Dati di Validazione ring-test Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

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1 Dati di Validazione ring-test Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Febbraio

2 1 Metodi I metodi scelti per la validazione dei protocolli sono i seguenti: Tipo di saggio Metodi validati Componente biologica riconosciuta preliminare preliminare e identificazione preliminare e identificazione Crescita sui substrati YPGA, Dhavanthari, mscm Morfologia Immunofluorescenza (IF) Epitopi o determinanti antigenici PCR Pastrick and Rainey (1999); Dreier et al. (1995 Acido nucleico (DNA) Si riportano di seguito le metodi scelte per il protocollo utilizzato per l'esecuzione del ring-test: procedure (A) e (B) (A) Tipo di saggio preliminare preliminare e identificazione Metodi validati Componente biologica riconosciuta Crescita sui substrati SCM e CMM1 Morfologia PCR (Pastrick and Rainey (1999); Dreier et al. (1995) Acido nucleico (DNA) (B) Tipo di saggio preliminare delle colonie preliminare e identificazione preliminare e identificazione Metodi validati Componente biologica riconosciuta Crescita sui substrati SCM e CMM1 di colonie da biosaggio Morfologia Immunofluorescenza (IF) Epitopi o determinanti antigenici PCR Pastrick and Rainey (1999); Dreier et al. (1995) Acido nucleico (DNA) Saggi biologici Sviluppo di sintomi specifici 2

3 2 Campioni per la validazione 2.1 Campioni utilizzati per l'attività di validazione del GdL I campioni analizzati consistono in colture pure di batteri target, colture pure di batteri non target, estratti di seme di pomodoro contaminati sperimentalmente con sospensioni batteriche a concentrazione nota e non contaminati (sani), campioni di 2000 semi contaminati con 1,3,5,10 semi infettati con un ceppo di Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (PVCT ). - A. 12 isolati target (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) provenienti da diversi areali geografici: target Provenienza/ospite NCPPB 2979 T Ungheria Pomodoro 1977 NCPPB ISPaVe 1045 Sicilia Pomodoro --- ISPaVe NCPPB 382 UK Pomodoro 1956 NCPPB PVCT Italia (Rg) Pomodoro 2005 DISTEF PVCT Italia (Rg) Pomodoro 2006 DISTEF PVCT Italia (Rg) Pomodoro 2007 DISTEF PVCT Italia (Rg) Pomodoro 2007 DISTEF PVCT Italia (Rg) Pomodoro 2008 DISTEF PVCT Emilia Romagna Pomodoro 2004 A. Calzolari PVCT 342 Emilia Romagna Pomodoro 1992 A. Calzolari PVCT Italia (Rg) Pomodoro 2006 DISTEF PVCT 07265N1 Battipaglia(Sa) Pomodoro n.r. L. Sigillo - B. 11 isolati non target rappresentati da isolati batterici appartenenti a differenti generi: non target C. michiganensis subsp. nebraskenis C. michiganensis subsp. tessellarius C. michiganensis subsp. sepedonicus 3 Provenienza NCPPB2581 T Stati Uniti Zea mays 1974 NCPPB NCPPB3664 T NCPPB 2140 Stati Uniti Repubblica Ceca Triticum aestivum 1990 NCPPB Patata 1968 NCPPB Pseudomonas corrugata CFBP5454 Italia Pomodoro 1991 DISTEF P. mediterranea CFBP5447 Italia Pomodoro 1991 DISTEF P. syringae pv tomato PVCT Italia Pomodoro DISTEF Ralstonia solanacearum NCPPB 325 Stati Uniti Pomodoro 1953 NCPPB Non identificato Italia Semi pomodoro 2008 DISTEF Non identificato Italia Semi pomodoro 2008 DISTEF Non identificato Italia Semi pomodoro 2008 DISTEF Non identificato Italia Semi pomodoro 2008 DISTEF

4 - C. 25 campioni costituiti da estratti di semi di pomodoro o semi di pomodoro contaminati sperimentalmente: Quantità Matrice Tipologia del campione 15 Estratto di seme di pomodoro 4 Semi di pomodoro 6 Estratto di di seme di pomodoro Inoculati sperimentalmente, da 10 7 a 10 2 ufc/ml Quattro campioni da 2000 semi rispettivamente contaminati con 1, 3, 5, 10 semi infetti Non contaminati ( sani ) 2.2 Campioni utilizzati per il ring-test Procedura A - 11 campioni costituiti da 5000 semi contaminati rispettivamente con 1,3,5, semi come indicato in tabella Campione n. Tipologia del campione 1 5: : :5000 (controllo positivo) semi (non infetti = sano) 5 5: : semi (non infetti = sano) semi contaminati con Pseudomonas corrugata (5:5000) 9 1: semi contaminati con Pseudomonas corrugata (5:5000) 11 3:5000 4

