Exon skip Exon down c) BLAST REVERSE TRANSCRIPTION PCR (RT-PCR) 2 COORTE DI 26 PAZIENTI CON CRC 9

10 VCL (vinculin) Functions: Chr: 10q22.2 ; kb, 22 Exon(s) (NM_014000); (NM_003373) play a direct role in the organization or structure of the cytoskeleton plays a role in physiological processes such as cell motility, migration, development remodelling of the cytoskeleton is fundamental in proliferation, apoptosis, cell motility process and a deregulated actin organization has been linked to tumor invasion and metastasis; in silico protein predictions indicated that alternative splicing has the capability of changing the structure and, potentially, the binding capacity of VCL. LRRFIP2 (leucine-rich repeat in Flightless interaction protein 2) Functions: Chr:3p24.3-p23; kb, 27 Exon(s) ; (NM_017724), (NM_006309), (NM_ ) has been found to activate Wnt signaling, which is crucial in colon cancer development; in silico prediction indicated that the LRRFIP2 alternatively spliced exons contain several phosphorylation sites that might influence protein function. The effects of the identified splice variants, however, are still unclear. 10

11 PRDM5 Functions: Chr: 4q25-q26; kb, 16 Exon(s), (NM_018699) the protein encoded by this gene is a transcription factor of the PR-domain protein family that are known to be involved in cell differentiation and tumorigenesis. epigenetic alteration of PRDM5 (e.g., methylation of its 5'-CpG island or trimethylation of Lys(27) of histone H3) likely plays a key role in the progression of gastrointestinal cancers and may be a useful molecular marker. PRDM5 caused G2/M arrest and apoptosis upon infection of tumor cells. These results suggest that inactivation of PRDM5 may play a role in carcinogenesis. CMTM8 Functions: Chr: 3p22.3; kb, 4 Exon(s) ; (NM_178868) belongs to the chemokine-like factor gene superfamily, a novel family that is similar to the chemokine and the transmembrane 4 superfamilies. It is widely expressed in many tissues. The exact function of the encoded protein is unknown. Cell proliferation and expression of EGFR of tumor cells can be inhibited by transfection of CMTM8m. 11

12 Normal Tumor VCL (vinculin) VCL gene 378 bp bp Sequence Analysis 12

13 LRRFIP2 (leucine-rich repeat in Flightless interaction protein 2) RT-PCR: Amplicon size (bp) Exon 6 size (bp) Primer Sequence:5-3 Normal Tumor LRRFIP2 gene 167 bp bp

14 PRDM5 RT-PCR: Amplicon size (bp) Exon 14 size (bp) Primer Sequence; 5-3 Normal Tumor PRDM5 gene 231 bp bp

15 CMTM8 RT-PCR: Amplicon size (bp) Exon 2 size (bp) Primer Sequence: 5-3 Normal Tumor CMTM8 gene 298 bp bp

16 CONCLUSIONI il numero totale delle varianti di splicing rilevato tra i campioni normali e tumorali era paragonabile a quanto già riportato in letteratura 1-2 la percentuale di validazione (24%) è coerente con altri studi, ma ipotizziamo che potrebbe aumentare mediante l uso di tecniche più sensibili come qrt-pcr; i geni validati hanno mostrato un chiaro AS differenziale nel tessuto colico: due nel normale (VCL, LRRFIP2) e due nel tumorale (CMTM8, PRDM5); tra questi quattro eventi, due sono stati già identificati, mediante lo stesso approccio metodologico su differenti coorti di pazienti, da altri gruppi 1-2, due non sono mai stati descritti nel tumore del colon; Trascritti alternativi cancro-specifici possono essere potenzialmente utilizzati come biomarker diagnostici, prognostici e predittivi così come bersagli terapeutici; farmacogenomica Referenze: 1. Xi et al, 2008;. 2. Thorsen et al, 2008.] 16

17 RINGRAZIAMENTI Dipartmento e Laboratorio di Gastroenterologia Andriulli Angelo, Biscaglia Giuseppe, Piepoli Ada, Panza Anna, Gentile Annamaria, Laboratorio di Genetica Medica Palumbo Orazio, Carella Massimo Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare 'E. Quagliariello' Università degli Studi di Bari Picardi Ernesto, Pesole Graziano