5 Procedura B - 11 campioni costituiti da 2000 semi contaminati rispettivamente con 1, 2, 3 semi come indicato in tabella Campione n. Tipologia del campione 1 3: semi (non infetti = sano) 3 2: :2000 (controllo positivo) 5 2: : : semi contaminati con Pseudomonas corrugata 8 (5:2000) 9 3: semi (non infetti = sano)) semi contaminati con Pseudomonas corrugata (5:2000) 3 Valori di validazione attività GdL 3.1 Isolamento in coltura pura di colonie su substrati nutritivi / selettivi agarizzati Isolamento in coltura pura di Cmm da estratto di semi di pomodoro: Valori % YPGA Dhavanthari mscm Sensibilità diagnostica 74, Accuratezza Metodo sierologico IFAS IFAS da isolati batterici target e non target (paragrafo , tabelle A e B) Valori % IFAS Inclusività 100 Esclusività 82 5

6 IFAS da estratto di semi contaminati sperimentalmente (paragrafo , tabella C) come saggio preliminare: Valori % IFAS Sensibilità diagnostica 74 Specificità diagnostica 100 Accuratezza 80 I valori per la validazione sono stati ottenuti utilizzando: Kit per immunofluorescenza: Neogen Phytodiagnostics ( ) Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Fluoriscan IF Kit; Vetrini per immunofluorescenza: vetrini multipli per microscopio, diametro pozzetti 6 mm Menzel-Gläser Diagnostica e Thermo Scientific cod. X1XER308B#MNZ; vetrini copri oggetto 24 x 60 mm Prestigi di Vemi S.r.l.; Microscopio a fluorescenza: Zeiss, Axioskop 2 plus - HAL 100 e Nikon Eclipse 80i. 3.3 Metodo molecolare PCR (Pastrick and Rainey,1999; Dreier et al.,1995) PCR da isolati batterici target e non target (paragrafo , tabelle A e B) Valori % Pastrick and Rainey, Pastrick and Rainey, ** Dreier et al.,1995 Inclusività Esclusività ,5 * *Utilizzo nella reazione di PCR di una DNA polymerase tipologia 'hot-start' (Immolase TM Hot Start DNA Polymerase) PCR da estratti di semi contaminati sperimentalmente (paragrafo , tabella C) come saggio preliminare Valori % Pastrick and Rainey, 1999 Dreier et al.,1995 Sensibilità diagnostica 56 46,5 Specificità diagnostica Accuratezza I valori per la validazione sono stati ottenuti utilizzando: Kit per estrazione del DNA: DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN (Cat. No ); Kit per amplificazione del DNA: GoTaq Flexi DNA Polymerase kit, Promega (Cat.No. M8305), comprensivo di buffer, MgCl 2 e Taq DNA polimerasi; * Polimerasi di tipologia 'hot start': Immolase TM DNA polymerasi (Bioline) 6

7 dntps: dntp Mix Promega (Cat. No. U1515); Termociclatore: Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems e Gene Amp PCR System Soglia di sensibilità analitica Il calcolo della sensibilità analitica è stato effettuato a partire da un estratto di semi di pomodoro contaminato con concentrazioni calibrate del patogeno a partire da 10 7 ufc/ml a 10 0 ufc/ml in tre ripetizioni e da campioni di 2000 semi contaminati rispettivamente con 1, 3, 5, 10 semi infetti. I valori soglia (espressi in ufc/ml) di sensibilità assoluta vengono di seguito riportati per ciascun metodo. ufc/ml Valore soglia Isolamento su YPGA :2000 Isolamento su Dhavanthari :2000 Isolamento su mscm :2000 ufc/ml Valore soglia IF :2000 PCR Pastrick and Rainey, :2000 PCR Dreier et al., :2000 Non è stato calcolato il valore soglia di sensibilità analitica applicando la PCR Pastrick and Rainey, 1999 con l'enzima ; Immolase TM DNA polymerase (Bioline) Specificità analitica La specificità analitica è stata valutata a partire dalla collezione di ceppi batterici target e non target (paragrafo 3.2.1, tabelle A e B) tenendo conto dei risultati falsi positivi. L IFAS ha prodotto due risultati debolmente positivi con i seguenti ceppi batterici 'non-target': NCPPB 2581 NCPPB 2140 C. m. subsp. nebraskensis C. m. subsp. sepedonicus e tre risultati debolmente positivi con il seguente ceppo batterico non target : NCPPB 3664 C. m. subsp.. tesselarius 7

8 La PCR Pastrick and Rainey (1999) ha prodotto un risultato falso positivo con i seguenti ceppi batterici non target : NCPPB 2581 NCPPB 2140 NCPPB 3664 PVCT C. m. subsp. nebraskensis C. m. subsp. sepedonicus C. m. subsp. tesselarius Contaminante Tuttavia, la PCR Pastrick and Rainey (1999) con l'utilizzo dell'enzima Immolase TM DNA Polymerase, di tipologia 'hot-start', non ha prodotto risultati falsi negativi o falsi positivi. La PCR secondo Dreier et al. (1995) ha prodotto un risultato falso positivo con i seguenti ceppi batterici non target : NCPPB 2581 C. m. subsp. nebraskensis ha prodotto un risultato falso positivo con i seguenti ceppi batterici non target : 4 Valori di validazione procedura A 4.1 Isolamento in coltura pura di colonie su substrati selettivi agarizzati CMM1 e SCM L'isolamento in coltura pura di Cmm dall'estratto ottenuto dai campioni di 5000 semi riportati nel paragrafo (procedura A) sui terreni CMM1 e SCM non ha permesso l'individuazione di colonie Cmm-like, con esito pertantonegativo per tutti i laboratori partecipanti al ring-test. 4.2 Metodo molecolare PCR (Pastrick and Rainey,1999; Dreier et al.,1995) PCR da estratto di 5000 semi contaminati sperimentalmente (paragrafo , tabella procedura A) come saggio preliminare Valori % Pastrick and Pastrick and Dreier et al.,1995 Rainey, 1999 Rainey, 1999** Sensibilità diagnostica Specificità diagnostica Accuratezza relativa Concordanza * *Utilizzo nella reazione di PCR di una DNA polymerase tipologia 'hot-start' (Immolase TM DNA Polymerase) 8

9 5 Valori di validazione procedura B 5.1 Metodo sierologico IFAS IFAS da matrice vegetale come saggio preliminare Valori % IFAS Sensibilità diagnostica 52 Specificità diagnostica 59 Accuratezza 54,5 Concordanza 60 I valori per la validazione sono stati ottenuti utilizzando: Kit per immunofluorescenza: Neogen Phytodiagnostics ( ) Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Fluoriscan IF Kit; Vetrini per immunofluorescenza: vetrini multipli per microscopio, diametro pozzetti 6 mm Menzel-Gläser Diagnostica e Thermo Scientific cod. X1XER308B#MNZ; vetrini copri oggetto 24 x 60 mm Prestigi di Vemi S.r.l.; Microscopio a fluorescenza: Zeiss, Axioskop 2 plus - HAL 100 e Nikon Eclipse 80i. 5.2 Metodo molecolare PCR (Pastrick and Rainey,1999; Dreier et al.,1995) PCR da estratto di 5000 semi contaminati sperimentalmente (paragrafo , tabella procedura A) come saggio preliminare Valori % Pastrick and Dreier et al.,1995 Rainey, 1999** Sensibilità diagnostica Specificità diagnostica Accuratezza relativa Concordanza * *Utilizzo nella reazione di PCR di una DNA Taq polymerase tipologia 'Hot-start' (Immolase TM Hot Start DNA Polymerase) Non sono stati riportati i valori relativi alla PCR-Pastrick and Rainey (1999) con utilizzo di una polimerasi di tipologia diversa dalla 'hot start' in quanto tutti i laboratori hanno conseguito risultati negativi. I risultati ottenuti nei paragrafi 3.3, 4.2, 5.2 evidenziano la necessità di utilizzare una polimerasi 'hot-start' per la reazione di PCR come indicato nel lavoro originale di Pastrick and Rainey (1999). Infatti, l'utilizzo di DNA polimerasi diverse possono portare all'ottenimento di numerosi falsi negativi, come indicato dal bassissimo valore di sensibilità ottenuto e dai valori inferiori di specificità e sensibilità ottenuti con sia con metodo di PCR Dreier et al., 1995 che con Pastrick and Rainey, 1999 in cui sia utilizzato un'enzima che non preveda un passaggio iniziale 'hot-start'. L'uso 9

10 della 'Immolase TM Hot Start DNA Polymerase (Bioline TM ) ha consentito l'individuazione di molti campioni, compresi quelli a dose minima di contaminazione (es. 1:5000); inoltre, anche i valori di specificità analitica sono stati ottimali in quanto tutti gli isolati batterici 'target' sono stati correttamente identificati e i 'non target' non hanno prodotto falsi positivi. Tutti i laboratori hanno invece conseguito risultati negativi (eccetto due campioni da parte di un solo laboratorio) applicando il metodo di Pastrick and Rainey (1999) con una polimerasi di altra tipologia rispetto alla 'hot-start'. Infine, non si garantisce un risultato analogo con l'utilizzo di Taq polimerasi di analoga tipologia, ma di differente marchio commerciale. 5.3 Biosaggio L'inoculazione degli estratti di seme su piantine di pomodoro non ha dato esito positivo ovvero non sono stati visualizzati sintomi dopo 20 giorni dall'inoculazione nè è stato isolato il patogeno sui campioni massali costituiti da porzioni di fusticino della pianta inoculata uniti assieme come unico campione. 10